发酵工程知识点

第一部分：微生物工程原理

1、概论

1.1 发酵工程的概念和特点

1.2 发酵工业的发展简史

1.3 发酵工程的应用

2、生产菌种来源

3、微生物代谢调节和代谢工程

4、优良菌种选育

5、菌种保藏

6、培养基

7、发酵工艺控制

8、参数检测

第二部分：微生物工程下游加工工程

第三部分：微生物工程生产设备

第四部分：微生物工程生产工艺和产品举例

第一章概论

掌握本章知识点：1、发酵及发酵工程的定义；2、发酵工程研究的内容；3、发酵技术的发展阶段及其技术特点；4、发酵产物类型。

1、发酵、发酵工程的概念和特点

1）传统发酵：最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。2）生化和生理学意义的发酵：指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。

巴斯德：发酵是酵母菌在无氧状态下的呼吸过程，即无氧呼吸，是“生物获得能量的一种方式”。

3）工业上：泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程。包括：

厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。

通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。

4）发酵工程：利用微生物的生长代谢活动来生产各种有用生物化学产品的技术过程。

5）发酵工程研究的内容

①一条主线：菌种，培养基，种子扩大培养，发酵过程控制，后处理；

②两个重点：发酵过程优化，发酵过程放大；

③三个层次：反应器水平，细胞水平，分子水平；

④四个目标：高转化，高产量，高效率，低成本；

6）利用发酵工程进行生产的优点：安全生产，可持续发展。

7）发酵过程存在的问题和缺陷：发酵过程会产生副产物；菌种易发生变异和退化；发酵过程的控制相当复杂；原料主要是农副产品，质量和价格波动较大；与化工过程相比，反应器的效率低；发酵废水量大，并含较高的COD和BOD；；生产过程易受杂菌污染的影响。

8）上游工程：菌种培养发酵工程：发酵罐下游工程：产物提纯

2、发酵工业的发展简史

1）古老的发酵工业-1900年前（白酒酿造；面包发酵、奶酪制造；酱油、泡菜）

特点：多菌混合天然发酵

2）早期的发酵工业1900-1940（酒精，乳酸）

1680 荷兰列文虎克观察到微生物。

1857 法国巴斯德证明酒精发酵由活酵母引起，发酵产物是微生物产生的。

1905年诺奖获得者德国人科赫发明固体培养基，得到细菌纯培养物，建立微生物的纯培养技术。

特点：纯培养技术的建立，人为控制发酵的过程，使发酵工业进入到近代化学工业的行列。

3）现代发酵工业1940-（青霉素大量生产，1928年发现，1940年制备）

特点：有氧发酵的液体深层培养技术开发和广泛应用

4）第三代微生物发酵技术1979-（基因工程产品：基因分离、鉴定、克隆等，构建基因工程菌，生产多种活性物质：生长激素、干扰素、胰岛素、表皮生长因子、链激酶等）

现代发酵技术的特点：产品类型多；技术要求高；规模巨大；技术发展速度快，能源开发、环境保护、细菌冶金和石油勘探等。

3、微生物发酵的应用

1）发酵产物类型（5种）：微生物菌体（如生产发酵酵母，农用抗生素的菌体）；微生物代谢产物（初级代谢产物，次级代谢产物）；微生物酶（如纤维素酶，蛋白酶，糖化酶，淀粉酶，脂肪酶等）；微生物转化产物（乙醇转化生产乙酸）；工程菌（细胞）发酵。

2）食品行业（含醇饮料、传统调味品及发酵食品、发酵乳制品、食品添加剂、各种氨基酸、维生素，我国谷氨酸产量世界第一。）

3）抗生素

4）基因工程药物（胰岛素、干扰素、生长激素、白细胞介素、单克隆抗体）

5）微生物发酵在轻工业中的应用

6）微生物发酵在能源的应用（生物能源：甲烷（沼气）、燃料乙醇、藻类生物柴油、生物制氢）

7）农业生产中的应用（生物杀虫剂：苏云金杆菌（伴孢晶体）、球孢白僵菌、阿维菌素等）

8）在环境保护中的应用（工业污水处理，构建超级细菌）

9）冶金工业方面

什么样的微生物是能够用来工业发酵生产“有用”产品的？

如何获得这样的微生物？

氨基酸发酵工业最常用的是谷氨酸棒杆菌，为何不尝试使用其他菌株？

第二章生产菌种

本章知识点：对工业发酵菌种的要求；常见的发酵菌种举例；发酵菌种分离的原理和步骤；含微生物材料的采集和处理方法；生产菌种的筛选方法

1、工业菌种的来源——最初都是来源于自然界

?·能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量、高效地合成产物；

?·产物合成的途径尽可能简单，或者说菌种改造的可操作性强；

?·遗传性状相对稳定；

?·菌种强壮，不易受其它微生物污染；

?·产生菌及其产物无毒（分类上与病原菌无关）。

3、常见的发酵菌种举例/已工业化产品生产菌种介绍（了解，不用背）

1）抗生素生产有关的微生物：抗生素是次级代谢产物，需要产生菌进行复杂的代谢，目前发现的产生菌来源如下：真菌、放线菌、一些产芽孢的细菌、植物或动物

2）氨基酸生产有关的微生物-杆菌

代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。

氨基酸-杆菌（谷氨酸-黄色帮杆菌）

3）酶制剂生产有关的微生物：开发一个新食品酶，都要经过一系列研究的毒理试验。

青霉--青霉素；红霉--红霉素；蛋白酶—枯草杆菌；淀粉酶—枯草杆菌、黄曲霉菌

4）基因工程菌常用的基因表达系统：原核生物、酵母表达系统（疫苗）、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达系统。

问题：如何在自然界寻找新的工业生产菌株？

微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。

4、发酵菌种分离的原理和步骤

1）原则：①选择合适的微生物源；②建立科学的筛选方案(检测系统)。要求：选择性强、灵敏度高。2）步骤：设计方案---采样----富集培养-----纯种分离----筛选-------菌种保藏

①设计方案

?天然材料（土壤等）来源越广泛，含有目的菌的可能性越大，获得新菌种的可能性越高；

?可寻找已适应苛刻环境的微生物类群；例：分解石油的微生物，从炼油厂附近；杀真菌剂中农业土壤分离细菌和放线菌；

?土壤PH和植被情况；偏碱适合细菌、放线菌；偏酸适合真菌；

?更新的生态环境仍有待开发。

②采样

?含微生物材料的采集和处理方法（细一点，还有注意事项）

?土样采集

·森林、旱地，草地：先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集，5-25cm处；

·水田等浸水土壤：在不损土层结构的情况下插入圆筒采集；

·植物根际土样时：是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分为根际土样。

?植物体采集方法

·叶面：用灭菌的剪刀、打孔器等，由新鲜叶片的同一部位切取一小块。选择叶面时应考虑叶位、叶龄和在一片叶上的取样部位。

·采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。

?水样采集方法

·使用灭菌容器；避免表层水；

·方法：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4℃下贮存。

?采样注意事项：

?尽可能保持相对无菌；

?必须完整地标注样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；

?充分考虑采样的季节性和时间因素；

?采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。

③富集培养

富集培养：采用选择性培养基，使目标微生物大量繁殖，成为人工环境下的优势种，而其他微生物的

1 改变培养条件培养温度

培养基PH

加入抗生素放线菌25～30

o

C，嗜热菌45～55

o

C，嗜冷菌4～10

o

C。PH<7霉菌，酵母菌，PH 7-7.5 细菌

2 改变培养基的营养成分加入特殊培养基

（石蜡棒）

（诺卡氏菌）

④纯种/单菌分离

涂布法、划线法

单菌落是指来源于单一孢子或营养细胞或一群相同的细胞在固体培养基表面或内部形成的肉眼可见的集合体。单菌落就是单个微生物形成的菌落。

⑤生产菌种的筛选方法

?

?抗生素产生菌的筛选——根据是否形成抑菌圈可以挑选抗生素产生菌。

?抗肿瘤药物产生菌的筛选（细胞毒性筛选法）

?氨基酸，维生素等生长因子产生菌的筛选（营养缺陷型）

?利用酶催化反应产生产物的性质筛选（颜色，透明圈、pH的变化）

?

经过初筛复筛确定具有一定生产能力的菌株，称为野生型菌株。

?·比如筛选抗生素：用抑菌圈的方法。（透明圈不行）

?·比如高产纤维素：用筛选的方法：用纤维素膜做培养基，看看培养菌种以后会不会出现透明圈。（淀粉不行）

5、微生物菌种鉴定

?16SrDNA鉴定、ITS鉴定（对ITS序列进行DNA测序）

?形态学特征：细胞形态，群体形态；

?生理生化特征：对不同碳源氮源利用能力，对能源、生长因子要求等；代谢产物；与温度、氧的关系；

?生态学特征：生物关系等；

?血清学反应：肠道菌、噬菌体、病毒；

?生活史

第三章菌种保藏的原理和方法

重点：斜面保藏法和穿刺保藏法；冷冻干燥保藏；低温保藏技术(甘油管保藏)；液氮保藏

简述菌种保藏的基本原理；菌种保藏的方法有哪些？比较其原理、对象、保藏期及方法优缺点；

1、简述菌种保藏的基本原理

1）菌种保藏的意义

菌种保藏原理：防止菌种退化，减少、推迟负变，防止死亡，确保不染菌

2）菌种保藏的思路

菌种保藏应达到的效果：菌种存活；不变异或退化

基本原则：低温，寡营养，缺氧，模拟自然条件

2、菌种保藏的方法有哪些？比较其原理、对象、保藏期及方法优缺点；

1）斜面保藏法

将菌种接种在斜面上，待长好后，放入4℃下保藏。不产芽孢的细菌1个月移植一次；产芽孢3个月；酵母菌、霉菌、放线菌3-6个月；优点：简单；缺点：退化。

2）石蜡油封存法

将菌种接种在斜面上，待长好后，在其上覆盖石蜡油（1cm），放入4℃下保藏。1年以内，适合放线菌、细菌、霉菌、酵母等，不适合厌氧菌；优点：简单；缺点：退化

3）穿刺保藏法

将菌种穿刺接种到软琼脂培养基中，待长好后，在其上覆盖石蜡油，放入4℃下保藏。软琼脂培养基的成分和斜面相同，但琼脂的加量为1%，高度2cm，穿刺在其高度一半处。1年以内。优点：简单；缺点：退化

4）真空冷冻干燥保藏法

原理：使活的菌种在干燥、低温、无氧的环境下保藏，其生长代谢活动处于停滞状态，利于长期保藏。

方法：在有保护剂（灭菌脱脂牛奶、灭菌血清）、低温的条件下快速将微生物细胞或孢子冷冻，在减压下使水分升华，干燥后密封，隔绝氧，这样可以长期保存。

优点：保藏时间长（4℃ 10年以上，室温数年），变异率低，可在常温下运输。

缺点：不产孢子的丝状真菌不可用此法。

5）低温保藏法

方法：对数生长后期的细菌、酵母，或培养成熟的孢子，加入15%的甘油或二甲亚砜中（保护剂），放相应的温度下冷冻即可。

优点：多数微生物在-20 ℃低温下可保藏1年以上，在-80 ℃低温下可保藏数年。

6）液氮超低温保藏法

原理：超低温下菌种代谢处于完全停止状态，非常稳定；

方法：①阶段冷却：将菌液加入到灭菌的保护剂（甘油、二甲亚砜）中，阶段冷却，最后在液氮（-196 ℃）中冷冻；②快速解冻：解冻时最好先在38-40 ℃条件下振荡1-2min溶化；

优点：不易退化，可保藏几十年甚至更长；缺点：液氮消耗，价格高

7）载体吸附保藏法

原理：模拟微生物在自然界中存在的环境。

载体：沙土、麸皮、麦粒等

方法：将沙土洗净、烘干后过筛，混匀（沙：土约1~2：1）、分装后灭菌。将菌液加入后真空抽干封口，放干燥器或4 ℃下保藏。

优点：可保藏几年至几十年。

8）悬液保藏法

原理：寡营养保藏。适用于丝状真菌、酵母及肠道细菌。

方法：将菌种放入蒸馏水、生理盐水或磷酸缓冲液中室温下保藏。

优点：保藏时间：一年

举例：*比如说北京有个优质菌种，我要用什么样的方法把它带过来比较合适呢？

考虑时间和便于移动可用：真空冷冻干燥保藏法。

*比如有个菌种需要长时间保存，十年那样子，要用什么方法？

可用：低温保藏法。液氮超低温保藏法。

第四章微生物优良菌种的选育（可结合课上笔记看）

微生物优良生产菌种的特征（工业微生物要求）

自然突变选育

诱变选育：原理，基本方法

杂交育种：细菌放线菌霉菌酵母菌

原生质体融合

基因工程技术

1、★微生物优良生产菌种的特征（即工业生产选用菌种的要求，上面也有）

生产力、稳定性、安全性！

?能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量、高效地合成产物；

?产物合成的途径尽可能简单，或者说菌种改造的可操作性强；

?遗传性状相对稳定；

?不易受其它微生物污染；

?产生菌及其产物无毒（分类上与病原菌无关）。

2、进行菌种选育的目的

野生型菌种无法满足工业生产需求

目的：①提高产量：以过量或者超量生产目的产物

②改变菌种性状以改变发酵过程：可以适应不同的原材料，特别是低价原材料，提高抵抗不良条件的能力等；

③获得新产品：组合生物合成

（注意：什么时候采用什么样的选育方法，即各种方法适用于什么情况）

3、进行菌种选育的方法：自然选育；诱变选育；杂交育种；原生质体融合；基因工程育种

1）★自然选育

①概念：不经人工处理，利用微生物自然突变进行的菌种选育的过程。

②自发突变的原因：多因素低剂量的诱变效应；互变异构效应（DNA 的自发性化学变化）

③自发突变的原因有三个层次：

?细胞外的原因(如紫外线、环境的化学突变剂等)；

?细胞内的原因(代谢产生的突变因子，如亚硝酸、过氧化物等)；

?DNA分子内的原因(碱基的互变异构效应)。

④优点：简单易行，可与生产同步进行。

缺点：变异频率低（10-8—10-9 /次分裂），负变大于正变

⑤回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降

⑥自然选育的应用- -防止菌种衰退的措施：获得自然突变造成的高产菌株；菌种复壮，解决高产菌种的退化问题。

⑦菌种衰退：生产菌株某些生理和形态特征逐渐减退的现象。也指经诱变得来的新菌株发生回复突变，从而丧失新的特征等情况。

菌种衰退原因：菌种保藏不妥；传代次数过多（菌种连续传代是直接原因）

⑧菌种复壮：

狭义的复壮：指的是菌种已经发生衰退后，再通过纯种分离和性能测定等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。

广义的复壮：应该是一种积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，使菌种的生产性能逐步提高。所以，这实际上是一种利用自发突变( 正突变) 从生产中不断进行选种的工作。

2）★诱变选育（一般什么时候用诱变育种，要用多大的诱变剂量，诱变后如何筛选，出题会出营养缺陷型之类的）；课堂笔记较为详细

①概念：利用被称为诱变剂的物理因素或化学试剂处理微生物细胞，提高其基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。

②原理：在诱变剂的作用下会出现染色体畸变（染色体或DNA片段发生缺失、易位、重复等）；基因突变（少数碱基改变）。

③缺点：工业上长期诱变会使菌种生活能力下降，变异的范围小，一个或少数几个基因发生突变，不太可能通过诱变获得新产品

④基本步骤：选择出发菌株--制备菌悬液--诱变剂及剂量的选择--突变菌株的筛选

--制备菌悬液：尽可能均匀，避免因多细胞聚集造成诱变筛选得到的菌落不纯。

--诱变剂及剂量的选择：

?可以选择单一诱变剂，也可以选择复合诱变剂。

?诱变剂选择的原则：提高突变率！兼顾菌种活力！

--诱变剂量的表示方法：

?诱变剂的单位表示：紫外线的强度、化学诱变剂的浓度和处理时间等；

?致死率：致死率60%为最佳选择。

--突变菌株的筛选：（突变菌株有可能造成高产）

?变异菌株的筛选方案（筛选的重点在初筛，因为复筛的工作量小）

初筛：①根据菌落的形态变化筛选

②根据特定产物的合成机理或菌种特性筛选（抗代谢类似物；营养缺陷型；抗生素抗性菌株）

复筛：用与生产条件相似的培养基培养突变株，对突变株的生产能力进行验证。

⑤*营养缺陷型突变株筛选

?基本培养基：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，成为基本培养基，有时用符号“[ －]”来表示。不同微生物的基本培养基是不相同的。

?完全培养基：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或者半天然培养基，为完全培养基，有时用符号“[ + ]”表示。一般可在基本培养基中加入富含氨基酸，维生素和碱基之类的天然物质配制而成。

?营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或者自然突变失去合成某种营养（氨基酸，维生素，核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长，成为营养缺陷型

?筛选方法：影印平板法。完全培养基上长的菌落影印到基本培养基上，不长的为营养缺陷型。

?营养缺陷型有可能造成高产——举例：氯霉素生产

⑥*末端产物结构类似物突变株

?筛选方法：培养基中含有大量末端产物结构类似物；

..抗末端产物结构类似物突变株：在该培养基中仍能自主产生终产物；存活

..未突变菌株：受末端产物结构类似物反馈作用，不能自主生产真正末端产物；死亡

?突变的目的：反馈调节失效，

?本质：调节基因或操纵基因突变，产生的阻遏蛋白与终产物不能结合或结合但不发生作用；

⑦*组成型突变株筛选

?原理：诱导型依赖诱导物。组成型不依赖诱导物

突变发生在调节基因或操纵基因,解除对诱导物的依赖,可获组成型突变株。

?筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过适当方法分辨组成型菌落。

..加诱导酶合成抑制物

如：大肠杆菌加邻硝基-β-D-岩藻糖苷，抑制β半乳糖苷酶合成。

诱导型不能利用乳糖，不长；组成型产酶，能利用乳糖，生长被富集。

..交替培养法

含诱导物（乳糖）中培养—组成型快—不含诱导物（葡萄糖）中培养—诱导型失酶—反复。

⑧*抗（敏感）性突变株筛选

包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体

..抗生素抗性突变：提高产量；

..抗噬菌体突变：消除噬菌体污染

..条件抗性：温度敏感性突变株；

3）★杂交育种

①概念：借助有性重组，使不同菌株的遗传物质得以交换，获得优良性状集中的重组体。

②优点：变异的范围大，可能导致大范围遗传物质的改变，有可能通过杂交获得新产品。

（诱变育种：工业上长期诱变会使菌种生活能力下降，变异的范围小，一个或少数几个基因发生突变，不太可能通过诱变获得新产品）

③细菌/放线菌的杂交育种

?转化（transformation）：某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表现型发生相应变化的现象；

?转导（transduction）：由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程；

?接合：通过性菌毛互相沟通,将遗传物质(主要是质粒DNA)从供体菌转移给受体菌。

④杂交方法——混合培养法：两亲株是互补营养缺陷型，两亲株混合，接种到CM斜面上，孢子形成后制成单孢子悬浮液，然后在SM平板上分离，长出菌落即包含重组体。

⑤霉菌杂交技术

?异核体的形成：基本培养基上，两个互补的营养缺陷型强迫进行营养互补。

?双倍体检出：可从扇面上挑孢子分离。

?分离子检出：杂合二倍体单孢子平板分离，再纯化鉴别。

⑥酵母菌的杂交育种（首先获得单倍体细胞）

双单特性：存在单倍体和二倍体的生活史，二倍体生活力强，生产能力高。可通过杂交得二倍体来育种。

三种杂交方式：孢子与孢子交配；孢子与单倍体细交配；单倍体细胞间交配。

4）★原生质体融合

?原生质体融合：在高渗的条件下把两个亲本的细胞壁通过酶解瓦解，得到原生质体，并在助融合剂（如PEG，Ca，Mg离子）或电击的作用下使两个亲本的原生质体发生融合的过程。

?原生质体：在高渗溶液中除去细胞壁的细胞。

?优点：没有供体和受体之分；打破了微生物的种界界限，可实现远缘菌株的基因重组；重组频率高；遗传物质的传递更加充分。

?去除细胞壁的方法：革兰氏阳性菌和放线菌：肽聚糖——溶菌酶

革兰氏阴性菌：肽聚糖和脂多糖——溶菌酶+EDTA

霉菌：纤维素和几丁质：纤维素酶活真菌中分离的溶壁酶

酵母菌：葡聚糖和几丁质：蜗牛酶

5）基因工程育种

①特点：精确的定向育种，技术含量高，应用面广。

②应用：生物制药领域。1982年第一个基因工程产品-重组人胰岛素

③基因表达系统：原核表达系统；真核表达系统；哺乳动物细胞系统

④基因工程菌的稳定性

?分裂不稳定：分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌；

?结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失。

?影响因素：（常见是分裂不稳定）①产不含质粒的子代菌的频率；②两种菌的比生长速率。

?提高质粒稳定性的方法：①两段培养法：先长菌，后表达，使比生长速率差别减小；②控制培养条件：比如加入抗性。

第五章代谢调节和代谢工程

掌握酶活性调节及其作用机理、酶合成调节及作用机理；反馈抑制、反馈阻遏、分解代谢物阻遏的概念；代谢调控的理论和应用

本章知识结构：

微生物的代谢调节类型和自我调节部位

★诱导酶和组成酶

★酶活性调节和反馈抑制

★分解代谢物阻遏

★反馈阻遏

★利用微生物代谢调节提高发酵效率的手段

微生物其他调节

代谢工程

一、微生物的代谢调节及其生物学意义

1、微生物代谢调节：微生物有着一整套可塑性极强和极精确的代谢调节（regulation of metabolism）系统，确保上千种酶能准确无误、有条不紊和高度协调地进行极其复杂的新陈代谢反应。

2、微生物代谢调节的生物学意义：

①维持细胞的均衡生长，有目的、按一定的比例合成代谢产物以及中间代谢产物。

②合理地利用资源

③完成细胞分化

3、利用代谢调节实现过量生产的目的！

方法：①育种，得到根本改变代谢的基因突变株；

克服反馈抑制、反馈阻遏、克服分解代谢物阻遏、克服酶的诱导调节

②控制微生物培养条件，影响其代谢过程。

二、微生物的代谢调节类型和自我调节部位

1、代谢类型：分解代谢和合成代谢。

?分解代谢：分解营养物质，为细胞活动提供能源和合成代谢的中间体。

?合成代谢：利用分解代谢产生的能量和中间体合成氨基酸、核苷酸等单体物质，及蛋白、糖、核酸等多聚物。

2、能荷调节：细胞通过改变A TP，ADP，AMP三者比例来调节其代谢活动。

能荷高时，ATP的酶合成系统受抑制，A TP消耗酶系统被活化。进而调节分解代谢与合成代谢的速率。3、酶活性的调节：使酶的活性增高或者降低的作用称为酶的激活或者抑制作用；（调节快）

这些物质称为酶的激活或者抑制剂。

酶活性调节是如何实现的（作用机制）：变构调节理论（有些酶除了活性中心外，还有调节部位，当特异性分子结合到这些部位时（非共价），可改变酶的构象，进而改变酶的活性，酶的这种调节作用称为变构调节）；化学修饰调节理论（与某一物质共价结合，导致其化学组成发生变化，活性提高或降低）催化部位（catalytic site）：分子中与底物分子相结合的部位

4、酶合成的调节：能使酶的合成速率提高或者降低的调节作用叫诱导作用和阻遏作用。（调节慢）

调节机制：操纵子模型：调节基因、操纵基因、启动基因和结构基因

酶合成调节的机制：（根据操纵子调节方式不同）

①单一效应物调节：酶合成的诱导和阻遏作用通过某一种效应物与调节蛋白形成复合物，导致调节蛋白构型变化，从而影响与操纵基因的结合，进而影响蛋白的合成

②两种效应物的共同调节

③弱化调节（研究色氨酸合成时发现的）：翻译未到终点之前部分停止。

正调节（激活转录）和负调节（抑制转录）：与调节基因R的产物有关

5、生物体内的酶可分为两类：★诱导酶和组成酶

①组成酶：细胞内总是适量存在的，不依赖于酶底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。

②诱导酶：依赖于酶底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。其基因以隐性状态存在于染色体中。

-- 能够诱导某种酶合成的物质称为诱导剂。

酶定量分析法：区分组成酶和诱导酶的方法

如：大肠杆菌加入乳糖前，β-半乳糖苷酶的分子数为5个/细胞；加入后的1-2分钟内就增加到5000个/细胞。

三、如何利用代谢调节提高产量

1、概述

★反馈抑制：生物合成途径的最终代谢产物抑制该途径的前面酶的催化活性（往往是代谢途径中的第一个酶）。

★反馈阻遏：生物合成途径中某种代谢产物积累到一定浓度时，可以反馈阻遏催化该产物生物合成相关酶的继续合成，进而降低产物的合成速率。

★分解代谢物阻遏：微生物与可以优先利用的碳源或氮源相接触，使很多其他途径的分解反应途径受到阻遏。

葡萄糖效应：研究混合碳源对微生物生长的影响时发现

★利用微生物代谢调节提高发酵效率的手段

2、克服反馈抑制和反馈阻遏的调控

反馈抑制和反馈阻遏使微生物不能大量积累产物；如何

克服？

（1）选育营养缺陷性突变株；

（2）选育抗类似物突变株；

（3）选育细胞膜通透性突变株

3、克服分解代谢阻遏的调控

（1）避免使用有阻遏作用的碳源或者氮源；

（2）流加碳源或者氮源；必须用具有分解代谢物阻遏作

用的糖时，采用过程补糖，减少分解代谢物阻遏作用

（3）采用抗分解代谢物突变株，筛选方法：以酶受阻遏

的底物为唯一碳源，能生长的菌株为抗分解代谢物突变株

四、★分支途径的反馈调节

1.同功酶调节：催化相同反应，但酶分子结构有差异，受不同终产物调节；

2.协同反馈调节：一个也不能少；

3.累加反馈调节：按比例累加，无协同效应，无拮抗作用；

4.增效反馈调节：1+1＞2；

5.顺序反馈调节：按①→②→③顺序逐步抑制；

6.联合激活或抑制调节：不同代谢途径，同一中间产物

五、★·微生物其他调节

代谢调控：根据代谢调节理论，通过改变发酵工艺条件(温度、pH、通气量、培养基组成)和菌种遗传特性，达到改变菌体内的代谢平衡，过量产生所需产物的目的。

发酵条件的控制：

①培养基成分和浓度的控制

速效碳、氮源可能引起分解代谢阻遏。应与迟效碳、氮源适量搭配。

②通气，温度，PH等各种发酵条件对微生物的影响

③使用诱导物-----------可用底物或底物类似物有效增加诱导酶的产量。

④添加生物合成的前体----------加前体，避开受抑制酶，大量合成终产物。

六、★代谢工程

1、代谢工程：利用基因工程技术构建新的代谢途径。

2、代谢网络理论：将细胞的生化反应以网络整体来考虑，而不是孤立地来考虑。将代谢网络分流处的代谢产物称为节点，对终产物合成起决定作用的少数节点称主节点。根据节点的可变程度，分为柔性、半柔性和刚性三类。（改造蛋白质、做代谢调节等一般改造柔性部分）

3、手段

1）改变代谢途径

2）扩展代谢途径-----代谢途径向前或者向后延伸

3）转移或构建新的代谢途径-----异源表达

第六章培养基及其制备

掌握发酵培养基的分类方法，淀粉水解糖的制备方法和优缺点

本章知识结构：

★培养基的成分

★不同碳、氮源的利用速度

营养物质的调节方法

★碳氮比例的调节

培养基的类型

培养基的设计与优化

一、★培养基的成分（填空题）

1、培养基：人工配制的，适合微生物生长繁殖或者产生代谢产物的营养物质。

组成：1）能源物质，碳源、氮源物质，无机盐，微量元素和生长因子，水

2）发酵调节剂（前体物质、促进剂和抑制剂）

2、能源物质

工业菌种绝大多数为化能异养型；异养微生物的能源物质：碳源及部分氮源

3、碳源物质

1）凡能提供微生物营养所需碳素的物质即为碳源

2）淀粉水解糖的制备

工业上用DE值（也称葡萄糖值）表示淀粉糖的糖组成。糖化液中的还原糖含量（以葡萄糖计算）占干物质的百分率。

淀粉水解糖的制备：酸解法、酶解法、酶酸结合法

4、氮源物质：能够提供微生物生长繁殖及产物合成所需氮素的营养物质即为氮源；提供菌体结构物质，能源（少），含氮代谢产物，补充碳源。

?生理酸性物质：代谢后使培养基酸性增强的营养成分叫生理酸性物质（比如碳源、脂肪酸、铵盐）。

?生理碱性物质：反之叫生理碱性物质（如有机氮源、硝酸盐）。

?（可能是选择题，选择生理碱性物质或生理酸性物质）

5、无机盐及微量元素（使用注意点）

6、生长因子

7、前体物质(Precursor)

1）概念：最终所需的代谢产物的前身或其结构中的一部分，在生物合成中直接结合到产物分子中，自身结构变化不大，能显著提高产量的小分子物质。

抗生素前体物质

青霉素Ｇ苯乙酸（或在发酵中生成苯乙酸的物质）

链霉素肌醇、精氨酸、甲硫氨酸

红霉素丙酸、丙醇、丙酸盐、乙酸盐

2）影响前体物质的因素：菌种的特性；前体物质的投入量；前体物质的毒性（减少前体毒性，采用流加方法。）

8、促进剂和抑制剂

促进剂（刺激剂）并非前体或营养物，可影响正常代谢或中间代谢物积累、或提高次级代谢物的产量的一类刺激因子。常见的有表面活性剂Surfactant（洗涤剂、吐温80、EDTA、植酸等）、大豆油提炼物、甲醇等

抑制剂的作用原理：通过抑制某些合成其它产物的途径而使所需产物的合成得到加强。

9、水10、消沫剂：植物、动物油脂（豆油、玉米油、猪油）、化学合成的高分子化合物

工业中利用消沫剂消除发酵中产生的泡沫，防止逃液和染菌

二、培养基的分类

?按成分分类

1、天然培养基：这是一种利用动、植物或微生

物体或其提取物制成的培养基，人们无法确切

知道其中成分。

2、合成培养基：是由化学成分完全了解的物质

配制的培养基，也称化学限定培养基

?按目的分类

3、选择性培养基：就是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基

1)加富性选择培养基：

用作加富的营养物主要是一些特殊的碳源或氮源，如甘露醇、纤维素、石蜡油、糖液等。

2)抑制性选择培养基：

选择性抑制剂有染料、抗生素、脱氧胆酸钠、叠氮化钠等。用于选择性的其他理化因素还有温度、氧、pH和渗透压等

4、鉴别性培养基：培养基中加有能与某一菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便的从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。（伊红美蓝乳糖培养基，即EMB 培养基）?培养基的设计与优化

①查阅文献：根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；

②通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；

③当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。如：正交法、均匀分布法、响应面法。

三、★营养物质的调节

1、★不同碳、氮源的利用速度

1）不同菌能利用的碳源不同，同一菌种对不同碳源利用速度不同。快者为速效碳源，慢者为迟效碳源。

一般情况：单糖比双糖快；双糖比多糖快；纯多糖比杂多糖快。

搭配使用：控制浓度，生长期利用速效碳源，产物合成期利用迟效碳源。

2、氮源利用及与碳源利用的关系

1）简单的无机氮源和氨基酸为速效氮源，复杂的有机氮源为迟效氮源。

2）氨及铵盐等氮源的利用速度常随碳源的利用速度而变。糖代谢中间产物是氨基酸的前体。

3）氮源：搭配：与碳源类似

3、★碳氮比例的调节

碳氮比能直接影响微生物的生长和发酵产品的积累。碳氮比严格讲指元素比，但通常指原料比。

一般情况：产物不含氮，细菌，100:0.2-2.0；酵母菌，100:20；霉菌，100:10。

产物含氮，碳氮比较高。如：谷氨酸生产，100:15-21。

4、前体的控制

一般前体越多，增产越多；但大多毒性也增大

5、补料

生产上多用丰富培养基提高产量

能解决的问题：菌体早衰；料粘，搅拌能耗高，消泡难，溶氧降低，渗透压高。

第七章灭菌

掌握灭菌方程、湿热灭菌时间的计算；高温短时灭菌的原理

本章小结

1）五种主要的灭菌方法；

2）灭菌方程、分批灭菌的操作及灭菌时间的计算、空气的过滤除菌方法；

3）连续灭菌原理与步骤。

?为了保障纯培养，必须做到：

..使用的培养基和设备必须灭菌；

..空气要过滤除菌；

..设备严密，发酵罐为维持高于环境的压力；

..培养过程中加入的物料(补料)应经过灭菌；

..使用无污染的种子。

?灭菌（sterilization）：是指利用物理或化学的方法杀死或除去物料及设备中所有的微生物，包括营养细胞，细菌芽孢和孢子。

一、★五种主要的灭菌方法

1、化学试剂灭菌法：甲醛、氯气或次氯酸钠、高锰酸钾、环氧乙烷、乙醇以及抗生素等

2、射线灭菌法：紫外线；X射线；放射线(Co60照射)；高能电磁波。适用无菌室、接种箱

3、干热灭菌法：160℃下1h。主要用于器皿灭菌，因可长期烘烤而不怕破坏。

4、湿热灭菌法：121 ℃下(0.1Mpa表压)20-30min。适用于生产设备及培养基灭菌

5、过滤除菌法：制备无菌空气

6、火焰灭菌法：接种针、玻璃棒、三角瓶口

二、湿热灭菌的原理

1、热阻：微生物对高温的抵抗能力为微生物的热阻。

表示方法：微生物在某一温度下的致死时间。

一般微生物60℃，10min可杀死；耐热的芽孢100℃，数分钟至数小时才能杀死；少数嗜热菌120℃，20-30min才死。

相对热阻：某一微生物在某一条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。

三、微生物的死亡速率与理论灭菌时间

D值：使微生物数量降低为原来的十分之一需要的时间。D=2.303/k

例1：某发酵罐，内装培养基40m3，在121℃下进行分批灭菌。设每毫升培养基中含耐热的芽孢为1 107个，在只考虑保温阶段的灭菌效果的前提下，求理论灭菌时间？

如何减少培养基的破坏：提高灭菌温度，缩短灭菌时间。设备的限制，需要选取一个合适的温度。分批灭菌：121℃；连续灭菌135 ℃。

三、★分批灭菌的操作、连续灭菌

1、分批(间歇)灭菌（实罐灭菌）：将配制好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将其和所用设备一起灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。

2、★连续灭菌原理与步骤。

1）连续灭菌过程：将培养基在发酵罐外通过连续灭菌装置进行加热、保温和冷却而进行灭菌。

步骤（看图组织语言）：配料罐，泵，加热塔，维持罐，冷却管，发酵罐

预热（不易沉淀，噪声小）加热、保温和冷却

2）优点：①升温速度快，灭菌温度高，灭菌时间短，对培养基的破坏小；②降温速度快；③蒸汽的用量省。

3）注意事项：发酵罐应预先进行空罐灭菌。加热器、维持罐及冷却器也应先行灭菌。

3、间歇灭菌与连续灭菌的比较

4、补充

1）加热：加热器也称连消塔，使培养基与蒸汽混合并迅速达到灭菌温度(20—30 s)。分有塔式和喷射式加热器两种

2）保温是将培养基维持灭菌温度一段时间，是杀灭微生物的主要过程

3）降温：为避免营养成分的破坏，培养基需要迅速降温至接近培养温度(40～45℃) 国内大多采用喷淋冷却器。

四、空气除菌的方法

1、发酵中大量空气灭菌和除菌的常用方法：加热除菌，电除尘，介质过滤除菌

2、加热灭菌：即将空气加热至一定温度并维持一定时间，以杀灭空气中的微生物。

装置：主要包括采风塔、粗过滤器、空气压缩机、空气贮罐、冷却器、空气加热设备等

3、★过滤除菌

1）空气的预处理

①压缩空气的冷却：空气在被压缩的时候温度会升高

②空气的除水除油：防止影响空气过滤介质；防止油滴进入发酵液而影响发酵。

2）空气的过滤除菌：压缩空气→过滤介质→无菌空气

分离器：①气液分离器：空气的除水除油；②旋风分离器：离心力沉降；③填料式分离器：惯性截留（活性炭，金属丝网）

过滤介质：①绝对过滤介质：孔隙小于微生物大小，如用聚四氟乙烯或者纤维素酯材料做成的微孔滤膜（孔径0.22μm)；②深层过滤介质：孔隙大于微生物大小，但介质层有一定的厚度，机理是静电、扩散、惯性及拦截作用。

4、电除尘：电晕现象----电离出空气离子--在向正、负极运动过程中使遇到的固体及液体微粒也带上电荷而分别向两极运动。且沉降在电极上的微粒要定期清除，以免降低绝缘性能和除雾效果

5、发酵废气废物的安全处理:1) 冷凝器回流部分发酵液；2)尾气碱液处理后排放。

第八章发酵罐的比拟放大（重要）

本章内容

§1 发酵罐的结构

?发酵罐的基本概念

?发展过程

?发酵设备的类型

?机械搅拌发酵罐

?其他类型的发酵罐

§2 发酵罐的比拟放大

§1 发酵罐的结构

一、发酵罐的基本概念

广义的发酵罐是指为一个特定生物化学过程的操作提供良好而满意的环境的容器。工业发酵中一般指进行微生物深层培养的设备。

二、发展历程

三、类型

四、 机械搅拌发酵罐（通用发酵罐）

3、发酵罐容积计算

罐的全容积：罐身容积和上下两个底封头容积的和：V=?πD 2H 0+0.3D 3 罐的公称容积：罐身容积与一个底封头容积的和 V 0=?πD 2H 0+0.15D 3

4、发酵罐结构

了解发酵罐的各部分，比如大型发酵罐是否需要挡板？不需要。

① 罐体：密闭式，要保持一定的罐压。圆柱形，两端椭圆形，受力均匀，减少死角，物料容易排除。高度与直径比（1.7-4）：1

② 罐体表面各种装置

中大型发酵罐装有供维修、清洗的入孔

罐顶装有窥镜和孔灯，在其内面装有压缩空气或蒸汽吹管 罐顶接管：进料管、补料管、排气管、接种管、压力表接管

罐身接管：冷却水进出管、空气进管、温度计管和测控仪器接口

轴功率：搅拌器以既定的速度旋转时，用以克服介质的阻力所需的功率。它不是电动机的轴功率或耗用功率。P=N p ρn 3d 5

机械搅拌发酵罐中的搅拌器轴功率与下列因素有关：Np 功率准数（6平叶：6；6弯叶：4.7；6箭叶：3.7）、液体密度ρ（kg/m3）、搅拌转速n （r/min ）、搅拌器直径d （m ）

搅拌功率与转速和搅拌桨直径的关系： ④ 档板：克服搅拌器运转时液体产生的涡流，增加溶氧速率

全挡板条件：对于特定的搅拌器（叶轮形式和转速不变），在一定的转速下，在搅拌罐中增加挡板或其他附件时搅拌功率不再增加，而漩涡基本消失。此时的档板系数称为全挡板条件，即搅拌功率达到饱和。

⑤ 消泡器：将泡沫打破（耙式消泡器）

⑥ 连轴器及轴承：使上下搅拌轴成牢固的刚性连接。中型发酵罐一般在罐内装有底轴承，大型发酵罐还装有中间轴承。

⑦ 空气分布装置：吹入无菌空气并使空气均匀分布（单管及环形管式） ⑧ 换热装置：进行加热或冷却，维持发酵温度

⑨ 轴封：使固定的发酵罐与转动的搅拌轴之间能够密封，防止泄露和污染

⑩ 电极（通用式发酵罐才有）温度电极(热电偶)；pH 电极；溶氧(DO, dissolved oxygen)电极 5、了解：其他类型发酵罐

1. 酒精发酵罐：（液体深层厌气发酵设备）：圆柱锥底/斜底

2. 自吸式发酵罐：搅拌过程中自动吸入空气 （叶轮均为空心形）。

优点：节约空气净化系统设备，减少设备投资；便于自动化，连续化，溶氧效率高 缺点：易染菌（搅拌速度高，丝状微生物不适合）

3. 气升氏发酵罐：空气喷射，发酵液循环流动，分内环流式和外环流式两种

§2 发酵罐的比拟放大

1. ★反应器比拟放大的重要性？

目前发酵罐的比拟放大一般是靠经验放大、因次分析、时间常数、数学模拟法等。

由于对反应过程客观规律掌握不够深刻、完整时，只能靠经验逐级放大。化学工业中，每级放大在50倍以下，而且每级放大时需对前级参数进行修正。反应器的比拟放大有利于工业化生产，在确保收益最大化的情况下增加生产规模。

2、空气流量的放大可以三个指标为依据：

①VVM ：单位体积单位时间发酵液的空气流量

②空气线速度；指空气由罐底通过罐体到达罐顶的直线速度 ③KLa 值：体积溶氧系数 （高好氧发酵应用较广） 3、★空气流量放大有那些方法？

1）以单位培养液体积中空气流量相同的原则放大，即VVM 相同的原则。 2）以空气直线流速相同的原则放大:

3）以体积溶氧系数kLa 相等为基准的放大法（空气流量放大时，一般以KLa 相等的原则放大） 4）以恒定搅拌叶轮尖端线速度作为放大原则（或者作为校正原则） 5）以恒定混合时间作为放大或者校正基准

6） 搅拌功率的放大：以单位培养液体积所消耗的搅拌功率相同原则放大 4、计算：

1）几何尺寸的放大

放大倍数m 指罐的体积增加倍数，即

1

2V V m =

∵几何相似，∴

2

2

11D H D H =

则

m D D D D D D H D H D V V ====3

1

21

2

122

212

12

2

212

)(

4

4

44

π

π

ππ

所31

212m D D

H H ==

5

3d n P ∝

（如果按几何相似法放大，当体积增加1000倍时，生物反应器的直径和高度均放大10倍）

2）用不同的放大原则放大反应器的结果是不同的。举例如下：

若V2/V1=125, D2=？D1,P2=1.5P1,则用上述三种不同放大方法计算出来的空气量如表所示：

放大125倍时，不同放大判据的vvm和ug值

若以VVm 相同原则放大，放大125倍后，Ug增加了3.33倍，因气速太大，跑料可能严重，还容易使搅拌器处于被空气所包围的状态，不能加强气液接触和搅拌液体的作用。若以Ug相同方法进行放大，则VVm值在放大后仅为放大前的30%。此值又过低。因此人们认为以KLa相同原则放大，其合理性大，放大后的VVm和Ug值比较适合。

第九章种子的扩大培养

掌握对发酵种子的要求；掌握接种量、种龄、发酵级数的概念；掌握控制种子质量的基本方法和手段

一、发酵工业微生物的培养类型

1、实验室培养方法：表面培养，液体培养，固态培养

二、种子扩大培养的目的与要求

1、种子扩大培养的概念：种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量纯种的过程。这些纯种培养物称为种子。

目的：微生物扩培到一定的质和量。在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体

2、种子制备过程/工艺过程：斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵

举例：青霉素生产的种子制备：安培管→斜面孢子→大米孢子→一级种子→二级种子→发酵

3、★种子罐级数：级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。（根据微生物生长特性，繁殖速度，发酵罐容积确定。）

级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。

一级种子培养：生长迅速的细菌，只需要一次种子罐，进入二级发酵；

二级种子培养：生长较慢微生物（如青霉素发酵菌），一级种子罐孢子发芽，长出菌丝，二级种子罐扩大培养，进入三级发酵。

三级发酵的特点：①种量更大，生长速度快；②糖酸转化率高且稳定

4、理解种子扩培的目的和要求

·种子扩培的目的：接种量的需要；菌种的驯化与适应；缩短发酵时间、保证生产水平

★种子的要求：总量及浓度能满足要求；个体与群体的生理状况稳定；活力强，移种至发酵后，能够迅速生长；无杂菌污染

三、种子质量控制——★掌握控制种子质量的基本方法和手段

1、影响种子质量的因素

（1）培养基：种子罐和发酵罐培养基成分最好相同，种子罐阶段糖分少氮源多，有利微生物生长；

（2）培养条件：温度、PH、通气、搅拌等；

（3）★接种量和种龄

接种量：种子液体积和接种后培养液体积的比例。