雌激素受体及孕激素受体测定

雌激素受体及孕激素受体测定

人乳腺癌组织中，有60～70％的组织存在雌激素受体(ER)及／或孕激素受体(PR)，其存在状况与诊断、治疗及判断预后有关。受体阳性者约60％用抗相应受体治疗有效；阴性者亦有10％的有效反应率。测定ER及PR的常用方法包括生物化学及形态学两大类；前者为对受体蛋白作定量测定，后者是观察受体在肿瘤组织，包括细胞内的分布及半定量测定。近年来在测定方面屡有改进，如单克隆技术、高效液相及细胞流式计数测定的应用等,尚未作为常规方法应用。

目前我国开展的生物化学方法有葡聚糖包裹活性炭液吸附法(DCC法)及蔗糖密度梯度超离心法(SDG法)；形态学方面有17-FE 细胞化学法及免疫组织化学法(荧光法及酶联法)。由于各自条件不同，所用测定方法也不相同。为便于对资料进行对比分析，本章介绍这些方法，以便统一标准。

第一节生物化学法

一、葡聚糖包裹活性炭液吸附法(DCC法)

该类方法系通过3H标记的雌激素与受体的特异性竞争结合来检测受体，包括DCC法（葡聚糖包裹活性炭液吸附法，Dextran Coated Charcoal）、SDG法（蔗糖密度梯度超离心法，Sucrose Density Graient Ultracontrifugation）、HPA（羟基磷石灰分析法，Hydroxylapatite）、鱼精蛋白沉淀法、琼脂糖凝胶电泳法（AGE）等，以DCC法和SDG法为经典方法。

(一)测定原理在一定条件下，以氚标记雌二醇([3H]E2)为配体，与受体结合，以葡聚糖包裹活性炭液吸附游离的甾体激素，用液闪法测定与受体结合的标记激素含量，表示受体的量。以激素与受体结合的动力学方法计算受体含量。

(二)测定方法

1．标本处理：乳腺癌标本离体后立即分成两份，一份送病理检查，另份立即放入冰壶，送实验室作受体测定。剪除待测标本中肿瘤周围的各种正常组织及坏死组织后，以生理盐水冲洗，吸干后置液氮罐中保存，待测定。

2．制备上清液：全过程均在0～4℃下进行。

(1)组织粉碎：称湿重后，剪成碎块或用Auto-pulverizer于冰冻下粉碎。

(2)制备匀浆：以Polytzon PT-10-ST匀浆器(或玻璃匀浆器)，用1：10(重量：体积)、pH7.4的TED缓冲液(0.0l mol／L Tris-HCl，0.0015 mol／L EDTA，0.5 mmol／L 二硫苏糖醇DTT)，匀浆3次，每次5秒，间隙15秒。

(3)离心：匀浆液以105，000×g超速离心1小时(或7000×g低温高速离心15分钟)，得上清液备用。

(三)雌激素受体测定

1．方法与步骤

(1)两列试管分别加入一系列不同浓度的[3H]E250 μ1，使反应终浓达0.032，0.063，0.125，0.25，0.5，1.0，2.0 nmol／L共7个浓度，分4组。

(2)第一列试管(共2组)为结合管，分别加入50μ1TED缓冲液，以测定其总结合量；第二列试管(共2组)为对照管，分别加入200倍于[3H]E2浓度的己烯雌酚(DES)溶液，抑制[3H]E2与ER结合，以测定其非特异性结合量。

(3)每管各加入150μ1乳腺癌上清液，每管均设重复管。

(4)各试管均置0～4℃冰箱18～20小时。

(5)每管加500 μl DCC液(含0.25％活性炭，0.025％葡聚糖和含10％甘油的0.0lmol／L Tris-HCl、pH8.0的缓冲液)，将分离游离的[3H]E2、DCC液用电磁搅拌器搅拌，吸取混匀的试管内容物，静置15～30分钟后3000r／min离心10分钟。

(6)取上清液0.5μl 置计数瓶内，加6μl甲苯闪烁液(4g的PPO和0.59的POPOP溶于1000μl甲苯)，2小时后以液体闪烁计数器测定其每分钟计数。

2．结果处理：以各管的总结合量减去相应管内的非特异结合量，即为各管的特异结合量，以Scatchard法作图，便可求出Kd值和受体含量(图10-1，2)。求得ER量为105 fmol／mg蛋白，Kd值为3.4×10-10mol／L，将直线延伸达X轴，其交点即为其结合量。计算时应考虑到机器效率、[3H]E2比活性及衰变等因素。结合量以fmol表示。用Lowry或考马斯亮蓝法测定上清液内蛋白质含量，最终各乳腺癌组织内ER含量以fmol／mg蛋白表示之。

3．DCC单点饱和法测定ER：由于用常规七点DCC法所需组织量多，操作、计算费时，如同时测定ER及PR量，所需标本量更多，易受标本量限制而不能完整测定。单点DCC饱和法比较省时，节约试剂，易被临床接受作为常规测定方法。通常用[3H]E2反应终浓度为5nmol／L即饱和浓度，测定方法同前。一般作4个重复管，即测4管总结合量及4管非特异结合量，总结合量的平均值减去非特异结合管的平均值即得特异结合量。

4．DCC法测定ER的注意事项：DCC法建立较早，已作为常规应用方法，但其技术与设备要求较高，标本量需1克以上，故对测定非切除标本或肿块较小的早期乳腺癌难以满足需要。影响测定结果的因素有以下几方面，应予注意。

(1)受体对温热极不稳定，标本必需新鲜，离体后立即贮于液氮罐或短期存于干冰中，整个过程应低温操作。

(2)受体对酸碱度敏感，于pH7～9时稳定。

(3)脂肪组织易导致假阳性；活性炭浓度过高，吸附过强，易致假阴性，必须严格处理

(4)肿瘤组织中受体分布不均匀，边缘部位含量较中央部位高，故宜混合取材。

(四)孕激素受体测定测定方法、步骤与ER测定相似，以[3H]R5020或[3H]ORG2058为配体。总结合管中加入胞浆液和含有一系列不同浓度的[3H]R5020(终浓度达0.06～4nmol／L)。各管加入10倍浓度的氢化可的松(DHT)，以消除[3H]R5020和糖皮质激素受体(GR)和皮质激素结合球蛋白(CBG)的结合。对照管加入200倍于[3H]R5020浓度的R5020，抑制[3H]R5020与PR的结合，以测其非特异性结合，计算方法与ER相同。如采用DCC单点饱和分析法测定PR，则采用[3H]R5020的终浓度10nmol／L为饱和浓度。

(五)诊断标准ER及PR下限值10fmol／mg蛋白时为受体阳性，小于此值时为ER或PR阴性。

二、蔗糖密度梯度超速离心法（SDG法）

ER或PR复合物在蔗糖密度梯度管中超速离心条件下，因沉降系数不同而分布于固定的区带，利用这种原理定量测定特异性ER复合物和非特异性结合物的量。

操作与计算：取制备好的胞浆与[3H]E2一起保温，另外一份与[3H]E2E2和多于200倍的非标记的竞争物(DES)一起保温，然后加DCC混悬液(Norit A0.75％，Dertron-70 0.075％混悬于TES缓冲液中)，去掉未结合的[3H]E2，3000r／min离心，取上清液200 μ1铺加于已准备好的蔗糖密度液管的液面上(5～20％蔗糖)，用水平转头在4℃下105000×g离心20小时，然后用管底打孔或插管法分段收集30～40管，加闪烁液后在闪烁计数器上读DPM。以收集的管数为横座标，DPM为纵座标绘出两条曲线(总结合与非特异结合)。另外两个梯度管分别铺加两种已知沉降系数的标准蛋白BSA和IgG，同时离心后同样收集，测定其蛋白量作为定S的标志：

第二节形态学方法

一、17-FE细胞化学法

17–FE可进入细胞内或细胞核内与ER结合，然后通过荧光显微镜观察细胞内荧光的强弱与定位，决定该细胞的ER状况。在用荧光显微镜观察的同时，用相差显微镜观察细胞，可排除非癌细胞的干扰。

(一)测定过程本法用细胞悬液标本。取新鲜癌标本，剪碎并。召RPMI细胞培养基1640稀释后，通过双层尼龙滤网，滤液离心，再用1640液调成105～106／m1细胞悬液，然后加入17–FE配体，17–FE应用浓度为2×10-7mol／L。细胞与配体在37℃水浴中保温60分钟，然后用pH7.2的PBS洗两次，弃去上清后即刻滴片计数。本法亦可用针吸液标本测定。

17–FE法测定ER需在落射荧光透射相差双光显微镜下同步观察计数。按细胞分型计数，每例须读两张片，每片计数500个细胞，ER阳性百分比按以下公式计算；

(二)结果分类根据荧光在细胞内的强弱与定位可将细胞分为五类；

A型全细胞均有荧光。

B型仅见细胞核有荧光。

c型仅见胞浆有荧光。

D型仅见核仁有荧光。

E型全细胞均无荧光。

五型细胞中A、B、C型因所含ER量较多，被人为地划分为ER阳性细胞；D、E细胞所含ER量极少或没有，被划为ER阴性细胞。在整个癌细胞群体中，如ER阳性细胞百分比等于或大于10％，该肿瘤则可被认为是ER阳性肿瘤。

此法与DCC法有较高符合率(80％以上)，且可对微量组织进行测定，可用于非切除标本及针吸标本的测定，需特定试剂及荧光显微镜，不宜作为临床常规测定。

二、ER和PR直接荧光组织化学法

(一)试剂所用试剂有三种：(1)17–β–雌二醇、牛血清白蛋白、异硫氰荧光素结合物；(2)11–α–羟基孕酮、半琥珀酸盐、牛血清白蛋白、异硫氰四甲基硷性蕊香红结合物；(3)上述二试剂的结合物。

（二）制备应用恒温冷冻切片机及荧光显微镜。

（三）操作

连续切4张7～10μm厚的组织切片，贴于常温清洁载玻片上，一张作HE染色。其余3张切片放2～5℃冰箱内阴干1 小时。取出切片滴2％牛血清白蛋白PBS，分别用上述三种试剂1～2滴均匀覆盖组织片。平放载玻片于湿盒中。在22～24℃条件下静置2小时，使荧光标记物与细胞内的相应受体充分结合。浸泡于新鲜PBS中30分钟，共2次，除去多余荧光素。加1～2滴1：9 PBS 甘油于玻片上，加盖玻片，置4℃保存，观察。

(四)结果评定荧光显微镜下，ER阳性呈苹果绿荧光，PR阳性呈桔红色荧光。荧光主要位于胞浆内，偶见胞核或核仁阳性细胞。受体阳性强度可分4级，以正常乳腺或增生乳腺导管上皮细胞内所显荧光强度为评定阳性的标准：(1)乳腺癌细胞荧光强度与之相似者为阳性（++)；(2)超过者为(+++)；(3)不及者为弱阳性(+)；(4)不显荧光者为阴性。ER阳性是指(++)和(+++)者。荧光标记的切片与HE染色片中，全片内癌细胞的百分数分为10％，20％，30％……90％各级，作为半定量的计数表明受体阳性细胞的多少。

三免疫组化染色基本方法

免疫组化染色方法主要原理是利用标记抗体和抗原抗体特异性反应，借助不同的染色方法，对细胞或组织内的相应抗原进行定性、定位或定量检测。目前免疫组化以辣根过氧化物酶(HRP)系统和DAB显色最为常用。根据其染色步骤可将免疫组化分为：直接法(酶标法)、间接法、IGS法(免疫金法)、IGSS法(免疫金银法)、SP二步法、PAP法、ABC法(卵白素—生物素—过氧化物酶连结法)、SP法(链霉菌抗生素蛋白—过氧化物酶连结法)等，在临床病理诊断中常用ABC法和SP法。链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶连结法的基本操作步骤如下：

(一)试剂配制

1．0.01mol/L 磷酸盐酸缓冲液(PBS) pH7.2

磷酸二氢钠(NaH2P04·2H20) 9g

磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20) 64.54g

氯化钠160g

蒸馏水2000ml

2．0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(TBS) pH7.6

(1)0.5mol/L Tris-HCl缓冲液pH7.6(储备液)

Tris(三羟甲基氨基甲烷) 60.57g

1mol/L HCl 约420ml

蒸馏水加至1000ml

先以300—500m1蒸馏水溶解Tris，加入HCl后，用HCl（1mo1/L)或NaOH(1 mo1/L)将pH值调至7.6，后加蒸馏水加至1000ml，4℃冰箱保存。

(2)0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(TBS)

取0.5mol/L Tris-HCl缓冲液lOml加入0.9％NaCl 90ml混合，pH应为7.6。

3．3％过氧化氢甲醇液

30％过氧化氢(H202) 10ml

甲醇 90ml

4．显色液DAB- H202液(此操作中戴手套，DAB有致癌作用)

TBS 50ml DAB(3，3’—四盐酸二氨基联苯胺) 25mg

30％H202O.15ml(一滴即可)

先以TBS溶解DAB，完全溶解后过滤，显色前加H202。或用即用型DAB工作液。

(二) S—P免疫组化染色步骤

S-P免疫组化染色试剂盒采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。即用型试剂盒，省时，省力，广谱即用型试剂盒可以大大避免由抗体和检测试剂盒配对不符引起的假阴性反应。染色的主要过程如下：

1．石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4）冲洗三次，每次3分钟（3×3’，下同)。

2．根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复（高温高压或微波抗原修复法）。

3．每张切片加1滴或50ul氧化酶阻断溶液（试剂A)，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10分钟。

4．PBS(PH7.4)冲洗（3×3’）。

5．甩去PBS液后每张切片滴加1滴或50ul的非免疫性动物血清(试剂B)，室温下孵育10分钟。

6．甩去血清后每张切片滴加1滴或50 ul的第一抗体(待测抗原的单抗或多抗)，室温下孵育60分钟或4℃过夜。

7．PBS冲洗3×5’。

8．甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul生物素标记的第二抗体{试剂C)，室温下孵育10分钟。

9．PBS冲洗3×3’。

10．甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul链亲和素—过氧化物酶溶液（试剂D)，室温下孵育10分钟。

11．PBS冲洗3×3分钟。

12．甩去PBS液，每张切片加2滴或100ul新鲜配制的DAB(或即用型DAB工作液)，显微镜下观察3～10分钟。

13．自来水充分水洗，蒸馏水洗5～10秒钟。

14．用淡苏木素复染细胞核，半分钟左右。

15．自来水洗5～10分钟。

16．80％、90％，无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

(三) 结果评定：

阳性反应部位呈棕黄色，细胞核呈淡蓝色。评定阳性的标准同前荧光法。