DNA的分子特性与利用

第二章 DNA的分子特性与利用 的分子特性与利用 一、脱氧核糖核酸 二、DNA变性 三、复性与杂交 四、DNA的复制 五、 DNA的损伤与修复 六、DNA的分离和提取 七、一些基本概念一、脱氧核糖核酸生物界中，每一个细胞（成熟的红细胞除外）都含有 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），甚 脱氧核糖核酸（d ib l i id DNA） 甚 至有些病毒虽然没有细胞结构，也含有DNA。

DNA携带着决定生物遗传、细胞分裂、分化、生长以及 蛋白质生物合成等生命过程的控制信息。

碱基配对是DNA分子结构的重要特性，这意味着两条链 的碱基序列是互补的，即 A-T，C－G。

的碱基序列是互补的 即 A T C G DNA双股螺旋的两条多核苷酸链是反向平行的，即一条 链的3′-OH端与另一条链的5′磷酸端相邻。

如一条链的碱基顺序是AATGCT，另一条链按同一方 如一条链的碱基顺序是AATGCT 另一条链按同一方 向阅读的顺序就是TTACGA。

p16是染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。

被称为“遗传微粒”，因为在繁殖过程中，父代把它们 自己DNA的一部分复制传递到子代中，从而完成性状的 传播。

原核细胞（无细胞核）的DNA存在于细胞质中，而真核 原核细胞（无细胞核）的DNA存在于细胞质中 而真核 生物的DNA存在于细胞核中， DNA是由两条单链像葡萄藤那样相互盘绕成双螺旋形， 根据螺旋的不同分为A型DNA，B型DNA和Z型DNA DNA分子有四种不同的核苷酸结构，它们是 腺嘌呤（adenine，缩写为A）， 腺嘌呤（ d i 缩写为A） 胸腺嘧啶（thymine，缩写为T）， 胞嘧啶（cytosine，缩写为C）， 鸟嘌呤（guanine，缩写为G） 。

DNA N 的 三 种 主 要 构 象在B、A等右手双螺旋构型中，糖苷键均为反式构象。

而Z－DNA中嘧啶糖苷键 仍为反式构象，而嘌呤糖苷键为顺式构象。

A-DNA、B-DNA、Z-DNA不只是代表了单一构象，而是代表了一组相关构象， 这一组相关构象称为构象家族。

天然DNA分子在生物体内存在形式有：线形：真核生物的染色体DNA， 真核生物的染色体 部分原核生物的染色体DNA环状（ccc-DNA）：大部分原核生物的染色体DNA， 大 原核生物的染色体 全部线粒体和叶绿体DNA， 细菌的质粒DNA病毒和噬菌体：线形DNA/环状DNA ccc-DNA；oc-DNA；l-DNAp19二、DNA变性DNA变性(p17) 是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成 是指双螺旋之间氢键断裂 双螺旋解开 形成 单链无规则线团，因而发生性质改变（如粘度 下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增 下降 沉降速度增加 浮力上升 紫外吸收增 加等），称为DNA变性。

条件： 加热； 改变DNA溶液的pH； 有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺 等）等理化因素。

等）等理化因素描述DNA特性所常用的两个量 ： 增色效应（hyperchromic effect） 通常，可利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化追踪变性过程。

因为 DNA在260nm处有最大吸收值这一特征是由于含有碱基组成的缘故，在DNA 双螺旋结构模型中碱基藏于内侧，变性时由于双螺旋解开，于是碱基外露， 260nm紫外吸收值因而增加，这一现象称为增色效应。

DNA的增色反应融解温度（melting temperature, Tm）p18如果升高温度使DNA变性，以温度对紫外吸收作图，可得到一条曲线，称 为溶解曲线。

由图可见当温度升高到一定范围时，DNA溶液在260nm处的吸光度突然明 显上升至最高值，随后即使温度继续升高，其吸光度也无明显变化。

由此说明DNA变性是在一个很窄的温度范围内发生，增色效应是爆发式的。

说明 变性是在 个很窄的 度范围内发 增 效应是爆发式的 从而也说明当达到一定温度时，DNA双螺旋几乎是同时解开的。

通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度（即熔解曲线中点 对应的温度），由于这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温 度（melting temperature, Tm）。

因此Tm是指消光值上升到最大消光值 一半时的温度。

Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关：pH、离子强度和DNA的碱 基比例。

DNA的Tm值DNA的Tm值与以下因素有关： 1）DNA的均一性：均一DNA如病毒DNA，解链发生在很窄的范 围内，而不均一的DNA如动物细胞DNA其Tm值的范围则较宽。

2）DNA分子中（G+C）的含量：一定条件下DNA的Tm值，由 G+C含量所决定，因为G+C之间有3个氢链，因此G+C含量较高 的DNA，Tm值较高，二者的关系可用以下经验式表示： %（G+C）=（Tm-63.0）×2.44。

实验表明DNA分子中（G+C）克分子含量百分比的大小与Tm 值的高低呈直线关系，见图。

3）溶剂的性质：Tm不仅与DNA本身性质有关，而且与溶液的条 件有关，通常溶液的离子强度较低时，Tm值较低，融点范围也 较宽，离子强度增高时，Tm值长高，融点范围也变窄。

因此， DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中，一般保存在1 M NaCl溶液中较稳定。

DNA的Tm值与G-C含量的关系三、复性与杂交变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新 结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性 （renaturation）或退火（reannealing）p18 复性是基因工程中很有意义的特性 ： 显示不同生物体间的遗传相关性 ； 检测特定的DNA ； 考察某些序列在特定生物体DNA中是否出现一次 以上 ； 确定特定碱基序列在DNA中的位置等。

复性必须有两个条件 ： ①盐浓度必须高到足以消除两条链中的磷酸基团的静 电斥力，通常用 0.15～0.5 M NaCl。

②温度必须高到足以破坏其随机的链内氢键，但温度 不能太高，否则不能形成和维持稳定的链间碱基配对。

杂交（hybridization）： 当复性DNA分子由不同的两单链分子形成时， 复性称为杂交热变性过程和两种冷却过程示意图四、DNA的复制细胞分裂的遗传物质准确地进行复制并代代相传。

DNA不仅能准确复制，而且复制速度很快： 因为DNA双链打开后，每一条单链都可以作为模 板，合成两条结构完全相同的双股 板，合成两条结构完全相同的双股DNA链 ； 链 细菌细胞每秒钟约有500个dNTP发生作用，哺乳 动物细胞每秒钟约有50个dNTP发生作用。

复制的准确性及快速是由于复制过程的进行有其特定 的方式，有多种酶及复制因子参与反应 －－DNA的复 制过程十分复杂 。

复制起始点（origin，ori）：每一种生物 每一种生物DNA的复制总是从特定的位点起始， 这 的复制总是从特定的位点起始， 个位点具有一定的核苷酸序列，将此核苷酸序列区 称为～ (P20) 。

原核生物只有一个起始点，而真核生物具有多个复 制起点。

复制子（复制单位）p21：从复制起始点开始复制出一个DNA分子或一个DNA 片段的核苷酸序列称为～ 片段的核苷酸序列称为 (P21) 。

DNA半保留复制Figure 12.7a•Characteristics of replication in E. coli:– At the replication fork, DNA polymerase III th li ti f k l builds the new strands in the 5’-3’ direction. – New nucleotides are only added to 3’ hydroxyl groups of other nucleotides. (creates a problem)Formation of the leading strand3' 5' Newly synthesized leading strand DNA polymerase III 5' 3'5' Replication forkFigure 12.7b3 3' 5'Formation of lagging strandLagging strands5 5' 3'3' 5' 3' 5'DNA polymerase IIIOkazaki fragments5' 3' DNA polymerase III beginning synthesis of new fragment3' 5' Gap五、 DNA的损伤与修复见另 个文件 见另一个文件六、DNA的分离和提取溶解法 层析法 电泳法 超速离心法§6.1 DNA的提取由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、 由于提取DNA的目的 种类 所用的生物 组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯 有很多方法。

其中最常用的是碱抽提法。

有很多方法 其中最常用的是碱抽提法(1) 准备生物材料大肠杆菌质粒DNA：菌液培养至对数生长后期 植物DNA：幼嫩植株（暗培养1-2d，甚至黄化苗） 肝脏DNA：清除净胆囊p26(2) 裂解细胞预处理：液氮中研磨 溶菌酶 NaOH和SDS 煮沸处理 冰冻处理 超声波处理(3) 分离和抽提DNA最有效的方法：氯化铯梯度离心§6.1.1 §6 1 1 质粒DNA的提取plasmid DNA l idGenomic DNAThe genomic DNA of E coli: a single circular double-stranded DNA, E. double stranded DNA with the contour length about 850 times longer than the cell.1 .碱抽提法提取质粒DNA 碱抽提法提取质粒 （1）原理 变性 强碱 中性 复性 闭合环状的质粒DNA，在变性后不会 分离，复性快； DNA单链DNA双链染色体线性DNA和或有缺口的质粒 DNA变性后双链分离，难以复性而形成 缠绕的结构 与蛋白质 缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结 复合物结 合在一起，在离心的时候沉淀下去。

变性（2） 所用的试剂作用 ① 溶菌酶 能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽 聚糖中的β-1，4糖苷键。

聚糖中的β 1 4糖苷键 在碱性条件（pH>8）下有活性。

② 葡萄糖 增加溶液的粘度，维持渗透压，防止 DNA受机械力（震荡）的作用而降解。