体内药物分析-生物样品与样品制备(2)
体内药物分析第2章生物样品与生物样品制备在线测试及答案
《体内药物分析》第04章在线测试《体内药物分析》第04章在线测试剩余时间：53:57答题须知：1、本卷满分20分。
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第一题、单项选择题（每题1分，5道题共5分）1、比色法虽具有快速简便、对仪器要求不高等特点。
但灵敏度不高，A、只能测定出10ug/ml浓度以上的样品B、只能测定出1ug/ml浓度以上的样品C、只能测定出5ug/ml浓度以上的样品D、只能测定出ml浓度以上的样品2、荧光分光光度法的灵敏度可达A、1g/mlB、1pg/mlC、1ng/mlD、1mg/ml3、虽具有荧光的物质数量不多但体内许多重要的生化物质、药物及其代谢物或致癌物都有荧光现象。
由于荧光衍生物试剂的使用，扩大了( )在体内药物分析和药物动力学的应用。
A、荧光分光光度法B、紫外分光光度法C、红外分光光度法D、可见分光光度法4、在规定条件下同一个均匀样品，经过多次取样测定所得结果彼此接近的程度A、精密度B、专属性C、检测限D、准确度5、多种组分共存时，分析方法能准确测定出被测物的能力A、精密度B、准确度C、检测限D、专属性第二题、多项选择题（每题2分，5道题共10分）1、光谱分析法约占应用血药浓度测定方法总数的1/3，主要有A、比色法B、紫外分光光度法C、荧光分光光度法D、远红外分光光度法E、免疫分析法2、由于受到体液中内源性杂质的干扰和影响。
故紫外分光光度法在体内药物分析中也受到（）的限制。
A、灵敏度B、准确度C、专一性D、精密度E、回收率3、紫外分光光度法常采用( )，可以提高方法的灵敏度和选择性。
A、三波长分光光度法B、差示分光光度法C、导数分光光度法、D、双波长E、红外分光光度法4、常用相关系数r表示两种分析方法A、相关系数r表示r＝0表示两法完全不相干B、一般要求两法的相关系数r≥，两法基本相干，C、相关系数r＝1两法完全吻合D、相关系数r越接近1说明两种方法越相关E、没有可比性5、体内药物分析方法设立与建立的一般步骤A、以纯品进行测定B、以处理过的空白样品进行测定C、体内实际样品测定D、体外试验E、回收率的测定第三题、判断题（每题1分，5道题共5分）1、体内药物分析方法的评价比常规的药物分析要求更严正确错误2、荧光分光光度法在体内药物分析中应用比紫外分光光度法更灵敏正确错误3、由于体内药物分析方法影响因素较多,文献报道的方法一般不易完全重现正确错误4、考察分析方法的稳定性是指药物的稳定性正确错误5、常用相关系数r＝1表示两种分析方法完全不相干正确错误交卷。
体内药物分析第三章生物样品与样品制备
建立完善的数据记录与审核制度，确保实验数据的真实性和可追溯性。
效果评价指标设定和持续改进方向
效果评价指标
根据实验目的和要求，设定合理的效果评价指标，如方法回收率、精密度、准确度等，对实验结果进 行客观评价。
持续改进方向
针对实验过程中出现的问题和不足，制定改进措施并持续改进，如优化实验条件、改进操作方法、提 高设备性能等，不断提高体内药物分析的质量和效率。同时，关注新技术、新方法的发展和应用，不 断完善和更新质量保证和质量控制体系。
质量控制样品的使用
使用质量控制样品进行方法验证和日常质量监控，确保实验结果的准 确性和可靠性。
质量控制方法选择及实施过程监控
方法学验证
在建立新的体内药物分析方法时，应进行充分的方法学验证，包括专属性、线性、精密度、准确 度、稳定性等方面的考察，确保方法的可行性和准确性。
过程监控
在实验过程中，采用定期抽查、盲样测试等方式对实验过程进行监控，确保实验操作的规范性和 结果的可靠性。
04 生物样品保存、运输和接 收标准操作流程
保存条件及时限设定原则
保存条件
生物样品应在规定的低温条件下保存，以确保样品的稳定性和防止降解。通常，血浆、血清和尿液等样品应在20°C或更低温度下保存，而一些特殊样品可能需要在-70°C或更低温度下保存。
时限设定
生物样品的保存时限应根据其稳定性和分析物的性质来确定。一般来说，长期保存的样品应在采集后尽快处理并 冻存，以避免分析物的降解或转化。同时，应定期对保存样品进行质量评估，以确保其完整性和可用性。
新型生物样品的保 存与运输
对于细胞和基因等新型生物样 品，同样需要在低温条件下保 存和运输。此外，还应避免反 复冻融和长时间存放，以确保 样品的稳定性和可靠性。
体内药物分析
第一节 体内药物分析的目的和意义
1、生物样本分析方法的建立 2、生物样本的测定
3、药物的体内研究评价
第一节 体内药物分析的目的和意义
给药方案与效应关系
给药
药代动力学
药物
ADME
药效学
药物效 应与不 良反应
药物进入机体后，产生的两种不同的效应。
体内药物分析概述
二、体内药物分析的对象
临床人体 试验
(clinical）
非临床动 物试验 (preclinical
血液
药物代 谢物
尿液
常用样 本种类
唾液
头发
粪便
体内药物分析概述
三、体内药物分析特点
➢ 干扰物质多，内源性物质多，与药物有结合、缀合，需 经过分离、纯化。
➢ 样品浓度低，测定前需浓缩、富集。 ➢ 取样量少 ➢ 工作量大 ➢ 对仪器设备要求高（如需要样本冷贮、萃取、离心、富
特点
优缺点
• 优点: 样本易得，样品量 大; 尿液中药物浓度较高， 易于检测；无需去蛋白处 理。
• 缺点: 易受食物种类、饮 水多少、排汗情况等的影 响，个体差异常常很大。
• 直接测定，萃取 分离测定
• 采用化学方法或 酶解法游离缀合 状态药物。
尿样的 尿样的 制备 采集
• 自然排尿法
• 随时尿、晨尿、白天 尿、夜间尿、及特定 时间段尿液。
阐明药物在体内ADME过程和 特点，提供药动学参数，揭示 药物在体内动态变化的规律性
阐明代谢物的结构、转化途径 及其动力学
为药效学和毒理学评价提供重 要的线索
目的
药物研发过程中的体内药物试验和分析
体外PK/PD 动物PK/PD
毒性
《体内药物分析》试题答案
《体内药物分析》试题答案一、选择题1. 下列哪种药物分析方法属于体内药物分析范畴？（D）A. 高效液相色谱法B. 气相色谱法C. 液相色谱-质谱联用法D. 生物样品分析法答案：D解析：体内药物分析主要关注生物样品中的药物及其代谢产物分析，因此生物样品分析法属于体内药物分析范畴。
2. 下列哪种生物样品最适合进行体内药物分析？（C）A. 血液B. 尿液C. 唾液D. 胃液答案：C解析：唾液中药物浓度与血液中药物浓度有一定的相关性，且取样方便、无创，因此唾液是最适合进行体内药物分析的生物样品。
二、填空题1. 体内药物分析的基本步骤包括：取样、__________、__________、__________。
答案：样品处理、药物提取、分析方法选择、数据分析2. 体内药物分析中常用的生物样品有：__________、__________、__________、__________。
答案：血液、尿液、唾液、胆汁三、判断题1. 体内药物分析中，生物样品的取样时间对分析结果有较大影响。
（√）解析：生物样品的取样时间直接关系到药物在体内的浓度，因此对分析结果有较大影响。
2. 液相色谱-质谱联用法在体内药物分析中具有较高的灵敏度和准确度。
（√）解析：液相色谱-质谱联用法结合了液相色谱的高分离效能和质谱的高灵敏度和准确度，是体内药物分析中常用的方法。
四、简答题1. 简述体内药物分析的目的和意义。
答案：体内药物分析的目的是通过分析生物样品中的药物及其代谢产物，了解药物在体内的动态变化规律，为药物研发、临床用药、药效评价和药物安全性评价提供科学依据。
其意义在于：（1）有助于了解药物的药效学和药动学特性，为药物研发提供重要依据。
（2）有助于监测临床用药过程中的药物浓度，指导合理用药。
（3）有助于评价药物的生物利用度和生物等效性。
（4）有助于发现药物不良反应和药物相互作用。
2. 简述体内药物分析中生物样品处理的方法。
答案：体内药物分析中生物样品处理的方法主要包括以下几种：（1）蛋白沉淀法：利用有机溶剂、盐析等方法使生物样品中的蛋白质沉淀，从而分离出药物。
体内药物分析重点
第一章绪论1．体内药物分析（pharmacetical analysis in biological sample）:一门研究生物体内中药物及其代谢产物和内源性物质的质与量变化规律的分析方法学科。
2、任务：（1）进行分析技术、分析方法学研究，提供最佳分析条件。
（2）为药物体内研究提供数据（3）服务于临床治疗药物监测，参与指导临床科学用药。
（4）内源性物质的测定和研究（5）滥用药物的检测。
3、特点：（1）生物样品中干扰物质多；（2）生物样品量少，不易重新获得；（3）分析方法要求高；（4）、实验室仪器设备要求高；（5）、测定目标与数据处理复杂；（6）、工作量大：个体差异；数据量大。
4、热点问题；（1）游离型血药浓度测定方法的研究（2）代谢物的监测与研究（3）对映体药物的检测与研究（4）体内微量元素的测定与研究（5）中药药物代谢动力学研究（6）方便、快捷的样品制备方法与样品直接进样分析的研究（7）分析新方法、新技术的联用研究（8）体内药物分析方法的质量控制研究（9）单克隆抗体类药物的体内过程研究。
第二章——体内药物分析相关的理论基础概述•第一节药物的体内过程一、药物的吸收（Absorption）：药物由给药部位未经化学结构变化而直接进入血液循环系统的过程。
1、吸收速率：药物理化性质（脂溶性、解离度）、药物转运类型、给药途径、药物剂型、吸收部位的血流状况、药物浓度2、药物的吸收部位：胃肠道吸收胃吸收（1）非离子扩散方式吸收——与分子状态的脂溶性相关（2）pKa相近时，脂溶性大者吸收快（3）酸性药物易吸收（4）滞留时间短(5)吸收量有限。
小肠吸收(1)停留时间长(2)吸收面积大(3)主要部位碱性药物。
影响胃肠道吸收的因素: 剂型及理化特性、食物、胃肠道的功能状态、药物的首过效应、药物相互作用。
剂型与理化特性:相同药物不同剂型，吸收速度和程度不同。
普通片、缓释片、分散片。
食物：一般可延缓药物的吸收，但不影响吸收总量不同食物的pH值、脂溶性、纤维含量以及对胃肠道的刺激程度，都将使药物的吸收增加或减少。
体内药物分析
体内药物分析体内药物分析:药物分析的的重要分支，是研究生物体中药物及其代谢物和内源性物质的质与量变化规律的分析方法学。
体内药物分析的特点◆生物样品基质复杂◆被测物浓度低◆分析方法要求高◆实验室仪器设备要求高◆测定目标与数据处理复杂体内药物分析方法的要求◆高灵敏度检测方法的应用◆建立高选择性、高专属性的分离方法◆建立的分析方法满足于分析目的相适应的精密度和准确度要求成分复杂、干扰众多——要求方法选择性高采样量小，浓度很低——要求方法灵敏度高原料药：容量分析为主制剂：仪器分析为主体内药物：高灵敏度；高选择性的方法第二章生物样品指含待测物质的生物基质最常见的生物基质为血液，最常用的生物样品是血浆或血清血样采集的时间、方式：血样的应用：血样包括全血、血浆、血清全血不能作为作用部位药物浓度的可靠指标，通常指测定血浆或血清中的药物的浓度。
当血浆中含有的抗凝剂对药物浓度有干扰时，使用血清样品血样制备的差异：尿液：尿液中必须加入防腐剂，非损伤性采样方法唾液：组织：头发：微量元素的测定生物样品的贮存：◆血浆和血清：采血后及时分离（2h），短期4℃，长期-20℃◆冷冻是最常用的生物保存方法◆生物样品总的原则：临时解冻，解冻的样品一次测完，不能反复冷冻→解冻→冷冻分析样品制备的目的：◆使药物从缀合物或结合物中释放，测定总浓度◆使样品纯化与药物组分富集◆满足测定方法对分析样品的要求◆保护仪器性能及改善分析条件有机破坏法主要应用于头发样品中金属元素的测定去除蛋白质法去除蛋白质目的：溶剂解法：◆常用溶剂——甲醇、丙醇◆原理——◆操作——盐析法：中性盐（置换蛋白结合的水，使蛋白脱水而沉淀）强酸沉淀法：10％三氯醋酸、6％高氯酸超滤法：不需加热，不需添加化学试剂、操作条件温和，没有相态变化，破坏性小，能耗少，工艺流程短。
酶水解法：避免酸碱、高温降解，改善回收率，无乳化，减少净化操作纯化与浓集应用范围：液－液提取法（LLE）大多数药物都是脂溶性，内源性物质基本上都是水溶性，当用有机溶剂萃取时，药物被萃取出来而内源性物质被除去，因此采用有机溶剂萃取法能够达到纯化目的优点：选择性；药物能与多数内源性物质分离缺点：乳化、有毒、不环保、不自动，对极性大的化合物的萃取效率低固相萃取(SPE)◆原理：根据液相萃取的原理，利用液相中溶质与吸附剂间的选择性吸附与洗脱原理。
药物分析-体内药物分析
度及专属性要求较高 (3) 分析工作量大, 数据
处理和结果阐明繁杂
第一节
常用体内样品的制备与贮藏 1 体内样品的种类
2 体内样品的采集与制备 3 体内样品的贮藏与处理
一、体内样品的种类
体液
血液; 唾液
脑脊液;胃液; 胆汁;乳汁;精 液;泪液
组织
胃;肠;肝;肾;肺 ,脑;肌肉;头发
原形,代谢物及缀合物 药物浓度较高 收集量大(1~5L) 2. 尿样的采集 自然排尿 规定时间段(6-8h)(时间尿) 3. 尿样的贮藏 加入适当防腐剂
（三）唾液 TDM测定S代替P进行临床监测 1. 唾液的组成
腮腺, 舌下腺和颌下腺 2. 唾液的采集
漱口15min, 安静状态, 自然流出的唾液 物理或化学方法刺激 3. 样品的制备 3000r/min离心10min,上清液
(二) 去活性
采样后立即终止酶的活性 常用方法: 液氮速冻, 微波照射, 匀浆/沉淀, 加酶活性 阻断剂(氟化钠)或抗氧剂(VC), 煮沸
•血液是主要样品
体液或组织 •尿液,唾液,头发和脏器
概述
特点
体内药物分析的特点 主要来自于体内样品的特点
1. 体内样品的特点 (1) 采样量少: ml~µl级;
且不易重新获得 (2) 待测物浓度低:µg/ml
~ng/ml级, 甚至pg/ml (3) 干扰物质多: 尤其是
血样和组织中的蛋白质
2. 体内药物分析的特点 (1) 样品需经纯化浓集,
概述
体内药物分析
分析方法 样品制备 存在形式
体内样品
指体内样品（生物体液、器官或 组织）中药物及其代谢物或内源 性生物活性物质的定量分析。
体内药物分析简介——样品的采集(血液)
10/8/2020
体内药物分析
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体内药物分析简介
二、样品的采集
（一）血液（blood） 3. 全血的制备
将采集的血液置含有抗凝剂的试管中，但不经离心操作， 保持血浆和血细胞均相状态，即为“全血” （whole blood）
体内药物分析简介
二、样品的采集
（一）血液（blood） 4. 血样的应用
血样主要应用于： 药物动力学 生物利用度 临床治疗药物浓度监测
体内药物分析简介
二、样品的采集
（一）血液（blood） 2. 血样的制备 （2）血清的制备
采集的静脉血液置试管中，于37℃或室温放置30min~1h。 血液凝固后，用细竹棒或玻璃棒轻轻剥去试管壁上的血饼，再 在2500~3000 r/min离心5~10min，上层淡黄色液体即为血 清（serum）。
体内药物分析简介
样品的采集
制作单位：沧州医学高等专科学校
体内药物分析简介
二、样品的采集
（一）血液（blood）
因血液中药物浓度可以较好地体现药物浓度和治疗作用之 间的关系，是最为常用的生物样品—分为全血、血浆和血清 1. 血样的采集 一般用注射器直接采集静脉血，每次1~5ml； 动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一。 2. 血样的制备 测定血中药物的浓度，通常是指测定血浆或血 清中的药物浓度，尤其是血浆，并非指全血。
体内药物分析简介
二、样品的采集
（一）血液（blood） 3. 全血的制备
成
血浆
分
红细胞
有形物质
白细胞 血小板
体内药物分析简介
二、样品的采集
（一）血液（blood） 3. 全血的制备
某些情况血浆内药物浓度波动大，或血浆浓度低，可用全 血（全血净化较血浆和血清麻烦）
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饼→以2000r/min～3000r/min离心5min～ 10min →分取上清液即为血清
当血浆中含有的抗凝剂对药物浓度有干扰时，使用血清样品 4
肝素的加入： 1ml血液/需要肝素0.1～0.2mg，通常不需 准确加入，在取血前可取少量肝素钠溶液（ 1～2滴）置于试管内，旋转试管，使肝素溶 液均匀分布于试管壁上，干燥后加入血样后 立即轻轻振摇即可。
体积比：1：0.6 90％去除 方法：超速离心（10000r/min）
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其他去除蛋白的一些方法 1、加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 2、超滤法 3、酶水解法 4、加热法
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（三） 分离、纯化与浓集
1、液－液提取法（LLE） 2、固相萃取（SPE） 3、自动化SPE技术 4、固相微萃取（SPME） 5、膜萃取（ME） 6、微透析技术（MD） 7、超临界流体萃取（SFE）
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三、样品的预处理技术
（一）经有机破坏的方法
1、湿法破坏
2、干法破坏
硝酸－高氯酸法
高温电阻炉灰化法
电热消化器法
低温等离子灰化法
电热板消化法
烘箱消化法
3、氧瓶燃烧法
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（二） 去除蛋白质
1、溶剂解法
常用溶剂（与水相混溶的有机溶剂）： 乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、 丙酮、四氢呋喃 体积比：1：1～3 90％去除 方法：超速离心（10000r/min）
5、SDS洗涤
6、甲醇
都需要反复清 洗2～3次
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毛发样品的制备
1、直接甲醇提取 2、酸水解 3、碱水解 4、酶水解 5、超临界流体萃取 6、有机破坏
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二、生物样品的贮存与处理
（一）冷藏或冷冻 1、血浆和血清：采血后及时分离（2h），短期4℃，
长期-20℃ 2、尿样：应立即测定，否则需加防腐剂置冰箱保存 3、唾液：在4℃下保存，往往需要在取样时测定pH值 4、生物样品总的原则：临时解冻，解冻的样品一次测
第三章 生物样品与样品制备
1
【大纲要求】
1、掌握生物样品的种类及其特点 2、掌握生物样品的各种预处理方法的原
理及其应用
2
第一节 生物样品的种类、采集、 制备与贮存
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一、种类、采集和制备
(一) 血液(Whole blood, Plasma, Serum) 1、血样采集 2、血样制备 不能作为作用部位药物浓度的可靠指标 血浆的制备 血液→含有抗凝剂的试管→混合→ 2500r／min
缺点：样品的预处理繁琐、干扰多、药物的含量低 、需要精密仪器
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特点： 广谱性 积累性 稳定性 依时性 相关性 指纹性
一般在枕部采取样本，国外一般 在靠近头皮处剪取，分别于6～10 处取10个样本，从根部剪断，超 过12cm的均按照12cm处剪断
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头发洗涤
1、丙酮－水－丙酮
2、丙酮预洗→洗洁精洗涤 头 发 3、洗衣粉浸泡 的 预 4、二氯甲烷 洗
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（二） 去除蛋白质
2、加入中性盐
常用中性盐（置换蛋白结合的水，使蛋白 脱水而沉淀）：
饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸 橼酸盐
比例：1：2 90％去除 方法：超速离心（10000r/min）
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（二） 去除蛋白质
3、加入强酸
常用溶剂（与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀）： 10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸－钨酸混合液 、5％偏磷酸
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全血：血液置于抗凝管中，不经离心操作，冷冻储存 或直接分析 需要测定分布于血细胞内、外的药物浓度 如果血浆内药物浓度波动较大并难以控制 血浆药物浓度很低凝影响测定
血样的特点： 缺点：损伤性采样方式、样品量受限、抽血比较麻烦 优点：可用于药物动力学、生物利用度、临床治疗药
物监测 大多数测定的时原型药物总量
2、唾液的保存与处理：取样后，除去泡沫，分层后离心，取上清 液冻存或直接分析。
3、优点：（1）非损伤性取样，（2）可用于药代动力学研究， （3）不受采血时间和地点限制，（4）样品易收集，病人易接 受
4、应用：（1）在TDM中的应用
根据S/P分类，S/P＜1.0表示药物在唾液中的浓度很低；S/P
＝1.0表示适合药物的监测；S/P不固定表示数药物都是脂溶性的，内源性物质 基本上都是水溶性的，当用有机溶剂萃取 时，药物被萃取出来而内源性物质被除去 ，因此采用有机溶剂萃取法能够达到纯化 的目的。
完，不能反复冷冻→解冻→冷冻(FTC)；样品应以小 体积分装存放。
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第二节 生物样品的预处理与制备
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一、预处理目的
（一）药物从缀合物中释放，测定总浓度 （二）纯化、富集药物 （三）适应和满足测定方法要求的灵敏度 （四）防止对分析仪器的污染和劣化
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二、样品制备时应考虑的问题
（一）药物的理化性质、存在形式和浓度范围 （二）药物测定的目的 （三）生物样品种类和杂质干扰类型 （四）样品的化学组成 （五）药物的蛋白结合率 （六）被测组分在预处理过程中的稳定性 （七）样品在收集、储存等过程中容器的污染 （八）样品的预处理过程要求简便 （九）预处理的最后一步应富集被测组分 （十）对分析方法的要求
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(二) 尿液
1、尿药测定用途：药物剂量回收研究、药物尿清 除率、生物利用度、判断患者用药是否遵医嘱、 预测药物的代谢过程和代谢类型
2、尿的采集：非损伤性采样方式、药物浓度较高 、收集量较大、收集方便，易受食物、饮水等影 响。
3、尿样的保存与处理：
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(三)唾液
1、唾液的采集：漱口后15min进行，采集时间为10min，采用 一些物理或化学方法刺激唾液分泌；（1）缩短采样时间，（2 ）减小唾液pH变化范围，（3）刺激后得到的唾液其唾液－血 浆分布比例的个体差异较小。
唾液中；S/P很大表示药物的离子化程度很低
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组织
（1）匀浆化法：组织→加入水或缓冲液→匀浆→上清液 （2）沉淀蛋白法：组织→加入蛋白沉淀剂→上清液 （3）水解：组织→加入酸或碱→加热使组织液化→上清
液 （4）酶水解：组织→加入酶和缓冲液→加热使组织液化
→上清液
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头发
优点：取样方便、无损伤性、检样的掺伪的可能性 低、能对某些特定的代谢物进行测定、能了解数 月至数年用药的情况、可用于体内微量元素含量 测定、可用于临床用药、滥用药物和毒性药物的 检测