检测(二十八) “基因工程与克隆技术”课前诊断卷
检测（二十八）“基因工程与克隆技术”课前诊断卷
1.(2018届高三·MPT64基因(能控制合成MPT64蛋白)成功导入胡萝卜细胞，最终表达出肺结核疫苗。请回答下列问题：
(1)为获取MPT64基因，可从结核杆菌的细胞中提取对应mRNA，在________________的作用下合成双链cDNA片段，获得的cDNA片段与结核杆菌中该基因碱基序列______________(填“相同”或“不同”)。
(2)通常采用PCR技术扩增MPT64基因，前提是要有一段已知MPT64基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成______________，在操作步骤中需要加热至90～95 ℃的目的是________________________________________________________________________。
(3)根据农杆菌的特点，如果将MPT64基因插入到_______________上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入胡萝卜细胞，并将其插入到植物细胞中的______________上。要确认MPT64基因是否在胡萝卜植株中表达，应检测胡萝卜植株中是否含有________________________________________________________________________。
(4)研究发现，如果将MPT64蛋白20位和24位的氨基酸改变为半胱氨酸，其保存时间将大大延长，科学家可以生产上述耐储存的MPT64蛋白的现代生物工程技术是________________________________。
解析：(1)以mRNA为模板合成cDNA的过程是逆转录，需要逆转录酶的催化。由于DNA转录形成的mRNA过程中非编码序列不转录，所以形成的cDNA与结核杆菌中该基因碱基序列不同。(2)在PCR技术中，以已知一段MPT64基因的核苷酸序列为模板，合成引物。在操作步骤中需要加热至90～95 ℃，以打开DNA的双链。(3)在农杆菌转化法中，将MPT64基因插入到农杆菌的Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入胡萝卜细胞，并将其插入到植物细胞中的染色体的DNA上。基因的表达产物是蛋白质，要确认MPT64基因是否在胡萝卜植株中表达，应检测胡萝卜植株中是否含有MPT64蛋白。(4)利用蛋白质工程可以通过设计改造原有蛋白质的结构和功能。
答案：(1)逆转录酶不同(2)引物目的基因DNA受热变性解链为单链(3)Ti质粒的T-DNA染色体的DNA MPT64蛋白(4)蛋白质工程
2．(2017·衡水模拟)油菜中油酸为不饱和脂肪酸，能降低人体血液的胆固醇含量，减少人体患心血管病的风险。F基因控制合成的油酸酯氢酶催化油酸形成饱和脂肪酸，转反义F 基因油菜能提高菜籽油的油酸含量。请分析回答下列问题：
(1)从油菜细胞的染色体DNA获取F基因后进行大量扩增的方法为___________。
(2)构建反义F基因表达载体时，需要用到的工具酶有_____________________；农杆菌可用来将反义F基因表达载体导入油菜细胞，从分子角度分析，其具有的特点是______________________________________________。构建反义F基因表达载体时没有设计标记基因，其可能的原因是_______________________________________________。
(3)Le启动子为种子特异性启动子，将F基因反向连接在Le启动子之后构建了反义F 基因。检测转反义F基因油菜细胞内F基因转录的mRNA含量，结果表明，因杂交形成双链RNA，细胞内F基因的mRNA水平下降。由此推测，反义F基因的转录抑制了F基因的________(填“复制”“转录”或“翻译”)过程。若F基因转录时，两条单链(a1、a2)中a1为转录的模板链，则反义F基因转录时的模板链为__________。
解析：(1)PCR技术是一种体外扩增DNA片段的技术。(2)构建基因表达载体时，首先需要用限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和运载体，其次还需要用DNA连接酶将目的基因与运载体连接形成重组DNA分子；因农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，故农杆菌转化法为常用的将目的基因导入植物细胞的方法；标记基因表达产物，可能会对食品安全构成威胁，所以构建反义F基因表达载体时没有设计标志基因，这样不会产生标记基因表达产物，有利于食品安全。(3)mRNA 是翻译的模板，转反义F基因油菜细胞内F基因转录的mRNA含量下降，可见反义F基因的转录抑制了F基因的翻译过程。F基因转录形成的RNA能与反义F基因转录形成的RNA 互补配对，若F基因转录时，两条单链(a1、a2)中a1为转录的模板链，推测反义F基因转录时的模板链为a2。
答案：(1)PCR技术(2)限制酶、DNA连接酶其Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上无标记基因表达产物，有利于食品安全(3)翻译a2
3．科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了光合作用过程中Rubisco酶对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合速率。请回答下列问题：
(1)PCR过程所依据的原理是________________，该过程需要加入的酶是_____________。
(2)该技术不直接改造Rubisco酶，而通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是_______________________________。与传统基因工程技术相比较，定点突变技术最突出的优点是_______________________，PCR定点突变技术属于_______________的范畴。
(3)可利用定点突变的DNA构建基因表达载体，常用__________________将基因表达载
体导入植物细胞，将该细胞利用植物组织培养技术培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是____________。
解析：(1)PCR技术是一种体外扩增DNA片段的技术，其原理是DNA双链复制，该过程需要耐高温的DNA聚合酶(或Taq酶)的催化。(2)由于蛋白质空间结构较为复杂，改造困难，所以该技术不直接改造Rubisco酶，而通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造；和传统基因工程技术相比较，定点突变技术最突出的优点是能生产出自然界不存在的蛋白质，PCR定点突变技术属于蛋白质工程的范畴。(3)将基因表达载体导入植物细胞常用农杆菌转化法；植物组织培养技术的原理是植物细胞的全能性。
答案：(1)DNA双链复制耐高温的DNA聚合酶(或Taq酶)(2)蛋白质空间结构较为复杂，改造困难能生产出自然界不存在的蛋白质蛋白质工程(3)农杆菌转化法植物细胞的全能性
4．在植物抗病毒基因工程中，利用植物病毒复制酶基因是一种常见的方法，某实验小组将芜菁花叶病毒复制酶(TuMV-Nib)反义基因导入大白菜中，经检测表明TuMV-Nib反义基因不仅整合到大白菜的染色体中，还获得表达，而且转基因植株的接种测试表明转基因植株具有明显的抗病性。TuMV-Nib反义基因的作用过程如下图所示，请回答下列问题：
(1)实验室大量扩增TuMV-Nib反义基因常用的技术为___________，该技术需要加入的原料是____________，利用该技术扩增目的基因时_________(填“需要”或“不需要”)知道该基因的全部碱基序列。
(2)将目的基因导入植物细胞的常用方法是_________，该方法常将目的基因导入Ti质粒的T-DNA分子中，其原因是_______________________________________。
分析图示可知，TuMV-Nib反义基因主要通过影响图中的_________(填序号)过程，影响TuMV-Nib基因的表达。
(3)对已经被病毒感染的植株，可选取该植株的茎尖通过_________________技术获得脱毒苗，利用茎尖作为材料的原因是____________________________________________。
解析：(1)大量扩展TuMV-Nib反义基因常用PCR技术，该技术需要加入四种脱氧核糖核苷酸(或dATP、dTTP、dCTP、dGTP)为原料，利用该技术扩增目的基因时不需要知道该基因的全部碱基序列，但需要根据基因两端的部分序列合成引物。(2)将目的基因导入植
物细胞常用农杆菌转化法，该方法常将目的基因导入Ti质粒的T-DNA分子中，借助T-DNA 能主动转移并整合到宿主细胞染色体的DNA分子中的特点导入目的基因。据图可知，TuMV-Nib反义基因转录出反义mRNA，与mRNA结合，导致图中②翻译过程受阻，影响TuMV-Nib基因的表达。(3)对已经被病毒感染的植株，由于茎尖很少或没有被病毒感染，可选取该植株的茎尖通过植物组织培养技术获得脱毒苗。
答案：(1)PCR四种脱氧核糖核苷酸(或dATP、dTTP、dCTP、dGTP)不需要(2)农杆菌转化法T-DNA能主动转移并整合到宿主细胞染色体的DNA分子中②
(3)植物组织培养茎尖很少或没有被病毒感染
5．(2017·新余市模拟)科学家将人的生长激素基因与pBR322质粒进行重组，将得到的重组质粒导入牛的受精卵，再通过细胞工程培育为转基因克隆牛。pBR322质粒含有2个抗生素抗性基因和5个限制酶切点(如图2)。请据图回答问题：
(1)图1中显示的人的生长激素基因是通过人工合成的，图中①过程需要的酶是_____________。该过程所依据的碱基互补配对原则是____________________________(用字母和箭头表示)。
(2)图1中的mRNA是从人体的____________细胞中获取的。
(3)重组质粒形成与否需要鉴定和筛选，方法是将重组质粒的DNA分子导入大肠杆菌，通过含抗生素的培养基进行培养，观察大肠杆菌的生长、繁殖情况进行判断。如图3所示：
①如果受体菌在培养基A上能生长、繁殖形成菌落，而不能在培养基B上生长、繁殖，则使用限制酶a的切点是图2中的___________________，即目的基因插入了_____________________中。
②如果受体菌在培养基A上不能生长、繁殖形成菌落，而在培养基B上能生长、繁殖，则使用限制酶a的切点是图2中的_________，即目的基因插入了______________中。
③如果受体菌在培养基A和培养基B上都能生长、繁殖形成菌落，则使用限制酶a的切点是图2中的_________。
解析：(1)根据图1分析，目的基因是通过mRNA逆转录形成的，需要逆转录酶的催化；
RNA中的碱基是A、U、C、G，DNA中的碱基是A、T、C、G，所以配对方式是A→T、U→A、G→C、C→G。(2)根据题意，生长激素基因是目的基因，该基因表达产物由垂体细胞分泌，所以需要从垂体细胞中提取mRNA。(3)①受体菌能在含氨苄青霉素的培养基上生存，不能在含四环素的培养基上生存，所以限制酶切点位于抗四环素基因内部，由图2可知，是切点3或切点4或切点5。②受体菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生存，能在含四环素的培养基上生存，所以限制酶切点位于抗氨苄青霉素基因内部，由图2可知，是切点1。③受体菌能在含氨苄青霉素的培养基上生存，也能在含四环素的培养基上生存，所以这两个抗生素抗性基因都没有被破坏，由图2可知，是切点2。
答案：(1)逆转录酶A→T、U→A、G→C、C→G
(2)垂体(3)①切点3或切点4或切点5抗四环素基因②切点1抗氨苄青霉素基因③切点2
6.大量培养蓝莓具体流程的文字图解。请回答下列问题：
蓝莓
组织――→
①
愈伤
组织
――→
②
长出
丛芽
――→
③
生根――→
④
移栽
成活
(1)用于离体培养的蓝莓组织叫作_____________，该技术的原理是_______________。
(2)配制MS培养基时，应加入一定量的琼脂、蔗糖、无机盐、维生素、有机物等营养物质，蔗糖除作为碳源外，还具有_________________________的功能。常用的培养基有脱分化培养基、生根培养基和生芽培养基，这三种培养基的主要差异是________________。
(3)图中蓝莓组织要经过消毒处理后才能进行培养。其①过程中，细胞的分化程度会__________(填“升高”“降低”或“不变”)。
(4)愈伤组织经过②③过程重新分化成根或丛芽的过程叫_____________。
(5)蓝莓花青素在60 ℃以下的热稳定性较好，将含花青素的粗品经真空干燥(可使水的沸点降低40 ℃)制成成品。采用该方法的主要原因是___________________________。
解析：(1)用于离体培养的植物器官或组织片段，叫作外植体。植物组织培养的主要原理是植物细胞具有全能性。(2)配制MS培养基时，应加入一定量的琼脂、蔗糖、无机盐、维生素、有机物等营养物质，蔗糖除作为碳源外，还具有提供能量和维持渗透压的功能。常用的培养基有脱分化培养基、生根培养基和生芽培养基，这三种培养基的主要差异是生长素
和细胞分裂素的用量及比例不同。(3)图中①过程是脱分化形成愈伤组织的过程，高度分化的细胞恢复分裂能力，则分化程度降低。(4)图中②③过程是愈伤组织经过再分化形成胚状体的过程。(5)含花青素的粗品经真空干燥(可使水的沸点降至40 ℃)制成成品，采用该方法的主要原因是避免(干燥时温度过高导致)花青素分解。
答案：(1)外植体(植物)细胞全能性(2)提供能量和维持渗透压生长素和细胞分裂素的用量及比例不同(3)降低(4)再分化(5)避免(干燥时温度过高导致)花青素分解7．Rag2基因缺失小鼠不能产生成熟的淋巴细胞。科研人员利用胚胎干细胞(ES细胞)对Rag2基因缺失小鼠进行基因治疗。其技术流程如图：
(1)步骤①中所选的卵母细胞应处于______________期。
(2)步骤②中，重组胚胎培养到囊胚期时，可从其________________分离出ES细胞，ES细胞在形态上表现为________________________的特点。
(3)步骤③中，需要构建含有Rag2基因的______________________。可以根据Rag2基因的核苷酸序列设计合成________，利用________技术扩增Rag2基因片段。用HindⅢ和PstⅠ限制酶分别在目的基因所在DNA片段两侧进行酶切获得Rag2基因片段。为将该片段直接连接到表达载体，所选择的表达载体上应具有_________________酶的酶切位点。
解析：(1)步骤①为核移植，所选的卵母细胞应处于减数第二次分裂中(MⅡ)期。(2)重组胚胎培养到囊胚期时，可从其内细胞团中分离出ES细胞，ES细胞在形态上表现为体积小、细胞核大、核仁明显。(3)步骤③中表示将Rag2基因(目的基因)导入ES细胞(受体细胞)，此过程需要构建含有Rag2基因的表达载体(重组质粒)。设计引物要遵循碱基互补配对原则，所以根据Rag2基因的核苷酸序列进行设计，可利用PCR技术扩增Rag2基因片段。Rag2基因片段是用HindⅢ和PstⅠ限制酶切割获得，所以表达载体上应具有HindⅢ和PstⅠ酶的酶切位点。
答案：(1)减数第二次分裂中(MⅡ)(2)内细胞团体积小、细胞核大、核仁明显(3)表达载体(重组质粒)引物PCR HindⅢ和PstⅠ
8．早早孕试纸是人们设计出来的一种方便女性检测自己是否怀孕的产品。人绒毛膜促
性腺激素(HCG)是由受孕妇女体内胎盘产生的一种糖蛋白类激素，在孕妇的尿液中大量存在，而非妊娠孕妇尿液中几乎不含有该激素。回答下列问题：
(1)HCG在胎盘细胞的_________合成，然后在_________上进一步合成加工，最后经_______进一步的修饰加工然后分泌到细胞外。
(2)HCG单克隆抗体是由__________细胞产生的，由于单克隆抗体具有____________、_____________的特点，所以能准确地识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合。
(3)制备HCG单克隆抗体的过程中，可能运用到了____________________和动物细胞培养等技术，其中后者需要置于95%空气加5%的CO2的混合气体的培养箱中进行培养，CO2的作用是__________________。
解析：(1)根据提供信息已知，人绒毛膜促性腺激素(HCG)的化学本质是一种糖蛋白，所以HCG在核糖体合成，还需要内质网的初步加工和高尔基体的进一步修饰加工才能分泌到细胞外。(2)单克隆抗体是由杂交瘤细胞产生的，具有纯度高、特异性强(灵敏度高)等特点。
(3)制备HCG单克隆抗体的过程中，会用到动物细胞融合技术和动物细胞培养等技术，其中后者需要置于95%空气加5%的CO2的混合气体的培养箱中进行培养，CO2的作用是维持培养液的pH。
答案：(1)核糖体内质网高尔基体(2)杂交瘤纯度高特异性强(灵敏度高)(3)动物细胞融合技术维持培养液的pH
基因工程实验技术介绍
一、大肠杆菌质粒DNA的提取 质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法。此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养 基。 2、37℃振荡培养过夜。 3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3 min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-H Cl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，p H4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另 一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置1 0min。 9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有 液体。 11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中 二、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。 (1)琼脂糖凝胶电泳装置
由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。使用最普遍的装置是Walt er Schaffner发明的水平板凝胶。 水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。 （2）琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。通贯凝胶的电场接通后，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。 （3）琼脂糖凝胶的染色 电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中，染色10分钟，取出紫外灯下观察。 三、质粒DNA热激法转化大肠杆菌 感受态的细胞可以摄入外部溶液中的DNA，而常态的细胞却不能，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。 1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培 养基的试管中，37℃振荡培养过夜 2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培 养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0. 3 3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴1 0min。 4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液 5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液 中，置冰上30min 6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去 上清液
【精品】2021年高中高三生物二轮复习专题练习含答案解析4：基因工程
2021年高三生物二轮复习专题练习4含答案解 析：基因工程 一、选择题 1.下列关于基因工程应用的叙述，正确的是( ) A．基因治疗就是把缺陷基因诱变成正常基因 B．基因诊断的基本原理是DNA分子杂交 C．一种基因探针能检测水体中的各种病毒 D．利用基因工程生产乙肝疫苗时，目的基因存在于人体B淋巴细胞的DNA中 2.1970年，特明和巴尔德摩证实了RNA病毒能依赖RNA 合成DNA的过程，并发现了催化此过程的酶。下面为形成cDNA 的过程和PCR扩增过程示意图。请根据图解分析，下列说法不．正确的是( ) A．催化①过程的酶是逆转录酶 B．从图示可以看出要将碱基对之间的氢键断开可以用核酸酶H和高温处理 C．从图中信息分析可知，②⑤过程为DNA复制，催化⑤过程的酶能耐高温 D．如果RNA单链中有碱基100个，其中A占25%，U占15%，则通过该过程合成的一个双链DNA片段中有胞嘧啶30
个 3.在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是( ) A．用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸 B．用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体 C．将重组DNA分子导入烟草原生质体 D．用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞 4.如图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。判断下列说法正确的是( ) A．将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法 B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌 C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A的细菌 D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长 5.在基因工程操作中限制性核酸内切酶是不可缺少的工具酶。下列有关限制性核酸内切酶的叙述错误的是( )
2020高考生物二轮复习基因工程与克隆技术学前诊断
【2019最新】精选高考生物二轮复习基因工程与克隆技术学前诊断 分子β肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常。回答下列问题： (1)异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的__________序列发生改变。 (2)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作________(填“属于”或“不属于”)蛋白质工程，理由是该操作________________________。 (3)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的____________，以其作为模板，在______________酶的作用下反转录合成cDNA。cDNA与载体需在____________________酶的作用下，拼接构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。 (4)检测受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取________，用相应的抗体进行__________杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。 解析：(1)基因是具有遗传效应的DNA片段，遗传信息储存在基因碱基对的排列顺序中。(2)蛋白质工程是指通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求，故题中所述不属于蛋白质工程。(3)利用逆转录法获取目的基因时，需先提取mRNA，在逆转录酶的作用下逆转录合成cDNA。cDNA与载体需要在限制酶和DNA连接酶的作用下拼接构建成基因表达载体，才可导入受体菌。(4)检测目的基因是否翻译成蛋白质，需要从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。 答案：(1)碱基对(2)不属于没有对现有的蛋白质进行改造(3)mRNA 逆转录限制酶和DNA连接(4)蛋白质抗原—抗体 2．下图是科学家利用大肠杆菌生产人胰岛素的部分过程。请结合相关知识回答
基因工程实验报告
基因工程实验报告 、
小麦GAPDH截短体的重组与表达 摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。 关键字：小麦基因；载体；感受态 前言 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 （一）实验过程
1.实验部分流程：
2．小麦总RNA提取（Trizol法） 2.1 材料 小麦幼苗 2.2 试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） ②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在 0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 ④Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥氯仿(最好用新的)。 ⑦异丙醇(最好用新的)。 2.3 操作步骤： ①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。 ④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤重复步骤④。 ⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 3. RT-PCR扩增目的基因cDNA 3.1 试剂 ① RNA模板 ②Olig（dT）18 ③反转录缓冲液 ④dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦Premix EX Taq DNA聚合酶 ⑧ PCR特异引物 3.2操作步骤： 3.2.1 RNA的反转录 采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6μL（需加入RNA约1μg） OligodT primer 1μL H2O（nuclease-free）5μL 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer 4μL RibolockRNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，﹣20℃保存
植物基因工程实验技术
植物基因工程实验技术
编者: 赵 燕
主审: 张学文
湖南农业大学植物科学实验教学中心
2007 年 4 月
前
言
基因工程是现代生物技术的核心, 也是现代分子生物学研究的重 要手段. 掌握基因工程技术对于生物技术专业及其它生物学相关专业 学生都很重要. 基因工程本身是由一系列分子生物学操作技术组成的系统性技 术体系,本实验指导侧重于 DNA 重组操作,将基因工程操作的常用 和核心技术组织起来, 以为我校生物技术本科生及有关专业研究生基 因工程实验提供简单而明确的指导. 为适应基因工程的飞速发展,一些生物技术公司匠心独运,开发 出专门的试剂盒,使一些复杂的实验操作简单化了.这对于实验者来 说自然是好事,但也使实验者动手胜于用脑.对于实验人员来说,一 定应知其然并知其所以然, 才会在实验中运用自己的知识予以创新性 的发展.期望本实验指导不成为实验中的教条.
编
者
2007 年 4 月
1
目
实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 实验九 实验十 附录:
录
大肠杆菌的对照培养,单菌落的分离及菌种保存 ...............3 强碱法小量制备质粒 DNA.....................................................5 琼脂糖凝胶电泳......................................................................7 植物总 DNA 的提取,纯化和检测 ........................................9 DNA 的 PCR 扩增................................................................. 11 植物总 RNA 的分离 .............................................................15 RT-PCR..................................................................................17 体外重组分子的构建,筛选及检测.....................................21 植物表达载体的构建,筛选及检测.....................................22 植物遗传转化技术 ................................................................23 实验中常用的仪器与器皿 .....................................................24
2
高中生物《基因工程》练习题(含答案解析)
高中生物《基因工程》练习题 题号一二总分 得分 一、单选题（本大题共20小题，共20.0分） 1.如图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次为（） A. 解旋酶、限制酶、DNA连接酶 B. 限制酶、解旋酶、DNA连接酶 C. 限制酶、DNA连接酶、解旋酶 D. DNA连接酶、限制酶、解旋酶 2.下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（） A. 重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和运载体 B. 所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列 C. 选用细菌为重组质粒受体细胞是因为质粒易进入细菌细胞且繁殖快 D. 只要目的基因进入受体细胞就能成功实现表达 3.如图为基因表达载体的模式图。下列有关基因工程的说法错误的 是（） A. 基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建 B. 任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别 C. 图中启动子和终止子不同与起始密码子和终止密码子 D. 抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了载体 4.一些细菌能借助限制性核酸内切酶抵御外来入侵者，而其自身的基因组DNA经预先修饰能躲避 限制酶的降解。下列在动物体内发生的过程中，与上述细菌行为相似的是（） A. 巨噬细胞内溶酶体杀灭病原体 B. T细胞受抗原刺激分泌淋巴因子
C. 组织液中抗体与抗原的特异性结合 D. 疫苗诱导机体产生对病原体的免疫 5.某目的基因两侧的DNA序列所含的限制性核酸内切酶位点如图所示，最好应选用下列哪种质粒 作为载体（） A. B. C. D. 6.下图是研究人员利用供体生物DNA中无限增殖调控基因制备单克隆抗体的思路流程。下列相关 叙述正确的是（） A. 酶a、酶b作用位点分别为氢键和磷酸二酯键 B. Ⅰ是经免疫的记忆细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞 C. 筛选出既能无限增殖又能产生专一抗体的Ⅱ必须通过分子检测 D. 上述制备单克隆抗体的方法涉及转基因技术和动物细胞核移植技术 7.下列关于基因工程技术的说法，正确的是（） A. 切割质粒的限制酶均只能特异性地识别3-6个核苷酸序列 B. PCR反应中两种引物的碱基间应互补以保证与模板链的正常结合 C. 载体质粒通常采用抗生素抗性基因作为标记基因 D. 目的基因必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制 8.在其他条件具备的情况下，在试管中进入物质X和物质Z，可得到相应产物Y．下列叙述正确 的是（）
农杆菌介导的植物转基因技术实验指导
农杆菌介导的植物转基因技术 一、实验目的 1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。 2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。 二、实验原理 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将 T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 实验一培养基配制 一、仪器和试剂 1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台 2、药品：Beef extract （牛肉浸膏） 5g/L ，Yeast extract （酵母提取物） 1g/L ，Peptone （蛋白胨） 5g/L ，Sucrose （蔗糖） 5g/L ，MgSO4.7H2O 0.4g/100ml ，Agar （琼脂）1.5g/100ml，MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙酸），6-BA （6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif ），链霉素（str ）。 二、实验方法 第一组配制YEB固体培养基 1、配制250mlYEB固体培养基：先称取1.25g Beef extract （牛肉浸膏）； 1.25g Peptone （蛋白胨）；0.25g Yeast extract （酵母提取物）；1.25g Sucrose
（蔗糖）;1g MgS04.7H2O琼脂粉3.75g ;将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取 200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml,用NaOH调pH=7.4。 2、灭菌：将盛有250ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。 3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ）,以免温度过高导致抗生素失效。 4 、倒板：将抗生素与培养基混匀，每个平皿倒15ml 培养基，可以倒16个平皿，倒完后打开平皿盖，在紫外灯下照10min,等待培养基凝固，盖上平皿盖，封口备用。 第二组配制YEB液体培养基 1、配制500mlYEB液体培养基：先称取2.5g Beef extract （牛肉浸膏）;2.5g Peptone （蛋白胨）; 0.5g Yeast extract （酵母提取物）; 2.5g Sucrose （蔗糖）; 2g MgSO4.7H2O将上述药品置于500ml三角瓶中，用量筒称取450ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至500ml，用NaOH调pH=7.4。 2、灭菌：将盛有500ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。 3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ），以免温度过高导致抗生素失效。 4 、分装：将培养基分别分装到试管和三角瓶中，每个试管中分装5ml，分 装12个试管。每个三角瓶中倒入35ml，共12个三角瓶。 5、分装好后，封口备用。 第三组配制MS液体培养基 1、配制500mlMS液体培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取2.15gMS 粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后混匀定容至500ml,用NaOH 调pH=5.8。
基因工程练习题(附答案)
基因工程练习题 1、在基因工程中使用的限制性核酸内切酶，其作用是( ) A、将目的基因从染色体上切割出来 B、识别并切割特定的DNA核苷酸序列 C、将目的基因与运载体结合 D、将目的基因导入受体细胞 2、基因工程中常用细菌等原核生物作受体细胞的原因不包括( ) A、繁殖速度快 B、遗传物质相对较少 C、多为单细胞，操作简便 D、DNA为单链，变异少 3、基因工程是DNA分子水平的操作，下列有关基因工程的叙述中，错误的是( ) A、限制酶只用于切割获取目的基因 B、载体与目的基因可以用同一种限制酶处理 C、基因工程所用的工具酶是限制酶，DNA连接酶 D、带有目的基因的载体是否进入受体细胞需检测 4、运用现代生物技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因整合到棉花细胞中，为检测实验是否成功，最方便的方法是检测棉花植株是否有( ) A、抗虫基因 B、抗虫基因产物 C、新的细胞核 D、相应性状 5、转基因动物转基因时的受体细胞是( ) A、受精卵 B、精细胞 C、卵细胞 D、体细胞 6、基因工程中常见的载体是( ) A、质体 B、染色体 C、质粒 D、线粒体 7、水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中Asp、Gly、Ser构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技术中，这种蛋白质的作用是( ) A、促使目的基因导入宿主细胞中B、促使目的基因在宿主细胞中复制 C、使目的基因容易被检测出来 D、使目的基因容易成功表达 8、运用现代生物技术的育种方法，将抗菜青虫的Bt基因转移到优质油菜中，培育出转基因抗虫的油菜品种，这一品种在生长过程中能产生特异的杀虫蛋白质，对菜青虫有显著抗性，能大大减轻菜青虫对油菜的危害，提高油菜产量，减少农药使用，据以上信息，下列叙述正确的是( ) A、Bt基因的化学成分是蛋白质 B、Bt基因中有菜青虫的遗传物质 C、转基因抗虫油菜能产生杀虫蛋白是由于具有Bt基因 D、转基因抗虫油菜产生的杀虫蛋白是无机物 9、人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工合成，通过转基因技术，可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是( ) A、大肠杆菌 B、酵母菌 C、T 噬菌体 D、质粒DNA 4 10、不属于质粒被选为基因运载体的理由是（） A．能复制 B.有多个限制酶切点C．具有标记基因D．它是环状DNA
基因工程实验(答案)
——凯1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？（实验题目的总结） 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？（自己写的） 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。（题目有歧义） 答：①取0.5g琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解； ②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq
2018年全国卷高考生物总复习《基因工程及转基因技术的安全性问题》专题演练(三)(含答案)
2019年全国卷高考生物总复习《基因工程及转基因技术的安全性问题》专题演练(三) 1．（2019年北京卷，5）为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。 下列操作与实验目的不符的是（） A．用限制性核酸内切酶EcoRI和连接酶构建重组质粒 B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞 C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞 D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上 【答案】C 2．图9为培育转基因山羊生产人β-酪蛋白的流程图。 下列叙述正确的是（） A．过程①所用的人β-酪蛋白基因可从人cDNA文库中获得 B．过程①可选用囊胚期或原肠胚期的胚胎进行移植 C．过程①可使用胚胎分割技术扩大转基因山羊群体 D．过程①人β-酪蛋白基因在细胞质内进行转录、翻译 【答案】AC 3．2019年2月3日，英国议会下院通过一项历史性法案，允许以医学手段培育“三亲婴儿”。三亲婴儿的培育过程可选用如下技术路线。 据图分析，下列叙述错误的是（） A．该技术可避免母亲的线粒体遗传病基因传递给后代 B．捐献者携带的红绿色盲基因不能遗传给三亲婴儿 C．三亲婴儿的染色体全部来自母亲提供的细胞核 D．三亲婴儿的培育还需要早期胚胎培养和胚胎移植等技术
【答案】C 4．在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中，不需要的是（）A．用携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞 B．用选择培养基筛法导入目的基因的细胞 C．用聚乙二醇诱导转基因细胞的原生物质融合 D．用适当比例的生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织生芽 【答案】C 5．下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是（） A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得 B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原（起）点 C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来 D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用 【答案】C 6．（2019年新课标①卷，38）真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A（有内含子）可以表达出某种特定蛋白（简称蛋白A）。回答下列问题： （1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_____________________。 （2）若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用__________作为载体，其原因是_____________________。 （3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_________________（答出两点即可）等优点。 （4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是___________________（填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”）。 （5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以
基因工程实验考试试题(答案)
1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？ 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？ 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。 答：①取0.5g琼脂糖置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂糖溶解；②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线； ④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇、冷的异丙醇、终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq DNA聚合酶）。 答:(1)利用半保留复制的原理，以待扩增的DNA为模板，通过一系列酶在体外引物介导下，
植物基因工程真题资料
植物基因工程真题(2011-2013) 一、名词解释 1. Southern blotting：是指通过吸附或电泳方法将经凝胶电泳分离的大分子物质从胶上转移到固相载体上，再与特定的探针反应从而达到检测或鉴定这些大分子物质的过程。 2. cis-acting elemen t顺式作用元件，存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等。它们的作用是参与基因表达的调控，本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。 3. subcloing: 4. Gene libray 5. Yeast Two-Hybrid Assays: 6. qRT-PCR 7. Shuttle plasmid vector 8. insert in activati on 9. cDNA library 10. RNAi 11. Gene kn ockout 12. Tran sducti on and tran sfect ion 13. DNA probe 14. En zyme-li nked immuno sorbe nt assay 15. Tran spositi onal recomb in ati on 16. EST
17. Fluoresce nee in situ hybridizati on 18. q-per 19. SNP 1. Per 反应原理和步骤；基本反应过程有哪些；反应体系与反应条件？简要介绍 温度和时间设臵间的关系? PCR 反应原理：DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链 DNA 在多种 酶的作用下可以变性解旋成单链，在 DNA 聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成 同样的两分子挎贝。在实验中发现， DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又 可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制 DNA 的变性和复性，加入设计引物， DNA 聚合酶、dNTP 就可以完成特定基因的体外复制。 步骤：由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA 的变性：模板DNA 经 加热至（90-96C ）左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链 DNA 解离， 使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火（复性）： 模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至（ 25-65C ）左右，引物与模板 DNA 单链的互补 序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在（70-75C ）、DNA 聚合酶（如TaqDNA 聚合酶）的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原 理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就 可获得更多的 ？半保留复制链？，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环 需2?4分钟，2?3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 标准的反应体系： 10 X 扩增缓冲液 4种dNTP 混合物 引物 模板DNA Taq DNA 聚合酶 Mg2+ 加双或三烝水至 5ul 各 200mol/L 各 10?100pmol 0.1 ?2 ig 1?2 U 1.5?2.0mmol/L 50 il 反应条件：为温度、 时间和循环次数。 温度和时间设臵间的关系： 基于PCR 原理三步骤而设臵变性-退火-延伸三个温度点。 在 标准反应中采用三温度点法，双链 DNA 在90?95 C 变性，再迅速冷却至 40?60 C,引物 退火并结合到靶序列上，然后快速升温至 70?75 C,在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物 链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100?300bp 时）可采用二温度点法， 除变性温度外、 退火与延伸温度可合二为一， 一般采用94 C 变性，65 C 左右退火与延伸（此温度Taq DNA 酶 仍有较高的催化活性）。 ① 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。一般情 况下，93 C ?94 C lmi 足以使模板DNA 变性，若低于93 C 则需延长时间，但温度不能过高， 因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或 致PCR 失败。 ② 退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR 特异性的较重要因素。 变性后温度快速 简单题 PCR 产物完全变性，就会导
基因工程作业题及答案
第二章 1. 名词解释：核酸内切酶、核酸内切限制酶、同裂酶、同尾酶、核酸外切酶、末端脱氧核苷酸转移酶 答： 核酸内切酶：是一类从多核苷酸链的内部催化磷酸二酯键断裂的酶。 核酸内切限制酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。 同裂酶：识别位点的序列相同的限制性内切酶。 同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。 核酸外切酶：是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。 末端脱氧核苷酸转移酶：可以不需要模板，在单链DNA或突出的双链DNA 3’-OH端随机 添加dNTPs的酶 2. 限制性内切核酸酶的命名原则是什么？ 答：限制性内切核酸酶按属名和种名相结合的原则命名的，即：属名+种名+株名+序号； 首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写； 第二字母：取种名的第一个字母，斜体小写； 第三字母：(1)取种名的第二个字母，斜体小写； (2)若种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替。 第四字母：若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据原来的情况而定，但用正体。 顺序号：若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、Ⅱ、Ⅲ、…等，用正体。 3．部分酶切可采取的措施有哪些？ 答：1）缩短保温时间 2）降低反应温度 3）减少酶的用量 4. 在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一个6bp 的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么? 答：回文序列是：5'-CATA TG-3， 5．什么是限制性内切核酸酶的星号活性? 受哪些因素影响? 答：Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松 动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因 条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星 活性。 概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(>5％, v／v)；(2)限制性 内切核酸酶用量过高(>100U／ugDNA)；(3)低离子强度(<25 mmol／L)；(4)高pH(8．0 以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如 Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。 第三章 1．如何将野生型的λ噬菌体改造成为一个理想的载体? 答：①删除λ噬菌体的非必需区，留出插入空间；并在余下的非必须区内制造限制酶切点 ②引进某些突变表型，作为选择标记 ③突变某些基因，使它成为安全载体 ④删除λDNA必须区段上常用的限制酶切点
2017届高考生物二轮复习基因工程与克隆技术学前诊断
“基因工程与克隆技术”学前诊断 考点一基因工程与蛋白质工程 β肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常。回答下列问题： (1)异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的__________序列发生改变。 (2)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作________(填“属于”或“不属于”)蛋白质工程，理由是该操作________________________。 (3)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的____________，以其作为模板，在______________酶的作用下反转录合成cDNA。cDNA与载体需在____________________酶的作用下，拼接构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。 (4)检测受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取________，用相应的抗体进行__________杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。 解析：(1)基因是具有遗传效应的DNA片段，遗传信息储存在基因碱基对的排列顺序中。 (2)蛋白质工程是指通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求，故题中所述不属于蛋白质工程。(3)利用逆转录法获取目的基因时，需先提取mRNA，在逆转录酶的作用下逆转录合成cDNA。cDNA与载体需要在限制酶和DNA连接酶的作用下拼接构建成基因表达载体，才可导入受体菌。(4)检测目的基因是否翻译成蛋白质，需要从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。 答案：(1)碱基对(2)不属于没有对现有的蛋白质进行改造(3)mRNA 逆转录限制酶和DNA连接(4)蛋白质抗原—抗体 2．下图是科学家利用大肠杆菌生产人胰岛素的部分过程。请结合相关知识回答问题： (1)除图示方法获得目的基因(人胰岛素基因)外，还可通过__________的方法获得目的基因。 (2)图示所获得的人胰岛素基因在大肠杆菌中不能表达，需要质粒为其提供________________等调控因子；质粒含有一个或多个__________切割位点，供目的基因插入
植物分子生物学实验技术
植物分子生物学实验技术 班级：研122班 专业：作物生物技术 姓名：陕建国 学号：20122419 授课教师：红英老师
实验一：植物DNA和RNA提取方法的讨论 一、提取植物DNA和RNA的用处 提取植物组织的DNA和RNA，分析其序列，了解序列的排列顺序可以更好的从分子水平上进行研究，从分子水平上改良植物或者说农作物的一些性状、品质等。 （一）提取植物DNA的用处 DNA的提取在植物基因工程以及植物分子生物学研究中占有重要地位，DNA 的提取效率直接决定着后续实验的成败。另外，提取植物DNA在分子育种方面也有很重要的用处。（二）提取植物RNA的用处 提取RNA 可以进行 Northern 杂交、原位杂交、RT-PCR 以及 cDNA 文库构建等很多分子生物学实验。提取RNA也是进行基因表达分析及基因克隆等分子生物学研究的基础。 二、植物组织DNA的提取方法 提取植物DNA的试验原理： 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L 的NaCl 溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。 （一）植物DNA的SDS提取法：（来自You are so late的新浪空间） 试验试剂： 1、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L 的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。 2、10×SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。 3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。 4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。 5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml 的酶液，用1mol/L HCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。 6 氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。 7、 5mol/L 高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O7 0.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。 8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。 9、1mol／L HCl。 10、0.2mol/L NaOH。 11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。