基因工程第三章克隆载体-1汇总讲解

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质粒载体 (Plasmid vector):
以质粒DNA分子为基础构建(construct)而成的克隆 载体。
构型: 超螺旋 supercoil
Relaxed DNA
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Supercoil DNA
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1.2 质粒的大小
天然质粒:1kb~100kb 质粒载体较小, 有的只有3kb, 具有作为载体的 必须序列即可。
（1）T-DNA • Ti质粒中能转移进入植物细胞内的DNA片段。
长约20kb， • 包含冠瘿碱合成和冠瘿瘤生长基因
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T-DNA的结构特征：
➢ T-DNA区两端具有25个碱基对的顺向重复序列称为边 界序列。
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➢ 右边界序列更重要。 • 去除右边界序列，将使T-DNA失去转移和整合的
• 农杆菌粘附到植物细胞壁。
• 植物激素诱导vir基因表达，其表达产物引起T-
DNA•脱离质粒 • 并位移进入植物细胞中,进入植物细胞的T-DNA整
合并表达。
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3.2、 Ti质粒载体的构建(Construction)
• 构建Ti质粒克隆载体不是真正用于农杆菌， 而是用于植物，农杆菌起介导作用。
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启动子
合适的质粒
多克隆位点 终止子
标记基因
Ori EcoRI
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2.2 获得合适的DNA片段.
❖DNA也要用限制酶切开，有 两个粘性末端。 ❖易于DNA ligase连接.
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2.3、重组连接
❖混合酶切后的DNA片段和载体，加入DNA ligase催 化连接。
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第一节 质粒 Plasmid
1 质粒的特点
1.1 定义 ❖细菌染色体之外的能自主复制的双链环状DNA分 子。 ❖ Circular, double-stranded DNA (dsDNA) that are separated from the chromosomal DNA in bacteria.
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1.6 显性质粒与隐蔽质粒
• 隐蔽质粒：引入后，受体细胞的遗传特性无 变化。
• 显性质粒：引入后，为受体细胞提供了新的 遗传特性。
• 如：抗抗生素，颜色变化等。
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2 质粒载体的构建
2.1 选择合适的出发质粒，并用限制酶切开。 好的质粒应具备： • 复制起始位点（Replication Origin，Ori） • 标记基因（Marker gene ） • 多克隆位点（Multiple cloning site ） • 启动子（Promoter ） • 终止子（Terminator）
布什
本.拉登
布什
• 受体细胞最好无内源质粒.
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布莱尔
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1.5 质粒的迁移性
• 接合质粒：含有 tra基因，可连接宿主细胞和受体 细胞，并在两者间转移。 特点: 大，拷贝数少，宿主多，不安全。
• 非接合质粒：无tra基因， 特点: 小，拷贝多，宿主少，安全，常用载体。
接合质粒 染色体
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2. 携带外源DNA进入受体细胞(receptor cell, host cell)，并能自我复制。
3. 有选择标记基因(marker gene),例如：抗抗生素 基因。
4. 载体要安全，对受体安全，不能转入其他生物， 尤其人细胞。
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复制起始位点
多克隆位点
抗氨苄青霉素基因
The essential nucleotide sequences of cloning vectors: 1. A replication origin, 2. A drug-resistance gene, 3. Multiple cloning sites.
200kb 8/32
3kb
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1.3 质粒的复制 Replication
• 每次细胞分裂，质粒均可复制传给子代 细胞。
• 一般，细胞中质粒的拷贝数保持稳定。
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• 松驰型质粒：拷贝数多，小质粒。 • 严紧型质粒：拷贝数少，大质粒。
200kb 10/32
<5kb
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1.4 质粒的不亲合性
• 能寓于同一细胞的质粒为亲合性质粒 • 不能寓于同一细胞的质粒为不亲合性质粒。
第三章 基因克隆载体 Chapter 3 Gene Cloning Vector
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计划学时: 4h • 第一节 质粒载体 (plasmid vector) • 第二节 病毒载体(virus vector) • 第三节 染色体定位整合载体(chromosome
position fixing vectors) • 第四节 酵母人工染色体载体 (YAC vector) • 第五节 特殊用途的载体
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质粒克隆60
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3 Ti 质粒载体
• Ti 质粒: 农杆菌中可引起寄主产生肿瘤的质粒。 • Ti plasmid (tumor-inducing plasmid) • 农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
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3.1 Ti质粒的组成（4个功能区）
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克隆载体的定义
• 通过不同途径能将承载的外源DNA片段带入 受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子。
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载体的特点
1. 有多克隆位点,供外源DNA插入。
多克隆位点(multiple cloning site, polylinker): 具有多个限制酶的识别序列,可供处源DNA片段 插入.
• （4） Ori区：复制起始区.
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Left border
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Vir region
Con region
Ori region
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3.2 基因转化过程 Left border
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• 农杆菌感染后，植物细胞接受刺激释放信号分子，
反过来激活农杆菌Ti质粒上的vir基因；
功能；左边界的缺失，对无明显影响。
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• 只要保留边界序列， T-DNA的其它序列被外源 DNA片段替换，仍可转入植物基因组。
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• （2） Vir区:位于T-DNA上游的一组基因， 可引起T-DNA的转移，长度约35kb
• （3） Con区：含有与农杆菌之间接合转移 有关的基因（tra），使Ti质粒在细菌间转 移。