质粒转染实验步骤-2
双荧光素酶报告实验质粒转染详细步骤及说明
双荧光素酶报告实验质粒转染详细步骤及说明
1. 待测细胞在10 cm dish 中培养至80-90% 融合时，倾去培养液，用2ml PBS 洗涤细胞两次；
2. 加1ml Trypsin-EDTA solution, 混匀后，小心吸去胰酶溶液，37ºC 放置1-5分钟；
3. 加入2 ml 完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液；
4. 血球计数板计数，将细胞稀释至1×10 6 细胞/ml；
5. 取100 μl 上述细胞稀释液加入96 孔板，使细胞密度达到1×10 5 个细胞/孔，混匀后于37ºC 5% CO 2 培养24 小时；
6. 在3 个1.5 ml EP 管中各加入50 μl 无血清培养基，分别加入0.2 μg，0.4 μg，0.8 μgpEX-1 质粒，混匀；取另一1.5 ml EP 管，加入150 μl 无血清DMEM，加入1.5 μl 转染试剂，充分混匀，室温放置5 分钟后将150 μl 平均3 等份对应加入含有质粒的3个EP 管，充分混合，室温放置20 分钟；
7. 吸去96 孔板中的培养液，将转染混合物逐滴加入96 孔板中，混匀后，在培养箱中
温育5 小时；
8. 吸弃转染液，加入100 μl 完全培养液。
37ºC 5% CO 2 继续培养, 24h 和48h 观察并拍照质粒转染效果图片。
质粒(Vigofact)转染方法(针对293T细胞)
质粒（Vigofact）转染方法（针对293T细胞）一、实验材料：使用者需准备150 mM NaCl （超纯水配制，高压或过滤灭菌）或注射用生理盐水作为VigoFect及DNA的稀释液，和要转染的DNA溶液（高纯度，浓度0.1~2μg/μl）。
二、实验方法：准备培养细胞：1) 转染前24小时，接种适量细胞（接种数量可参考附表）。
至转染时细胞密度以40~60%为宜（80~90%亦可）。
2) 转染前1小时，更换新鲜的完全培养液（体积可参考附表），置37℃，5% CO2 培养。
配制转染工作液：（6孔板或35 mm平皿，2 ml培养液）3) 取5~8 μg DNA（起始用量5 μg），加入稀释液中至总体积为100 μl，轻轻混匀，室温放置。
4) 取VigoFect 1~4μl（起始用量2 μl），加入稀释液中至总体积为100 μl，轻轻混匀，室温放置5分钟。
5) 将稀释的VigoFect逐滴加入稀释的DNA溶液中，轻轻混匀，所得的转染工作液在室温放置15分钟。
6) 将转染工作液轻轻混匀，逐滴加入2 ml培养液中，轻轻混匀培养液，置37℃，5% CO2 培养。
细胞后续处理：7) 24~48小时后，观察或收取细胞。
8) 稳定转染时，于转染后24~48小时消化细胞分至3~5个培养皿中，加适当浓度的相应抗生素（如G418）筛选。
三、注意事项：1) 少量使用Vigofect时，可取精确量的VigoFect用无菌超纯水稀释一定倍数，以便精确取样量。
该稀释液可在4℃保存1月左右。
2) 细胞的生长状态是转染效率的一个主要决定因素。
在实验条件许可的情况下，使用高质量的培养液、优质血清等，可能会明显提高转染效率。
3) DNA和VigoFect的混合比例，决定了形成复合物的颗粒大小和性质；复合物颗粒的大小和性质，对细胞的DNA吸收能力有重要影响。
不同细胞达到最佳转染效率，所需复合物的颗粒大小、性质和数量，可能又有微小或很大差异。
质粒转化细胞转染步骤
转化：将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性;转染transfection:将含有目的gene的载体转到真核cell内
转导：指以噬菌体为载体,在细菌之间转移DNA的过程;有时也指在真核cell之间通过逆转录病毒转移和获得cellDNA的过程;
1.质粒转染transfection
6-well-plate每well60-70%时transfection
接种时2.5×105个/ml/well
质粒DNA转染液优化培养基opti-MEM
步骤：2.5ug质粒DNA+200ulopti-MEM+6ul转染液混匀室温静置
15min
待转染cell换优化培养基opti-MEM1.3ml,切记要轻轻加培养基,勿冲起cell
把transfectioncomplex200ul轻轻均匀滴入cell培养基中,十字形摇晃plate,混匀
37℃,CO2培养箱培养
2.
转化：外源DNA质粒作为载体导入受体细胞大肠杆菌感受态cell
步骤：
50ul感受态cell一管加入12ul质粒DNA→轻柔混合
↓
冰浴30min
↓
42℃热激90s
↓
迅速冰浴2min
↓
向管中加入培养基,混匀后37℃震荡培养﹤225rpm1h,使细菌恢复正常生长状态
↓
涂板正培1h后,倒培过夜。
小鼠质粒转染实验报告
一、实验目的本研究旨在通过质粒转染技术将特定基因导入小鼠细胞，观察基因表达情况，为后续的基因功能研究奠定基础。
二、实验材料1. 小鼠细胞系：C2C12细胞2. 质粒：pGL3-PRL基因表达质粒3. 转染试剂：Lipofectamine 30004. 实验仪器：酶标仪、显微镜、凝胶成像系统等5. 实验试剂：胎牛血清、DMEM培养基、青霉素-链霉素、Trizol试剂、RT试剂盒、PCR试剂盒等三、实验方法1. 细胞培养：将C2C12细胞接种于6孔板，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
2. 质粒准备：将pGL3-PRL质粒用无内毒素水溶解，调整浓度为500ng/μl。
3. 转染：将C2C12细胞以5×10^4个/孔的密度接种于6孔板，待细胞贴壁后，按照以下步骤进行转染：（1）将质粒与Lipofectamine 3000试剂按照1:3的比例混合，室温静置15分钟；（2）将混合液加入细胞培养液中，轻摇混匀；（3）将培养板置于37℃、5%CO2培养箱中培养6小时；（4）弃去转染液，加入新鲜DMEM培养基继续培养。
4. 重组蛋白表达检测：（1）收集转染后的细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA；（2）按照RT试剂盒说明书进行逆转录反应，合成cDNA；（3）以cDNA为模板，进行PCR反应，扩增PRL基因；（4）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察目的基因条带。
5. 荧光素酶活性检测：（1）收集转染后的细胞，用PBS洗涤两次；（2）加入裂解液，冰浴裂解细胞；（3）按照试剂盒说明书进行荧光素酶活性检测；（4）用酶标仪测定荧光值。
四、实验结果1. PCR结果：在转染组中观察到明显的PRL基因条带，而在未转染组中未观察到。
2. 荧光素酶活性检测：转染组的荧光素酶活性显著高于未转染组。
五、实验结论本研究成功地将pGL3-PRL质粒转染到C2C12细胞中，并通过PCR和荧光素酶活性检测验证了目的基因的表达。
质粒转染 (2)
质粒转染概述质粒转染是一种常用的实验技术，用于将外源基因导入至细胞内，以研究基因的功能、表达和调控等方面的问题。
质粒转染的方法多种多样，包括瞬时转染、病毒载体转染和电穿孔等。
本文将介绍质粒转染的原理、常用方法和注意事项。
原理质粒是一种环状的双链DNA分子，可在细胞内稳定复制和表达外源基因。
质粒转染的过程主要包括质粒进入细胞、转座和表达等步骤。
质粒进入细胞通常需要越过细胞膜，这可以通过瞬时破坏细胞膜以便质粒进入细胞，或者利用特定的转染试剂辅助质粒进入细胞。
质粒进入细胞后，它可以被随机插入到细胞染色体中，或者停留在高复制活性的细胞结构，如细胞核或线粒体。
一旦质粒转座完成，它可以通过自身的启动子和终止子进行转录和翻译，从而表达相应的外源基因。
外源基因的表达结果可以通过各种方法进行检测和分析。
常用方法1. 瞬时转染瞬时转染是一种将质粒暂时引入细胞内，使之表达外源基因的方法。
常用的瞬时转染方法包括钙磷共沉淀法、电穿孔法和脂质体转染法等。
其中，钙磷共沉淀法是一种经典的转染方法，通过将质粒与钙盐一起处理，形成质粒-钙磷复合物，然后将其加入到细胞培养基中，质粒可通过细胞膜破裂进入细胞内。
电穿孔法利用电场的作用破坏细胞膜，并使质粒进入细胞，脂质体转染法则是利用脂质体与质粒的亲和力，将质粒包裹在脂质体内，通过与细胞膜融合进入细胞。
2. 病毒载体转染病毒载体转染是利用病毒作为载体将质粒导入细胞内。
常用的病毒载体包括腺相关病毒（Adenovirus）、慢病毒（Retrovirus）和腺病毒（Adeno-associated virus）等。
这些病毒载体可以携带外源质粒进入细胞，将质粒插入宿主基因组中，并在细胞内稳定复制和表达。
病毒载体转染方法通常需要通过特定的包装和扩增步骤来制备，以确保足够的载体颗粒用于转染。
3. 电穿孔电穿孔是一种通过电场作用破坏细胞膜，使质粒进入细胞的转染方法。
电穿孔方法通常使用专门的电转染装置，利用高电压脉冲瞬时改变细胞膜的通透性，使质粒进入细胞。
质粒转染步骤
质粒转染步骤引言：质粒转染是基因工程中常用的实验技术之一，用于将外源基因导入目标细胞内，从而使目标细胞表达外源蛋白或产生特定的功能。
本文将详细介绍质粒转染的步骤及相关注意事项。
一、质粒制备在进行质粒转染实验前，首先需要制备质粒。
质粒通常由DNA构成，可由质粒抽提试剂盒等方法进行提取。
提取质粒的关键是确保DNA质量和纯度，以及质粒的浓度，这将直接影响到后续转染的效果。
二、细胞培养在进行质粒转染前，需要培养目标细胞。
细胞培养的关键是选择适当的培养基和培养条件，以保证细胞的健康生长。
细胞的形态、生长速度和细胞密度等因素需要在细胞培养过程中进行监测和调整。
三、质粒转染试剂的选择质粒转染试剂是实现质粒导入细胞的关键。
根据不同的细胞类型和转染目的，可以选择不同的转染试剂，如磷脂体转染试剂、聚合物转染试剂等。
在选择转染试剂时，需考虑其转染效率、细胞毒性和适用细胞类型等因素。
四、质粒转染步骤1. 细胞处理：将培养好的细胞用适当的培养基洗涤，并吸取适量的细胞悬液。
2. 质粒与转染试剂的混合：将提取好的质粒与转染试剂按照一定比例混合，形成转染复合物。
注意避免过高的转染试剂浓度，以免对细胞产生毒性影响。
3. 转染复合物的加入：将转染复合物缓慢加入细胞悬液中，充分混合，并保持一定的转染时间。
转染时间的长短需根据实验要求来确定。
4. 转染条件的优化：根据实验需要，可以对转染条件进行优化，如转染时间、转染温度、转染复合物的浓度等。
5. 转染后的培养：转染完成后，将细胞悬液转入含有适当选择性抗生素的培养基中进行培养，以筛选成功转染的细胞。
五、转染效果的验证转染完成后，需要进行转染效果的验证。
常用的验证方法包括荧光显微镜观察、蛋白质表达分析、PCR验证等。
根据实验要求，选择合适的验证方法，评估转染效果。
六、注意事项1. 转染试剂的质量需经过严格检测和筛选，确保其稳定性和转染效率。
2. 转染过程中需注意无菌操作，避免细菌、真菌等污染对实验结果的影响。
gfp-lc3质粒转染细胞步骤
gfp-lc3质粒转染细胞步骤
一、实验步骤:
实验步骤分为四个环节,依次是:接种细胞，准备gfp-lc3 DNA，脂质体复合物，共培养，检测转染效率。
1、接种细胞:
（1 )细胞悬液浓度调整为1-2 x 105备用,取六孔板置于超净台面上,每孔接种细胞悬液2ml ,培养过夜。
（2 )观察细胞状态:细胞形态均一, 边界清晰,密度达到80%左右的汇合度为最适转染状态。
（3 )将细胞培养板放回培养箱待用。
2、准备gfp-lc3复合物;
1 参照脂质体使用说明书: 6孔板选择转染体系为每孔加入4ugDNA和10ul转染脂质体，分别溶解在250ul体系当中。
然后分别加入12ul质粒DNA和30ul脂质体,做好标记。
2 2min后,待溶液均一,将脂质体溶液全部吸出,滴加到质粒DNA溶液中，吹打混匀。
静置,室温下孵育20min ,以待gfp-lc3复合物的形成。
3、gfp-lc3 复合物与细胞共培养:（1 )取出细胞培养板,吸弃培养孔内培养液。
（2 )吸取制备好的DNA-lipid混合液,每孔加入500ul转染体系。
（3)轻轻摇晃混匀，然后补充1mlopti-MEM,盖好盖子放入培养箱培养。
4、检测转染效率。
（1 ) CO2培养箱里取出培养板,进行荧光显微镜观察,观察细胞状态。
（2 )切换到激光光源观察绿色荧光,拍照。
转染质粒步骤
转染质粒步骤嘿，你问转染质粒步骤啊？那咱就来好好说说。
这转染质粒啊，可得小心仔细地来。
首先呢，得准备好要转染的质粒和细胞。
质粒就像是一个小包裹，里面装着我们想要送进细胞的东西。
细胞呢，就像是一个小房子，我们要把质粒送进去让它发挥作用。
把质粒和细胞都准备好，放在合适的地方，就像准备好要去旅行的行李和目的地一样。
然后呢，要选择合适的转染试剂。
转染试剂就像是一个小快递员，能把质粒送进细胞里。
有很多种转染试剂可以选择，得根据自己的实验需求来挑。
就像你去寄快递，得选一个靠谱的快递公司一样。
接着，把质粒和转染试剂混合在一起。
这时候要注意比例哦，不能太多也不能太少。
就像做菜放盐一样，得放得恰到好处。
把它们混合好后，让它们在一起待一会儿，就像让两个新朋友互相认识一下。
然后把混合好的质粒和转染试剂加到细胞里。
可以用移液器慢慢地加，不能太急。
就像给花浇水一样，要轻轻地浇。
加完后，把细胞放在合适的环境里，让它们好好相处。
在这个过程中，要注意观察细胞的状态。
看看它们有没有不舒服，有没有出问题。
就像你照顾一个小宠物一样，要时刻关注它的情况。
打个比方吧，转染质粒就像给细胞送一个神秘的礼物，每一步都得小心谨慎。
我给你讲个例子哈。
我有个朋友在实验室做转染质粒的实验。
一开始他不太会，弄得手忙脚乱的。
后来他认真学习了步骤，一步一步来，终于成功了。
他可高兴了，觉得自己像个小魔法师。
从那以后，他对转染质粒的步骤记得牢牢的。
所以啊，转染质粒的步骤很重要呢，大家做实验的时候一定要认真仔细。
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质粒转染大肠杆菌
材料试剂：
胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调pH），氨苄青霉素，卡那霉素，质粒提取试剂盒
仪器：
高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅，，恒温摇床（37℃,225rpm），无菌培养板，消毒
1."5ml离心管，消毒枪头，无菌操作台
实验步骤：
1.LB培养基的配制：
在950ml去离子水中加入:
胰化蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g摇动容器直至溶质溶解.用
5mol/LNaOH调pH至
7."
0.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.
固态培养基
LB固体培养基及倒板：
（1）.配制：100mlLB培养基加入
1."5g琼脂粉
（2）.抗生素的加入：
高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为50μg/ml），以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
（3）.倒板：
一般10ml倒1个板子。
培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。
（4）.保存：
用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。
2.从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。
3."加入质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10μl），轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。
4.42℃水浴中热击45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
5.向管中加入1mlLB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr）。
6.将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
同时做两个对照：
对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。
此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
大肠杆菌的扩增
1.从LB平板上挑取新活化的单个菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。
将该菌悬液以1：100-1：50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD600＝
0."5左右。
2.取上述培养液置于冰中10min，之后转移到已灭菌的50ml离心管中再于冰上放置5min
3.于4℃离心，2700rmp，10min，弃上清，收集细菌
4.质粒的提取
准备大肠杆菌质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液
5.质粒鉴定（琼脂糖凝胶电泳）
质粒转染细胞株
材料
细胞株、质粒、培养基、链霉素/青霉素（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS （磷酸盐缓冲溶液）、胰酶/EDTA消化液、转染试剂（Lipofectamine TM2000）
实验步骤
Ⅰ.准备细胞：
贴壁细胞：
转染前24 h，在500 µL无双抗完全培养基中接种
0.5-2×105个细胞，转染时细胞融合度为80 - 90%。
(注：
铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长。
)
II．对于每个转染样品，按下面的方法准备：
（1）用50µLOpti-MEM稀释
0."8µg质粒DNA，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5 min。
（2）轻轻颠倒混匀转染试剂，用50 µL Opti-MEM稀释
2."0 µLLipofectamineTM2000，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min。
（3）混合转染试剂和质粒DNA稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min。
注:
转染复合物一旦形成，应立即加入培养皿中进行细胞转染。
（4）转染复合物加入到24孔细胞板中，100µL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。
（5）将细胞板置于37℃、5%CO2培养箱中培养6 h左右，进行换液，换成含10%血清的普通培养基，在37℃，5％CO
2孵育箱中继续培养24h左右。
稳定转染细胞株的筛选（各种细胞用什么抗生素筛选呢）
从37℃，5％CO
2孵育箱中取出培养皿，弃去含转染试剂的培养基，用PBS冲洗细胞2遍，胰蛋白酶消化，接种1/2的细胞到100 mm培养皿中，加入含500 µg/ml G418的新鲜培养基，每2-3天更换一次新的筛选培养基，每天观察细胞的死亡情况。
当正常细胞完全死亡后，换用新的不含G418的培养基培养。
每天观察细胞生长状态。
在细胞达到60%汇合率时再用含500 µg/ml G418的培养基筛选一次。
当细胞达到90%以上汇合率时将细胞转移至培养瓶中继续培养（转染后10-12天左右）。
以后每隔4-5天再用含500 µg/ml G418的培养基筛选。
直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后可以收集样品（约转染后15天左右）。
以后继续培养时加入的G418浓度降一半。