生物技术制药综合实验报告

生物技术制药实验报告

人表皮生长因子（hEGF）在大肠杆菌中的

表达与纯化

生物与制药工程学院

罗飞

2016年7月2日

目录

第一节引言 (4)

1.1表皮生长因子(EGF)概述 (4)

1.2 表皮生长因子(EGF)的结构与性质 (4)

1.3 EGF的生物学效应及应用 (5)

1.4 本实验课程设计的目的与内容 (6)

第二节EGF基因的合成与转化表达 (7)

2.1.实验原理 (7)

2.2实验材料与方法 (8)

2.2.1 试剂材料及试剂 (8)

2.2.2 仪器设备 (8)

2.3 实验方法 (9)

2.3.1 试剂及培养基配制方法 (9)

第三节、实验前的准备 (9)

3.1目的基因hEGF的设计与合成 (9)

3.2载体选择 (11)

3.2.1载体选择主要考虑下述3点： (11)

3.3酶切位点设计 (12)

3.3.1载体的结构 (12)

3.2.2酶切位点设计注意以下 (13)

3.2.3 酶切位点的确定 (13)

3.3 引物设计 (14)

3.3.1 PCR引物设计的基本原则 (14)

3.3.2 引物设计 (15)

第四节、实验篇 (16)

4.1整体实验过程 (16)

4.1.1实验整体流程： (16)

4.1.2 简化后的并行流程 (16)

4.2、小组结果展示 (17)

4.2.1大肠杆菌转化实验结果 (17)

4.2.2 XL10质粒电泳结果显示 (18)

4.2.3 单酶切实验结果显示 (18)

4.2.4 PCR结果显示 (19)

4.2.5 SDS-page 电泳结果展示 (20)

4.3、个人负责实验模块 (20)

4.3.1 提取重组质粒 (20)

4.3.2 电泳检测质粒DNA (21)

4.3.3 双酶切并检测 (21)

4.3.4 EGF基因的PCR扩增验证 (21)

五、小组讨论篇 (23)

5.1 质粒电泳检测讨论 (23)

5.2 酶切条件讨论 (24)

5.3 PCR体系的讨论 (26)

5.4 SDS-page电泳讨论 (28)

六、实验总结 (29)

6.1 理论与技能收获 (29)

6.1.1理论收获 (29)

6.1.2 实验技能的收获 (30)

6.2 科学兴趣的向往 (31)

第一节引言

1.1表皮生长因子(EGF)概述

生长因子在人体中的信号传导部分起着关键的作用，它可通过与细胞表面的蛋白质受体结合，参与细胞的各种生命活动。生长因子可以是维生素，碱基，多肽等。所研究的表皮生长因子，就是一种人机体细胞合成的一种多肽。在生物体内，每个细胞的生长状态不同，在不同组织中的细胞的表皮生长因子参与生长、增值、死亡等过程。

目前，表皮生长因子已得到广泛应用。在许多公司已经开始研发甚至是生产出EGF，多种疾病的诱发原因很多，我们可以用EGF来进行详细的诊断。之后致病的查出原因，给病人减少心理的压力，带来一线生机。在经过强烈的光刺激后，尤其是激光，人们的眼部会有很大的损伤，最严重的就是眼角膜损伤，无法修复。人体在经过紫外线的照射下皮肤的损伤以及高温、蒸气、火等造成的皮肤大面积与原来的不一样的皮肤。对于这些伤害，我们可使用含有可促进人体表皮细胞的新陈代谢EGF的药膏或者是化妆品，使皮肤变得如初。

在最早研究表皮生长因子的时候就只是证明是多肽，还没有命名。是由Cohen在1960年，在提取神经生长因子时，意外发现除此种物质以外的一种多肽[2]。多个科学家对其充满好奇心，在之后的十年内，Savage真正的研究清楚，命名此种多肽为表皮生长因子。

1.2 表皮生长因子(EGF)的结构与性质

不同的生物中，表皮生长因子的蛋白一级结构不同。研究表明家族成员一般在多于50个氨基酸，而少于80个氨基酸，与我们所熟悉的胰岛素一样，表皮生长因子是由前体加工成的成熟的多肽，在具有生物活性[4]。如人体中的表皮生长因子是由53个氨基酸组成。

整个hEGF分子由两个结构域组成。残基1～33，形成N一端结构域；34～53为C一端结构域；成熟hEGF的序列位于单链多肽的C一末端附近，由53个氨基酸残基组成，并且其C一端和N一端分别由Arg／Asp ／Arg／His邻接，故

成熟的EGF分子，可以经专一性Arg内肽酶的作用，从前体释放[6]。二级结构上存在着反平行β片层结构是EGF骨架的常见结构，N一端和C一端在整个三维结构中不会发生什么变动，维持此结构的是由三个二硫键[7]（由于6个半胱氨酸的存在），因此分子在一定的条件下生物活性表现“顽强”[8]。我们知道同一种酶在不同的生物中有不同的生物效应，同时不同的酶在不同的生物中会有相同的生物效应，hEGF也会有此种现象。hEGF-β和hEGF-γ是hEGF的两种形式，在分子结构和同源性中相似度高，在蛋白中一级结构中即使是在C末端的某个位置上仅仅只有一个Arg的差别，当它们作用于不同细胞中的同一个受体，在生物体中的作用是一样的[9]。

与许多古细菌中的酶一样如生活在温泉中古细菌，人体表皮生长因子在100℃煮沸达到30 min，仍然能保持结构、活性等稳定性；许多蛋白质在具有强列的催化效率的酶如胰蛋白酶作用下肽链被断掉，而表皮生长因子耐它的消化。EGF在狭小的活性微环境中，由于常见的丙氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸[11]会提供作用基团，表皮生长因子才能与受体结合反应。多肽具有N端和C端，有的在生物活性中不起作用，有的是至少有一段起作用，据研究表明，表皮生长因子结构的两端在细胞的生长中都很重要。

1.3 EGF的生物学效应及应用

细胞通过在信号传导的过程中有多种方式包括直接或间接的接触。自分泌或旁分泌是hEGF作用的方式，在生物体内它亦可以与其他的因子结合作用于细胞。EGF 生物效应很多，如下所述：

1.来源于人体的不同种组织的上皮细胞为了适应人体的需要，从基因上赋予它很高分裂效率。EGF在其中起着关键性的作用。首先人体的皮肤表层会产生脱皮现象，证明有大量的细胞死亡。同样，皮肤的表面受到伤害在愈合的过程会结痂，新的皮肤又长出来了。EGF在创伤修复中起着功不可没的作用，在肝脏、肠道、角膜、胃等多种组织创伤的恢复的试验研究[12]取得重大的突破，在临床上已经运用于烧伤、烫伤、创伤及外科手术伤口的愈合，使病人的痛苦少一点。

2.眼睛是我们重要的部分，眼睛的部分受到伤害特别是眼角膜，是我们最担心的。在现实生活中，很多病人由于眼角膜的伤害再加上眼角膜的捐献者少之又少无法得到修复。实验研究结果表明，适宜浓度的hEGF滴眼液，能通过刺激角膜上皮细胞及基质成纤维细胞的增生与迁移和促进细胞外基质与胶原纤维增生，使损伤修复速度加快，从而辅助修复角膜[13]。

3. 研究表明，多数肿瘤的发生、发展，与EGF之间存在一定的关系。细胞中存在原癌基因和抑癌基因，癌变可能由于这些基因的突变细胞，使细胞生长不受控制。肿瘤细胞表面的EGF受体属于多聚体受体，多个EGF的表达之后与受体结合，使细胞不停的生长，这样，与胃癌、乳腺瘤、黑色素瘤的恶性程度增加[14]。

4.是药三分毒，我们吃的要中有些药对人的胃刺激很大。实验表明：在人的胃溃疡中受损伤的细胞与保护药硫酸铝相结合，可以使溃疡有较高浓度的内源性EGF表达，从而促进溃疡愈合。

1.4 本实验课程设计的目的与内容

1.实验课程设计目的：

本实验课程设计重在学生自己动手设计实验，老师起辅助指导作用，旨在训练学生对专业综合知识的运用。学生需查阅文献和数据库来设计与理解设计方案，主要考察学生对基因分子克隆、表达、发酵和蛋白分离知识的理解与应用，以培养学生的专业综合知识应用与实验动手操作能力。

2.实验课程设计内容：

以表皮生长因子（EGF）为例，让学生从基因的设计入手，合成出完整的EGF基因，然后表达并纯化出该EGF蛋白。主要内容简述如下：（1）通过NCBI数据库网站设计出完整的EGF基因，并设计出引物；

（2）pET-28a衍生质粒为载体、将EGF基因转化如大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌中，并通过双酶切和PCR挑选验证转化子；

（3）诱导重组大肠杆菌表达hEGF蛋白；

（4）经超声破碎提取、SDS-PAGE电泳检测

（5）采用镍柱纯化，进而获取hEGF蛋白纯品。

第二节EGF基因的合成与转化表达

2.1.实验原理

人源表皮生长因子（hEGF）来源大致有三个方向：一是来源于人体代谢物的提取；二是来源于化学合成；三是来源于基因工程生产技术，这也是近些年来可以大量生产获得hEGF的方法。前两种方式得到的产品都只有很低的纯度，并不能在实际应用中发挥很大的价值。。

目前已知的研究中，hEGF基因在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母以及动植物等宿主系统中已经成功克隆表达。以pET等衍生质粒为载体、以BL21(DE3)为表达宿主菌的表达系统是发展较成熟的大肠杆菌表达系统之一, 它采用T7 强启动子, 在IPTG 诱导下, 启动外源基因的高转录。pET载体有pET32a（±）和pET28a （±）等系列。下图1为PET28a质粒载体的物理图谱。

2.2实验材料与方法

2.2.1 试剂材料及试剂

琼脂粉、NaCl、蛋白胨、酵母浸粉、1 mol/L NaOH溶液、双蒸水、10 mg/mlKana 母液、PET-28a菌种、E.coli DE3菌种、酒精、含质粒载体的PET-28a菌液、小型质粒快速提取试剂盒（离心柱型）、Goldview、BIOWEST AGAROSE、loading buffer（6×）、Hind ⅢDNA Marker、TAE电泳缓冲液（1×）、0.1 mol/L CaCl2溶液、Zde I酶(10U/μl)及其10× Buffer、Xhol酶(10U/μl)及其Buffer D 10×、GenClean 柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、5 U/μlTaqDNA聚合酶、PCR缓冲液（10×，含Mgcl2）、dNTP混合物、上游引物、下游引物、无菌双蒸水、1 mol/l 的异丙基硫代半乳糖苷（TPTG）、PBS（1×）、SDS-PAGE蛋白凝胶配制试剂盒：30% Acr-Bis（29:1）、1.5 M Tris-Hcl，pH 8.8、10% SDS、10% 过硫酸铵(AP)溶液、TEMED、1 M Tris-Hcl，pH6 .8；2×上样缓冲液、1× Tris-甘氨酸电泳缓冲液、考马斯亮蓝染色液、脱色液Ⅰ（45% 甲醇：10% 乙酸：45% 蒸馏水）、脱色液Ⅱ（5% 甲醇：7% 乙酸：88% 蒸馏水），双蒸水

2.2.2 仪器设备

试管、量筒、天平、药匙、称量纸、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、恒温生化培养箱、涂棒、接种环、酒精灯、pH试纸、记号笔、麻绳、棉花、报纸、镊子、滴管、10 ml移液管、恒温摇床、Eppendorf管、微量移液器、枪头、高速离心机、电泳仪、电泳槽、水平凝胶电泳槽和梳子以及其制胶模块、250 ml锥形瓶、微波炉、凝胶成像系统、分光光度计、制冰机、冰盒、恒温水浴锅、超净工作台、水漂、0.2 mlPCR微量管、双面微量离心管架、PCR仪、紫外检测仪、脱色摇床、台式冷冻离心机、垂直电泳槽及配套的玻璃和密封条、梳子、1.5 ml微量离心管、搪瓷盘

2.3实验方法

2.3.1 试剂及培养基配制方法

1. 卡那霉素母液（10 mg/mL）的配制：称取10 mg卡那霉素溶解于1ml无菌水中，然后采用无菌过滤器过滤后分装于Eppendorf小管中。

2. 培养基的配制

（1）LB培养基：配方(固体培养基加琼脂粉）

含卡

那霉

素

（Ka na）LB 固体培养基：将配好的LB 固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Kana 储存液，使终浓度为50μg/ml，摇匀后铺板。

（3）含Kana 的LB液体培养基：每15mL LB液体培养基分装至试管中，高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Kana 母液，使终浓度为50μg/ml）

第三节、实验前的准备

3.1目的基因hEGF的设计与合成

（1）目的基因获取

登陆GenBank查询

获得的目的基因片段为：aatagtgactctgaatgtcccctgtcccacgatgggtactgcctccatgatggtgtg tgc

atgtatattgaagcattggacaagtatgcatgcaactgtgttgttggctacatcggg gag

cgatgtcagtaccgagacctgaagtggtgggaactgcgc

3.2载体选择

3.2.1载体选择主要考虑下述3点：

【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】载体的类型：

（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。（3）对原核表达载体应该注意3点：

①选择合适的启动子及相应的受体菌；

②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；

③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。

选用质粒（最常用）做载体的4点要求：

①选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；

②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。

③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；

④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。

根据本实验要求和目的：通过基因工程技术，将人表皮生长因子基因通过转化、诱导促使大肠杆菌表达人的表皮生长因子，最终分离纯化得到目的物，因此应该选择表达载体，使最终产物方便提纯的载体如含有His-tag。

3.3酶切位点设计

3.3.1载体的结构

图2-1

图2-2

3.2.2酶切位点设计注意以下

（1）酶切位点的设计要使表达通读

（2）前后位点尽量选用相同的酶切buffer和温度

（3）用于表达，一定要保证读码框的正确，是否加起始密码子终止密码子都要根据载体的情况认真考虑。

（4）两个酶切位点最好远点大概20BP左右，不然不好切不好连酶切位点尽可能选一些效率高的酶，否则你得加一长串的保护碱基

3.2.3酶切位点的确定

经过Blast发现Xho I与Nde I这两个酶切位点在目的基因中都没有；根据网上相关资料Xho I与NdeI具有相同的缓冲溶液都为10xH buffer；具有相同的酶切温度都为37℃；根据图2-1可以看出两个酶切位点相隔70bp ，相隔距离足够远；考

虑到目的产物是利用Ni+亲和层析的方式提取，需要6xHis-tag标签，从图2-2可以看出Xho I酶切位点后紧跟着一个6xHis-tag标签，这个满足后续的分离纯化；选用Xho I与Nde I位于启动子和核糖体结合位点下（rbs），能够保证目的基因被转录出；Nde I的酶切位点为5' CA^TATG 3'，其ATG进转录和翻译对应着起始密码子AUG，可以避免使目的产物发生移码现象，保证了读码框正确性，所以选择了Xho I与Nde I这两个酶切位点，来构建基因表达载体。

3.3 引物设计

3.3.1 PCR引物设计的基本原则

1、引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不能大于38bp；

2、引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm 值曲线以选取72度附近为佳，5'到3’的下降形状也有利于引物与模板的结合；

4、ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，3'端的ΔG值相对要低，且绝对值不要超过9，否则不利于正确引发反应，3'末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，但在-6时只达到40%，-8时少于20%，-10时接近于0；

5、错配率一般不要超过100，否则会出现非目的条带。但对于某些特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为340以上，而在错误位点的引发效率为110，并且不好找到其他更合适的引物，那么这对引物是可以接受的；

6、Frq曲线为Oligo6软件新引进的一个指标，解释了序列片段存在的重复几率大小，选取引物时，应该用Frq值相对较低的片段；

7、引物二聚体及发卡结构的能量的绝对值一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体而且会降低引物浓度从而导致PCR不能正常发生；

8、3'端最好不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发，同时3'端最后一个碱基最好不要是A或T，若是，会导致错配；

9、以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5计算Tm值，也就是退火温度。选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度，最好保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范围内；

10、模板与稳定性较小的引物之间的Tm的差异越小，PCR的效率越高。因为解链温度也取决于它的长度，如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用端的引物（16-18bp），如果产物长5kb，则用24bp的引物；

11、在DNA测序和PCR中最好用5'末端稳定（GC含量多），而3'端不稳定（AT 含量多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应；

12、引物和产物之间的Tm值相差别太大，20摄氏度范围内最好。

13、对引物的修饰一般在5'端进行，例如加酶切位点，加酶切位点的同时要根据需要添加保护碱基。

3.3.2 引物设计

(1).利用Primer6.0软件进行引物：验证实验引物

F：5’-AGTGACTCTCAATGTCCC-3’

R: 5’ -TTCCCACCACTTCAGGTCTC-3

其评分为poor，但是该序列只有CDR区，设计引物最好从头开始，不然在PCR 的过程中目的基因会被变短。

所以引物为：

Forward：5’- CGC CATATG AAT AGTGACTCTCAATGTCCC-3’

Reverse: 5’ –CCG CTCGAG CACGAG TTCCCACCACTTCAGGTCTC-3’

第四节、实验篇

4.1整体实验过程

4.1.1实验整体流程：

（1）利用试剂盒进行XL10质粒提取

（2）对XL10的质粒进行电泳检验、双酶切检验和PCR验证

（3）大肠杆菌（DE3）感受态的制备

（4）大肠杆菌DE3的转化

（5）转化结果结果检验

（6）转化菌种IPTG诱导表达

（7）诱导前后SDS-Page电泳鉴定

（8）利用镍柱对蛋白质进行纯化，得到目的产物

4.1.2简化后的并行流程

由于本实验为一个大型实验，时间限制，我们分组进行实验，老师提供了XL10，已经转化好的DE3和空宿主DE3，所以实验可以进行小组分配，多个模块同时进行，加快实验进度。

4.2、小组结果展示

4.2.1大肠杆菌转化实验结果

转化结果成功，在含卡拉的培养基上成功生长

4.2.2 XL10质粒电泳结果显示

跑出的结果为质粒提取成功，条带大小位于5000bp—6000bp 第一个条带为DＬ500，最后一个条带为ＤＬ10000其他均为所提质粒

4.2.3单酶切实验结果显示

从左到右依次为：DL10000，空载体，提取质粒，提取质粒

单酶切成功：提取质粒含有目的基因，而空载体不含有目的基因，都经单酶切后，在电泳中的迁移速度不一样，空载体要大于所提取的质粒。

4.2.4PCR结果显示

从左到右依次为：PCR产物，PCR产物，PCR产物，DL500

PCR条带在maker的150到200条带见

4.2.5 SDS-page电泳结果展示

实验结果失败，分析见小组讨论

4.3、个人负责实验模块

个人主要负责第一个大模块——XL10，从质粒抽取到最终的PCR酶切验证。验证质粒是否提取成功，验证目的基因是否存在与载体上。

4.3.1提取重组质粒

（1）在灭菌后的无菌操作台中，取15ml分装至试管中的、灭菌后的LB液体培养基，加入卡那霉素母液150μL，保证它在培养基中为50μg/mL。

（2）将含目的基因的重组质粒的穿刺菌XL10接种无菌LB培养基（含50μl/mL 卡那霉素），37.C摇床过夜培养（不能超过15h）。

（3）取收取的2ml 的菌液于2mlEp管中，用于提取质粒。

（4）提取质粒，按质粒小量制备试剂盒操作说明书操作。