发酵工程学：实验三 发酵过程动力学实验
实验三发酵过程动力学实验
实验老师准备：
1、种子培养基（实验老师准备4个100ml种子）
2、产酶培养基确定（实验老师准备15瓶100ml产酶培养基和200ml已经长好
的种子），培养基的组成按上次实验配方设计。
一．实验目的
学习生物反应过程的参数测定和计算方法
二．仪器
摇床（最大转速250r/min），紫外分光光度计、电热恒温水浴槽、烘箱
电子天平（感量0.001g）
三．试剂
1、DNS试剂：取6.3g3,5-二硝基水杨酸（DNS）和262mL2mol/LNaOH溶液加到酒石酸钾钠的热溶液中（192g酒石酸钾钠溶于500 mL水中），再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌使其溶解，冷却后加水定容至1000mL，保存于棕色瓶中放置7天后使用。
2、测定蛋白酶活试剂同上次实验。
三．实验方法
1、生物量的测定
生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。
本实验采用直接称重法。
将发酵液取出，在两层纱布上过滤菌体，自来水冲洗2-3次，收集菌体，在布氏漏斗上抽干后称温重。
2、还原糖的测定
2.1原理
在碱性条件下，还原糖与3、5－二硝基水杨酸共热，3、5－二硝基水杨酸被还原为3－氨基－5－硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它物质。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系，可在722型分光光度计540nm波长测定棕红色物质的吸光度值。
查标准曲线计算，可求出发酵液中还原糖的含量。
2.2实验步骤
（1）发酵液单层滤纸过滤，滤液0.2ml稀释至含糖量2-8mg/100ml为试样。
（2）取4支干燥试管,编号,按下表所示的量,精确加入待测液和试剂(ml):
加完试剂后, 将各管摇匀，戴上小漏斗，在沸水浴中加热5分钟，立即用冷水冷却至室温，再向各管中加入蒸馏水 20.0ml，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀。
切勿用力振摇，引入气泡。
在540nm波长下，以0号管为空白，在分光光度计上测定出各管溶液的吸光度值。
（3）以管1、2、3的吸光度值的平均值在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数，按下式计算样品中还原糖的百分含量：
3.发酵液中蛋白酶活的测定（同上次实验）
4、发酵液中pH测定：酸度计法。
四、实验具体操作
实验分组：每班分成六组，分别在以下时间进行取样，每组取两瓶。
具体时间为：在发酵0小时（前1天晚8点），12小时（第二天8点），15小时（11点），18小时（下午2点），21小时（下午5点），24小时（下午8点）分别测定发酵液中还原糖含量，生物量，蛋白酶活，pH变化，将整个班级结果汇总在一张表上，并标注自己组的各指标位置，以观察整体发酵水平及测定的准确性。
发酵工程实习报告
发酵工程实习报告实习报告：发酵工程实习一、实习目的和意义发酵工程是生物工程中非常重要的一个分支，主要研究微生物在发酵过程中的生长、代谢和产物生成等问题，广泛应用于食品、医药、生物能源等领域。
通过实习，旨在让学生深入了解发酵工程的基本理论及其实际应用，提高学生的实践能力和创新能力。
二、实习内容和过程在本次发酵工程实习中，我们主要开展了以下几方面的工作：1.发酵基础知识学习：通过课堂教学和讲座，学习了发酵工程的基本原理，包括微生物的生长动力学、发酵过程中的糖代谢和产物生成等内容。
同时，还学习了发酵反应器的结构和工艺参数的选择等基本知识。
2.实验操作技能培训：通过实际操作，学习了发酵过程中的一些基本操作技能，如细菌的培养与传代、发酵反应器的搭建与运行等。
通过反复演练，我们掌握了操作流程，并提高了实验技能的熟练度。
3.发酵过程监测与控制：学习了发酵过程中的微生物生长曲线的绘制和计算，并了解了发酵过程中的气体产量和溶氧量的监测与控制方法。
通过实验操作，我们了解了不同工艺参数对发酵过程的影响，以及如何通过调控工艺参数来优化发酵过程。
4.产物提取和分析：学习了发酵产物的提取和分离技术，包括离心、过滤、浓缩等方法，以及产物的质量分析方法，如色谱法、质谱法等。
通过实验操作，我们掌握了一些常用的产物提取和分析技术，并学会了分析数据和提出改进方案。
三、实习成果和收获通过本次发酵工程实习，我取得了以下一些成果和收获：1.理论知识的提高：通过课堂学习和实验操作，我对发酵工程的基本理论有了更深入的了解，掌握了一些重要的发酵工艺参数的选择和调控方法。
2.实践能力的提升：通过实际操作，我掌握了一些发酵工程操作技能，如微生物的培养与传代、发酵反应器的搭建与运行等，并提高了实验技能的熟练度。
3.创新能力的培养：在实验过程中，我积极思考和尝试一些改进措施，提出了一些改进方案，并在实践中不断进行调整和完善，培养了一定的创新能力。
四、存在的问题和改进方案在实习过程中，我也发现了自己存在的一些问题，主要包括实验操作的熟练度还不够、对实验结果的分析和解读能力有待提高等。
微生物发酵过程的动力学建模与参数估计
微生物发酵过程的动力学建模与参数估计微生物发酵是一种广泛应用的生物技术，可用于食品、医药、化工等领域。
发酵过程涉及到微生物的生长和代谢，具有复杂性和不确定性。
建立数学模型来描述微生物发酵过程动力学行为，有助于优化生产工艺，提高发酵效率和质量，降低成本。
本文将介绍微生物发酵过程的动力学建模与参数估计方法。
一、微生物发酵的过程动力学微生物发酵是一种复杂的生物过程，包括微生物的生长、代谢和产物积累等环节，需要考虑多种因素对过程动力学的影响。
1、微生物生长动力学微生物的生长途径可以分为对数生长和指数生长两种。
对数生长阶段，细胞数量呈现对数增长，受到外界营养物质浓度、温度、氧气等因素的影响。
指数生长阶段，细胞数量呈现指数增长，细胞密度达到最大值后就会停止生长。
2、代谢动力学微生物代谢产物包括有机酸、气体、醇等，其生产量受到微生物菌株、培养基成分、氧气的影响。
常用代谢模型是麦克斯韦-波尔兹曼方程，表示生物产物积累速率与生长速率成正比。
3、营养物质的消耗与代谢产物的积累微生物生长需要消耗培养基中的营养物质，代谢过程产生的代谢产物积累会影响微生物的生长和代谢行为。
因此，微生物发酵过程的动力学分析需要考虑营养物质的消耗和代谢产物的积累对微生物生长和代谢的影响。
二、微生物发酵过程的数学建模方法微生物发酵过程的数学建模可以采用质量守恒方程、动力学方程和控制方程等方法，以描述微生物生长和代谢产物积累的规律。
以乳酸菌发酵为例，假设细胞质量为X，乳酸积累量为L，糖消耗量为S，氮量消耗量为N，其中微生物生长速率μ，乳酸积累速率qL 都是未知的参数，可以采用动态质量守恒方程表示：dX/dt = μXdL/dt = qLXdS/dt = -kSXdN/dt = -kNX其中kS和kN是代谢系数。
通过对这些方程进行求解，可以得到微生物发酵过程的动力学行为。
三、发酵过程参数估计方法发酵过程的数学模型中包含多个未知参数，如微生物生长速率、代谢速率等。
《发酵工程实验》
《发酵⼯程实验》实验⼀淀粉酶⽣产菌的筛选⼀、实验⽬的学习淀粉酶产⽣菌的筛选⽅法。
⼆、实验原理淀粉酶在酿造、纺织、⾷品加⼯、医药等领域有⼴泛⽤途。
淀粉酶是⼀类淀粉⽔解酶的统称，它能将淀粉⽔解成糊精等⼩分⼦物质并进⼀步⽔解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉被⽔解后，遇碘不再变蓝⾊，因此可根据淀粉培养基上透明圈的⼤⼩来判断所选菌株的淀粉酶活⼒。
三、实验⽤品1．样品淀粉含量丰富的⼟样。
2．培养基⾁汤培养基：⽜⾁膏3g，蛋⽩胨10g，NaCl 5g，加⽔⾄1000ml，pH7.0。
121℃灭菌20min。
初筛平板培养基：⽜⾁膏3g，蛋⽩胨10g，NaCl 5g，可溶性淀粉2g，琼脂18g，加⽔⾄1000ml，pH7.4。
121℃灭菌20min。
Lugol碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏⽔300ml。
先将碘化钾溶解在少量⽔中，再将碘溶解于碘化钾溶液中，待碘全溶后，加⾜⽔即可。
3．器材⾼压蒸汽灭菌锅，超净⼯作台，电⼦天平，电炉，恒温振荡器，恒温培养箱；烧杯，量筒，三⾓瓶，培养⽫，移液管，洗⽿球，试管，试管架，接种针，涂布棒。
四、实验⽅法1．培养基制备：配制⾁汤培养基45ml，分装于250ml三⾓瓶中，纱布封⼝，灭菌。
配制初筛平板培养基350ml，分装于500ml三⾓瓶中，封⼝膜封⼝，灭菌。
2．倒平板：将融化的初筛平板培养基冷却⾄50～60℃，以⽆菌操作法倒⾄已灭菌的培养⽫中，⾄盖满底部。
冷却凝固待⽤。
3．样品预处理：取5g⼟样接⼊45ml⾁汤培养基中，30℃摇床振荡15min制成⼟壤悬液，此时的稀释度为10-1。
另取4⽀试管，分别记作10-2、10-3、10-4、10-5共5个梯度，每⽀试管内加⼊9mL⽆菌⽔。
⽤⽆菌移液管从三⾓瓶中吸取1mL⼟壤悬液，加⼊到10-2试管中混匀，再从此试管中吸取1mL加⼊到10-3试管中，依此类推直⾄10-5试管。
4．平板涂布分离：分别从不同稀释度的试管中吸取0.1ml悬液，均匀涂布于初筛培养基平板上，于30℃培养24～48h。
发酵工程综合实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解发酵工程的基本原理和操作方法；2. 掌握微生物的培养、分离、鉴定及发酵条件优化等实验技术；3. 提高实验操作能力和数据分析能力。
二、实验原理发酵工程是一门研究微生物发酵过程及其应用的科学。
通过发酵工程，可以利用微生物的代谢活动生产出各种有用的产品，如食品、医药、化工产品等。
本实验主要涉及微生物的培养、分离、鉴定及发酵条件优化等实验技术。
三、实验材料与仪器1. 材料：土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖、酵母提取物、氯化钠、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂等；2. 仪器：高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、显微镜、电子天平、pH计、发酵罐、酒精灯、试管、培养皿等。
四、实验方法1. 微生物分离与纯化（1）土壤样品的采集与处理：在校园内采集土壤样品，将土壤样品过筛，去除杂质，备用；（2）牛肉膏蛋白胨培养基的制备：按照实验要求，称取牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁等试剂，加入适量的水，搅拌均匀，煮沸10分钟，待冷却后加入琼脂，搅拌均匀，倒入培养皿中，待凝固；（3）土壤样品的接种：将处理好的土壤样品稀释，取适量涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上，置于恒温培养箱中培养；（4）分离纯化：观察菌落特征，挑选单菌落进行纯化，重复以上步骤，直至获得纯化菌株。
2. 微生物鉴定（1）观察菌落特征：观察纯化菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落特征，如菌落大小、形状、颜色、边缘等；（2）显微镜观察：将纯化菌株进行涂片、染色，在显微镜下观察菌体形态、染色特性等；（3）生化试验：进行糖发酵试验、氧化酶试验、淀粉酶试验等，鉴定菌株的生理生化特性。
3. 发酵条件优化（1）发酵培养基的制备：根据实验要求，称取葡萄糖、酵母提取物、氯化钠、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁等试剂，加入适量的水，搅拌均匀，煮沸10分钟，待冷却后加入琼脂，搅拌均匀，倒入发酵罐中；（2）发酵条件优化：通过改变发酵温度、pH值、接种量、发酵时间等条件，观察发酵产物的产量和品质，确定最佳发酵条件。
发酵工程 第6章 发酵动力学
■将细胞作为与培养液分离的生物相处理所建立的模 型为分离化模型。在细胞浓度很高时采用。
如果把细胞和培养液视为一相，建立的模型为均一化 模型。
非结构模型
结构模型
最理想情况
确定论模型 不考虑细胞内部结构
各种细胞均一
均衡 细胞之间无差异， 生长 是均一的，细胞内
如果在考虑细胞组成变化的基础上建立的模型，称为结 构模型，一般选取RNA、DNA、糖类及蛋白含量做为过 程变量。
■菌体视为单组分的模型为非结构模型，通过物料平 衡建立超经验或半经验的关联模型。
如果细胞内的各种成分均以相同的比例增加，称为 均衡生长。
如果由于各组分的合成速率不同而使各组分增加比 例不同，称为非均衡生长。
（3）质量平衡法（质量守恒定律）
发酵系统中物 物质进入系统的速度＋物质在系统生成的速度 ＝
质积累的速度 －物质排出系统的速度－物质在系统消耗的速度
研究发酵动力学的步骤
(1). 为了获得发酵过程变化的第一手资料，要尽 可能寻找能反映过程变化的各种理化参数。
(2). 将各种参数变化和现象与发酵代谢规律联系 起来，找出它们之间的相互关系和变化规律。
S ——基质量，mol；
t ——发酵时间，h
注：这里的“维持”是指活细胞群体没有净生长和产物没有净合成的生 命活动，所需能量有细胞物质氧化或降解产生，这种用于“维持”的物 质代谢称为维持代谢（内源代谢），代谢释放的能量叫维持能。
（2）得率系数(或产率，转化率，Y)： 是指被消耗的物质和所合成产物之间的量的关系。包括生
基于关键生化反应限速步及其关键酶的动力学特征及其影响因素采用一系列分子水平的方法?细胞层次代谢网络与细胞工厂基于细胞信号传导代谢网络细胞物质运输的系列关键生化反应的综合表现采用一系列细胞水平的方法包括细胞群体行为分析?反应器层次过程工程基于细胞群体生长及产物合成对外部环境综合响应采用一系列优化反应器发酵条件的方法主要针对微生物发酵的表观动力学通过研究微生物群体的生长代谢定量反映细胞群体酶促反应体系的宏观变化速率主要包括
发酵实验报告三、乳酸菌的分离和酸奶的制作
发酵工程学实验报告实验三、乳酸菌的分离和酸奶的制作学院生命科学学院专业应用生物教育班级12应生A班姓名李顺昌学号124120218实验课程乳酸菌的分离和酸奶的制作指导教师许波开课学期2014—2015学年下学期实验三、乳酸菌的分离和酸奶的制作小组合作：是小组成员：李顺昌、李媛媛、方淑萍、周玉坤一、实验目的1.掌握分离纯化微生物的基本方法2.掌握酸奶制作的基本原理3.学会酸奶的制作方法二、实验设备与材料1、仪器设备：三角瓶、平皿、试管、移液管、玻璃涂布棒、灭菌锅、超净工作台、培养箱、恒温摇床、冰箱等。
2、材料：市售酸奶、奶粉、白糖、棉花、酸奶瓶（自备，1个/人）等。
3、培养基：乳酸菌分离用乳酸菌分离用培养基：牛肉膏：0.5％；酵母膏：0.5％；蛋白胨：1％；葡萄糖：1％；乳糖：0.5％；NaCl：0.5％；琼脂：2.5％；pH6.8。
配制250mL/组，装于2个三角瓶三、实验原理1、酸奶制作的基本原理（1）酸奶：以牛奶为主要原料，接入一定量乳酸菌，经发酵后制成的一种乳制品饮料。
（2）生理生化原理牛奶（乳糖）→接种乳酸菌→β-D-半乳糖苷酶→乳糖（半乳糖和葡萄糖）→乳酸发酵（葡萄糖）→乳酸→破坏钙-酪蛋白-磷酸复合物的稳定性→蛋白质凝结→酸奶2、提供适宜的生长条件、采用一定的微生物分离纯化方法，就能够从酸奶中分离出乳酸菌。
3、酸奶中含有乳酸菌的菌体及代谢产物，因而对人体的肠胃消化道疾病有良好的治疗效果。
四、实验方法步骤（一）乳酸菌的分离纯化——稀释涂布平板法1、倒平板（约6块/100ml）2、制备酸奶稀释液（1）将0.5mL酸奶吸入4.5mL无菌水（自备）中，摇动5min；（2）用无菌吸管吸出0.5mL酸奶悬液，加入盛有4.5mL无菌水的试管中，充分混匀，制备得到10-2稀释液；（3）再从中吸出0.5mL加入盛有4.5mL无菌水的大试管中，混匀后得到10-3稀释液；（4）以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6酸奶稀释液。
发酵实验报告(根霉曲的制备及根曲霉糖活力的测定)
签名：2013年04月日
2、糖化酶是诱导酶。淀粉能诱导酶的形成，培养基中淀粉浓度与糖化酶的酶活及糖化酶的mRNA 含量成正相关，在培养基中适当提高培养基中淀粉含量，可以
增加产酶的量，酶活也有所提高。本实验没有添加任何诱导物。
3、实验人员的在吸取、滴定等操作存在误差，导致实验结果有所偏差。
4、制备5%固体曲浸出液时，糖化酶没有完全浸出，造成分解淀粉量减少，滴定所用标准葡萄糖溶液增多，计算所得酶活力减少。
①空白对测定结果的影响：空白的制备原则是使糖化酶不催化分解可溶性淀粉,即反应液中不存在葡萄糖。
②酶液稀释倍数对测定结果的影晌：在制备待测酶液时,稀释倍数不同对测定结果有较大影响。
③糖化时间长短对测定结果的影响。
④试剂加入顺序对测定结果的影响。
⑤酶制备液存放时间长短对测定结果的影响：试验是指从向酶中加缓冲液开始至糖化反应开始这段时间的长短对测定结果的影响。据试验,该酶在缓冲液中是非常稳定的。从半小时后开始测定酶活力,间隔一定的时间连续测定,直到存放三天后为止,结果测得酶活力基本一致,并没有因存放时间延长而活力下降。
小组合作
XX
XX
XX
XX
1、实验目的
1.1掌握固体发酵的基本操作步骤；
1.2了解根霉曲制作工艺和基本原理；
1.3了解糖化酶的测定方法；
1.4对糖化酶的糖化产物及糖化DE的计算；
1.5了解根霉曲在发酵生产过程中主要应用依据。
2、实验设备及材料
2.1材料：麦麸、根霉AS3.866
2.2试剂：柠檬酸缓冲液、DNS、1%淀粉
4.2.1.1先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。
气球酵母发酵实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景发酵现象是微生物在特定条件下，将有机物质分解产生新的物质的过程。
酵母菌作为一种常见的微生物，其在发酵过程中能够产生二氧化碳和酒精。
本实验旨在通过观察酵母菌发酵过程，了解其发酵现象，并探究发酵条件对实验结果的影响。
二、实验目的1. 观察酵母菌发酵过程，了解其产生二氧化碳和酒精的现象。
2. 探究不同温度、不同浓度糖溶液对酵母菌发酵的影响。
3. 分析酵母菌发酵过程中气体的生成和消耗情况。
三、实验原理酵母菌在适宜的条件下，能够将葡萄糖分解成酒精和二氧化碳。
在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，产生大量能量、水和二氧化碳；在无氧条件下，酵母菌进行无氧呼吸，产生少量能量、酒精和二氧化碳。
四、实验材料与仪器1. 实验材料：酵母、白糖、瓶子、气球、温水、漏斗、温度计、计时器。
2. 实验仪器：锥形瓶、胶塞、胶管、大烧杯、玻璃棒、滴管。
五、实验步骤1. 准备实验材料：将酵母、白糖、瓶子、气球等实验材料准备好。
2. 配制糖溶液：取一定量的白糖，加入适量温水溶解，配制成不同浓度的糖溶液。
3. 设置实验组：将锥形瓶清洗干净，分别加入不同浓度的糖溶液，并加入适量酵母。
4. 设置对照组：在锥形瓶中加入等量的清水，作为对照组。
5. 观察记录：将锥形瓶密封，放入温暖环境中，观察记录不同实验组中气球的膨胀情况。
6. 测量气体体积：使用滴管将产生的气体收集到集气瓶中，测量气体体积。
7. 分析实验结果：对比不同实验组中气球的膨胀情况，分析发酵条件对酵母菌发酵的影响。
六、实验结果与分析1. 观察记录：在实验过程中，观察到不同浓度的糖溶液中，气球膨胀情况有所不同。
随着糖浓度的增加，气球的膨胀速度加快，膨胀程度也更大。
2. 测量气体体积：通过测量气体体积，发现随着糖浓度的增加，产生的气体体积也相应增加。
3. 分析实验结果：实验结果表明，酵母菌发酵过程中，糖浓度对发酵产物的生成和气体体积有显著影响。
高浓度糖溶液有利于酵母菌发酵，产生更多的二氧化碳和酒精。
发酵工程试题及答案
发酵工程试题及答案一、名称解释1、前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。
2、发酵生长因子从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子3、菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。
补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补料量适合与否的一个参数。
4、搅拌热：在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生可观的热量。
搅拌热与搅拌轴功率有关5、分批培养：简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。
整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。
6、接种量：接种量＝移入种子的体积/接种后培养液的体积7、比耗氧速度或呼吸强度单位时间内单位体积重量的细胞所消耗的氧气，mmol O2?g菌-1?h-18、次级代谢产物是指微生物在一定生长时期，以初级代谢产物为前体物质，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质过程，这一过程的产物，即为次级代谢产物。
9、实罐灭菌实罐灭菌（即分批灭菌）将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温度后维持一定时间，在冷却到接种温度，这一工艺过程称为实罐灭菌，也叫间歇灭菌。
10、种子扩大培养：指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。
这些纯种培养物称为种子。
11、初级代谢产物是指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所需要的物质和能量的过程。
这一过程的产物即为初级代谢产物。
12、倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。
发酵工程实验
实验一酸奶的制作与乳酸菌的活菌计数5学时实验目的：1、学习并掌握酸奶制作的基本原理与方法;2、了解市售酸奶的生产工艺;3、掌握乳酸菌活菌计数方法与操作;实验原理：乳酸菌在乳中生长繁殖,发酵分解乳糖产生乳酸等有机酸,导致乳的pH值下降,使乳酪蛋白在其等电点附近发生凝集;乳酸菌属于兼性厌氧微生物,在无氧条件下生长繁殖较好,实验室条件下利用混菌培养的方法,尽可能让乳酸菌在无氧条件下生长,每个单菌落代表一个微生物细胞;实验内容：一酸奶制作1、10%脱脂奶粉溶解于热水80℃左右中,充分搅拌均匀,配成调制乳；2、添加蔗糖：为了缓和酸奶的酸味,改善酸奶口味,在调制乳中加人4-8％的蔗糖;3、灭菌：方法有两种：将乳加热至90℃,保温5min；4、接种：往冷却到43-45℃灭过菌的乳中加入乳酸菌,接种量为2%-5%;5、分装：酸奶受到振动,乳凝状态易被破坏,因此,不能在发酵罐容器中先发酵然后再进行分装,须是将含有乳酸菌的牛乳培养基先分装到小容器中,加盖后送入恒温室培养,在小容器中发酵制成酸奶;6、发酵：发酵的温度保持在40-43 ℃,一般发酵时间为3-6h;发酵终点的确定有两种方法：1检测发酵奶的酸度,达到65-70 T°;2倾斜观察,瓶内酸奶流动性差,而且瓶中部有细微颗粒出现;7、冷却：发酵结束,将酸奶从发酵室取出,用冷风迅速将其冷印到10℃以下,一般2 h,使酸奶中的乳酸菌停止生长,防止酸奶酸度过高而影响口感;8、冷藏和后熟：经冷却处理的酸奶,贮藏在2-5℃的冷藏室中保存;9、感官指标1色泽：色泽均匀一致,呈乳白色,或稍带微黄色;2组织状态：凝块稠密结实均匀细腻,无气泡,允许少量乳清析出;3气味：具有清香纯净的乳酸味,无酒精发酵味,无霉味和其他外来不良气味;二乳酸菌活菌检测①、检测培养基：蛋白胨15g,牛肉膏5g,葡萄糖20g,氯化钠5g,碳酸钙10g,琼脂粉20g,水1000ml,115～121℃灭菌20min,灭菌后放置水浴52℃保温备用; ②、稀释：取10克样品放入添加90ml无菌水的带4-6颗玻璃珠的250ml三角瓶中,摇床180rpm震荡30min,即为10－1样品溶液；再从中取1ml至添加9.0ml无菌生理盐水三角瓶中,稀释至10－2,以此类推稀释至10－8,即稀释了1亿倍;③、倒培养平板,从上述已稀释了1亿倍的乳酸菌悬液中取1ml,在无菌操作台上注入9.0cm培养皿中,再将已经灭了菌的保持在52℃水浴锅中的呈溶解状态的培养基,倒入15毫升左右于培养皿中,全部浸到培养皿,与菌悬液充分混合均匀倒入培养基后,马上用手转动培养皿,转动几下,让其混合均匀,然后等其凝固再移入培养箱中培养,注意最后一步倒平皿必须在超净台无菌操作,以免杂菌污染;每次稀释均要换灭好菌的移液管;④、培养条件：37℃恒温培养箱培养48～72h;⑤、培养完毕后,取出进行计数,因为是稀释了1亿倍,所以一个透明圈菌落代表1亿/克,如果有200个透明圈,则是200亿/克;实验器材及试剂：菌种：市售酸奶试剂：白糖奶粉培养基各成分器材：培养箱、电炉、铝锅5L,培养皿,酸奶发酵瓶自带实验结果：1、详细描述自己制作的酸奶结果：答：制作后酸奶与市场所售酸奶比较,比市场所售酸奶更稠密,酸奶的香味与酸味明显,制作成功2、记录个人酸奶中各菌数测定的平行数据,计算最终平均值;答：最终培养基上未出现乳酸菌菌落,全部为杂菌菌落,因此无法统计酸奶中的菌含量3、同时用图片记录实验过程中各现象与结果并对图进行注释;答：制备乳酸菌时,瓶子上方留有一部分空间,并未使乳酸菌完全处于无氧环境中发酵,但乳酸菌是兼性厌氧菌,因此在存在少量氧气的环境中,乳酸菌也可以生长,酸奶制备成功;但在平板接种时,由于污染杂菌,乳酸菌并未长出;乳酸菌计数失败;思考题：乳酸菌的保藏通常为低温条件,这给运输、保藏带来很大的成本,请问可采用什么方法使乳酸菌在常温条件下有很高的存活率答：在基因水平上对乳酸菌进行基因重组,从而获得耐高温乳酸菌;在基因库里筛选抗高温的基因并利用基因重组技术将其重组在乳酸菌基因上,对乳酸菌的基因进行修饰使其表达,以此来获得耐高温菌株;实验二枯草芽孢杆菌固态发酵及活菌数测定5学时实验目的：1、学习了解固态发酵原理；2、以枯草芽孢杆菌为对象,了解固态发酵的控制技术；3、掌握枯草芽孢杆菌活菌计数方法与操作;实验原理：作为抗生素的替代品,益生菌和酶制剂等的研究与开发近几年成为绿色饲料添加剂的热点,其中益生菌倍受关注;作为益生菌的一种,芽孢杆菌制剂在动物生产中的研究和应用一直都是畜牧业科研和生产人员关注的焦点;目前芽孢杆菌多采用液体深层发酵技术,再经喷雾干燥进行生产,对设备要求高,生产工艺复杂；而固体发酵采用的原料一般是廉价的农副产品如草粉、麸皮等,采用的设备也较液体发酵简单,生产成本大大低于液体发酵;所以近年来各生产厂家都在积极探索芽孢杆菌的固体发酵技术,以求简化生产工艺,提高产量,降低生产成本;固态发酵定义：指没有或几乎没有自由水存在下,在有一定湿度的水不溶性固态基质中,培养一种或多种微生物的生物反应过程,是以气相为连续相的生物反应过程;枯草芽孢杆菌属于好氧微生物,实验室条件下利用稀释涂布培养的方法,让菌在有氧条件下生长,每个单菌落代表一个微生物细胞;实验内容：1、液体种子培养基配制：葡萄糖0.2%,NaCl 0.5%,酵母膏0.5%,蛋白胨1%,pH 7.0;2、液体种子培养：每300 mL三角瓶装量50 mL液体种子培养基,在115℃条件下灭菌30 min;降温后从斜面接一环菌苔至种子培养基;置37℃控温摇床培养;转速200 r·min-1,至芽孢率达90%以上时停止,约需24 h;3、固体发酵培养基：麸皮60%,稻草粉10%,玉米粉5%,豆粕25%,硫酸镁0.05%,硫酸铵0.5%,料水比为1:1.1;4、三角瓶固体发酵培养：每250 mL三角瓶装量20-30 g湿重,固体发酵培养基原料试剂混合料,加水,料水比为1:1.1,搅拌均匀,培养基经121℃灭菌30 min,降温后接种量为2%V/M：V—液体菌种体积数,M—固体发酵培养基的质量,然后置37℃培养箱中静止培养,间时拍打,使其均匀生长;至脱落芽孢率为80%以上时,停止发酵,约需48 h;二枯草芽孢菌活菌检测①、检测培养基：葡萄糖0.2%,NaCl 0.5%,酵母膏0.5%,蛋白胨1%,琼脂粉2%,pH7.0;115℃灭菌20min,灭菌后放置水浴52℃保温备用;②、稀释：取10克样品放入添加90ml无菌水的带玻璃珠的250ml三角瓶中,摇床180rpm震荡30min,即为10－1样品溶液；再从中取1ml至添加9.0ml无菌生理盐水的三角瓶中,稀释至10－2,……以此类推稀释至10－8,即稀释了1亿倍;③、倒培养平板,将已经灭了菌的保持在52℃水浴锅中的呈溶解状态的培养基,倒入15毫升左右于培养皿中,全部浸到培养皿,待培养基凝固；从上述已稀释了1亿倍的菌悬液中取0.2ml于已凝固的培养基表面,用玻璃刮铲涂布均匀,静止10min,然后再移入培养箱中培养;④、培养条件：37℃恒温培养箱培养24～48h；⑤、培养完毕后,取出进行计数;三芽孢率测定:采用芽孢革兰氏染色后显微镜下观察实验器材及试剂：菌种：枯草芽孢杆菌试剂：培养基成分器材：培养箱、灭菌锅,培养皿实验结果：1、详细描述枯草芽孢杆菌固态培养物外观、气味、培养物状态等：答：枯草芽孢杆菌淡黄色,中间色深,表面较平整,无光泽,边缘不整齐,形成的菌落为圆形;培养基中的枯草芽孢杆菌有腥臭味,长势良好,观察培养基,无明显染菌现象;2、记录活菌测定中各平行数据,计算最终平均值;答：数量稀释倍数密度/g第一个平板112 5×107 5.6×109第二个平板65 5×107 3.25×109第三个平板22 5×107 1.1×109平均值 3.32×1093、同时用图片记录实验过程中各现象与结果,并对图进行注释;菌落成白色,菌落表面有褶皱思考题：在枯草芽孢杆菌固态生产过程中,为了防止霉菌与酵母的污染,可如何进行操作答：加入抗真菌抑制剂实验三、淀粉糖化与酒精发酵5学时实验类型：综合性实验目的：1．了解酒精发酵的主要类型、工艺原理及其控制条件2．熟悉酒精生产的工艺流程、掌握酒精发酵的操作方法3. 掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法4. 掌握在实验室中模拟酒精发酵的工艺流程实验原理玉米粉、大米粉中可供发酵的物质主要是淀粉,而酿酒酵母由于缺乏相应的酶,所以不能直接利用淀粉进行酒精发酵,因此必须对原料进行预处理,包括蒸煮液化、糖化等,蒸煮可使淀粉糊化,并破坏细胞,形成均一的醪液,能更好的接受糖化酶的作用,并转化为可发酵性糖,以便酵母进行酒精发酵;在无氧条件下酵母菌利用可发酵性糖转化为酒精和二氧化碳的作用,称为酒精发酵,是生产酒精及各种酒类的基础,可通过测定发酵过程中产生CO2的量和最终产物酒精的量得知酵母的发酵能力;实验内容1、原料的粉碎将玉米、大米用粉碎机粉碎,玉米淀粉含量为70%,大米淀粉含量为75%;2、蒸煮糊化称取一定量的粉碎后淀粉质原料,按一定的料水比100g：200ml,调制淀粉乳,90-100℃条件下恒温水浴加热,淀粉乳受热后,在一定温度范围,淀粉粒开始破坏,晶体结构消失,体积膨大,粘度急剧上升,呈粘稠的糊状,即成为非结晶性的淀粉;3、糖化经蒸煮糊化后的醪液,经过淀粉酶的糖化作用,将原料中的淀粉转化为可发酵性糖,供酵母利用;酶参考用量：淀粉乳33%,60℃,ph4.5,酶240U/g绝干淀粉,糖化时间16h;糊化醪液调整pH4.5,往其中加入一定量的淀粉酶120U/g、糖化酶120U/g,60℃恒温下不断搅拌,直至粘度下降到一定程度,淀粉完全糖化4、发酵1干酵母活化将干酵母按1:20的比例投放于37℃的温水中复水20min;目的：恢复酵母细胞的正常功能;2淀粉醪液糖化后,取400ml上清液于洁净的大可乐瓶中,加相同体积的水稀释,加入活化好的酵母种液5ml,混匀,28度培养箱中静止培养36h左右;5、二氧化碳生成的检验1观察三角瓶中的发酵液有无气泡溢出；2滴入10%氢氧化钠1ml于发酵液试管中,观察,如气体逐渐消失,则说明有二氧化碳的存在；6、二氧化碳生产量的测定1接种完,擦干瓶外壁,于天平上称量,记为W1;2实验结束,取出瓶轻轻摇动,使二氧化碳尽量溢出,在同一天平上称量,记为W2；3二氧化碳生成量= W1-W27、酒精生成的检验1打开瓶塞,嗅闻有无酒精气味；2取发酵液5ml,加10%硫酸2ml；3再加入1% K2Cr2O7溶液10-20滴,如颜色由黄色变为黄绿色说明有酒精产生;K2Cr2O7+H2SO4+CH3CH2OH——CH3COOH+K2SO4+Cr2SO43实验器材及试剂：菌种：活性干酵母试剂：培养基各成分、大米粉、活性干酵母、淀粉酶、糖化酶、大可乐瓶溶液：10% H2SO4、1%K2Cr2O7、10%NaOH 器材：试管、培养箱、灭菌锅、三角瓶、水浴锅、粉碎机、离心机实验结果：1、详细记录实验过程中各参数及数据;淀粉淀粉酶CaCl2糖化酶100g 10g 0.17g 2.5g2.对实验结果的判断与分析;答:1二氧化碳生成的检验培养约48h后,观察瓶中混合液,淀粉大部分沉降在瓶底,上清浓度较稀,靠瓶壁边缘有一连串微小气泡2酒精生成的检验打开瓶塞,闻到有浓重酒精气味;取发酵液5ml, 加10%硫酸2ml,加1%K2Cr2O7溶液10-20滴,颜色由黄色变为黄绿色,稍加热后现象产生更快,更明显;思考题：现有3株不同来源的酒精酵母,请设计与本实验操作不同的实验,判断哪株酵母发酵酒精能力最强答：按实验步骤配制等量的三组醪液,加入等量糖化酶进行糖化作用,将原料中的淀粉转化为可发酵性糖,向三组糖化后的淀粉上清中加入等量3株不同来源的酒精酵母种液,相同条件下培养一段时间,分别测定三组实验产生的CO2的质量,进行比较;产CO2越多表示发酵酒精能力越强;实验四黑曲霉固体发酵生产纤维素酶及酶解底物反应5学时实验目的：1、了解黑曲霉固体发酵产酶情况2、掌握微生物固体发酵操作技术3、了解纤维素酶提取方法及酶活性定性测定方法实验原理：纤维素酶是降解纤维素的一组酶的总称,是起协同作用的多组分酶系,属于诱导酶,其产生需要纤维素类物质的诱导;实验中以米曲霉为发酵菌株,稻草作为产酶诱导物;实验内容1、黑曲霉菌种活化1配制PDA培养基：称取200g马铃薯,洗净去皮切碎,加水1000ml煮沸半个小时,纱布过滤,再加20g葡萄糖和20g琼脂,充分溶解后趁热纱布过滤,分装试管,每试管约5-10ml视试管大小而定,15磅蒸气121℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面,冷却后贮存备用;2在无菌超净台上接种保藏的黑曲霉于PDA斜面,28℃培养5-7天,斜面上长满孢子;2、配制发酵培养基：15g麸皮+10g稻草粉,0.5%KH2PO4,0.5% NH42SO4,加15ml 水加水量40%～60%,拌匀,装瓶；3、灭菌：121℃灭菌30min,冷却至室温;4、黑曲霉孢子悬浮液制备已培养好的黑曲霉孢子斜面一支,加入约10ml无菌水,洗下孢子,制成孢子悬液;5、接种：用移液管在无菌条件下吸取一定量的悬液,移入灭菌好的固体培养基中,于30度条件下培养96h,期间每隔12h摇动三角瓶一次;6、提取粗酶液向瓶中加入无菌水约50ml,浸泡固体曲30min-1h；过滤得粗酶液;7、酶活性测定1配制1%CMC底物平板：配方：1g羧甲基纤维素钠,1.8g琼脂, 100ml,琼脂完全溶解后,加入0.03g曲利本蓝,倒平板,每皿约15ml;2打孔：打孔器经酒精燃烧灭菌后,每平板打4孔,并在酒精灯火焰上稍稍加热打孔处,使孔周围的培养基微融,然后平放冷却;3加样：往孔内加入粗酶液适量约100ul,同时需设对照;4培养反应：将加样后的平板小心平端放入30℃培养箱,放置20小时左右;5观察结果：可直接观察透明圈有无、测定透明圈直径;实验器材及试剂：菌种：黑曲霉试剂：土豆、稻草、麸皮、硫酸铵、羧甲基纤维素钠CMC器材：培养箱、灭菌锅、三角瓶、摇床、离心机、天平、三角瓶实验结果：1、仔细观察固体培养基发酵前后的状态,并描述；答：固体培养基发酵前：培养基颜色较浅,各成分麸皮、稻草新鲜,粘度大成团状固体培养基发酵后：培养基中产生较多黑色孢子及菌体,培养基营养成分被利用,体积缩小2、仔细观察底物平板酶解前后的现象,并测量水解圈大小;现象：纸片周围出现浅浅的水解圈,打孔培养基未出现水解圈,纸片直径 2.5cm,水解圈3cm,直径比5:6思考题：纤维素是自然界最丰富的资源,从理论角度分析如何最大限度地通过酶法利用该资源而现实存在什么问题目前对纤维素降解有哪些研究进展答：要想最大限度的利用纤维素,可从两个方面入手;一是通过生产高性能纤维素酶的方法,二是找到蕴含能量较高的纤维素;而现实中存在的问题是高性能纤维素酶的获取,而可以通过诱变和筛选获得可产生纤维素酶的新菌株;目前在纤维素的降解方面,微生物的研究较多,降解纤维素的真菌有很多,如木霉属、青霉属、曲霉属、根霉属、漆斑霉属、枝顶孢霉属、毛壳霉属和脉孢霉属等;其中,很多纤维素降解真菌在生长过程中能产生菌丝,菌丝具有很强的穿透能力,能穿透植物角质层的阻碍,紧紧依附和穿插在纤维物质上,增大降解酶与纤维物质的接触面积,从而加快降解速率;如木霉属、青霉属、漆斑霉属、毛壳霉属和脉抱霉属为丝状真菌;目前,木霉属是迄今所知纤维素酶系最全面和研究较多的一个属;实验五甘露聚糖酶液体发酵及酶解反应6 学时实验目的：1.了解并掌握液体发酵产酶操作及酶反应条件的控制2.与固体发酵产酶进行比较分析实验原理甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分,其主链是由吡喃甘露糖残基以1,4-β-D糖苷键连接而成;当主链的某些残基被葡萄糖取代,或半乳糖通过1,6-α-糖苷键与甘露糖残基相连形成分枝,则称之为异甘露聚糖,主要有半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖;甘露聚糖是半纤维素的第二大组分,在自然界中分布广泛,且多以异甘露聚糖的形式存在,同型甘露聚糖十分少见;β-甘露聚糖酶以内切方式降解甘露聚糖主链产生不同聚合度的甘露寡糖和少量甘露糖,是甘露聚糖降解酶中最关键的酶;甘露聚糖酶可广泛应用于食品、造纸、纺织印染等行业;利用β-甘露聚糖酶可以制取有特殊保健作用的甘露寡糖;在纸浆制造业,可用于代替碱法进行脱色、漂白;在纺织印染方面,利用β-甘露聚糖酶与其它酶联合作用,能有效去除产品上粘附的多余染料,降低能耗和对环境的污染等;甘露聚糖酶的工业化生产将在许多行业产生很大的经济和社会效益;因此,近年来甘露聚糖酶逐渐成为国内外关注和研究的热点之一;甘露聚糖酶是一种半纤维素酶,其产生需要一定的诱导物存在;本实验以枯草芽孢杆菌为菌株,以魔芋粉为诱导物;实验内容1.菌种活化1配制LB固体培养基：蛋白胨10g/L, 酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L,琼脂20g/L,待琼脂充分溶解后趁热纱布过滤,分装试管,每试管约5-10ml视试管大小而定,15磅蒸气121℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面,冷却后贮存备用;2在无菌超净台上接种保藏的枯草芽孢杆菌于LB斜面,28℃培养2天;2.配制产酶培养基：蛋白胨10g/L, 酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L,魔芋粉30g/L,3.以10%的体积量分装于三角瓶中25ml液体培养基/250ml三角瓶,121℃灭菌20分钟；4.菌悬液的制备已培养好的枯草杆菌斜面一支,加入约10ml无菌水,洗下菌体,制成菌悬液;5.接种用移液管在无菌条件下吸取一定量的悬液,移入灭菌好的固体培养基中,于37度200rpm条件下培养72h;6.粗酶液提取：3000rpm离心收集得到粗酶液7.酶解底物分析：准备两三角瓶,分别加入50ml自来水,46度水浴保温8.往两三角瓶中各加入1g魔芋粉,然后其中一个加入粗酶液1ml,另一个加入1ml蒸馏水做空白对照;以后每隔5-10min往两三角瓶中各加入1g魔芋粉,前后共加5g9.酶解反应30-60min,期间观察反应现象;实验器材及试剂：菌种：枯草芽孢杆菌试剂：蛋白胨、酵母粉、氯化钠、魔芋粉器材：培养箱、灭菌锅、三角瓶、摇床、离心机、天平、三角瓶实验结果：1、仔细观察液体培养基发酵前后的状态,并描述；答：①发酵之前的液体培养基的状态：在配制产酶培养基时,魔芋粉难溶解,依旧是固体颗粒;等完全灭完菌后,放正在实验台上,等冷却后,状态比较像固体培养基,但魔芋粉依旧不溶解,其颗粒均匀地分布于培养基中;②经过三天的培养之后,产酶培养基被液化,得到的是含有粗酶液的液体培养基,完全呈黄褐色的液体状2、仔细观察底物水解前后的现象;答：对照组：魔芋粉结成团,透明,具有弹性,黏度很大,无法搅拌,实验难以继续;实验组：魔芋粉已被完全酶解,三角瓶中完全是液体状的酶解产物,溶液呈透明状;思考题：以本人液体发酵产酶为例,请详细介绍甘露聚糖酶定量测定的原理与方法;答：原理：样品中的甘露聚糖酶对底物－半乳甘露聚糖进行水解,用DNS试剂3,5-二硝基水杨酸分光光度法测定水解所产生的还原糖量;方法：别向2支试管中加入1.8mL底物溶液,置50℃水浴中保温5min;在其中一支试管中加入200μL稀释酶样,磁力旋转搅拌均匀,置于50℃水浴中准确保温5 min;加入3.0 mL DNS试剂至两支试管中,搅拌均匀;在另一支试管空白管中加入200μL稀释酶样,同时将两支试管放入沸水浴中准确保温5min,取出置入冷水中冷却至室温;于540 nm处测量酶样对空白的吸光度,在酶活标准曲线上读取酶活,再乘以酶样稀释倍数;实验六从土壤中分离筛选产抗生素放线菌及抗菌谱分析实验目的：1、从土壤中分离产抗生素的放线菌;2、抗生素产生菌的抗菌谱测定;3、掌握微生物的基本操作;实验原理：放线菌是重要的抗生素产生菌,主要分布在土壤中,其数量仅次于细菌,一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多;由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体,为了研究某种微生物,就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来,从而获得某一菌株的纯培养;分离放线菌常用稀释倒平板法;根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求,常选用合成培养基或有机氮培养基;如果培养基成分改变,或土壤预先处理120℃热处理1h,或加入某种抑制剂如加数滴10%酚等,都可以使细菌本实验加入重铬酸钾150㎎／L,霉菌出现的数量大大减少,从而淘汰了其它杂菌;再通过稀释法,使放线菌在固体培养基上形成单独菌落,并可得到纯菌株;放线菌可以产生抗生素,抑制其他菌种的生长,挑取纯菌落进行抗菌谱分析,指示菌为大肠杆菌G-和枯草芽孢杆菌G+; 实验内容1、高氏一号培养基的制备可溶性淀粉20g,硝酸钾1g,氯化钠0.5g,K2HPO4 •3H2O 0.5g,MgSO4•7H2O 0.5g,FeSO4•7H2O 0.01g,琼脂20g,水1000ml,pH7.4;配制时,先用冷水,将淀粉调成糊状,倒入煮沸的水中,在火上加热,边搅拌边加入其他成分,溶化后,补足水分至1000ml;112℃灭菌20分钟实验中所用无菌器具均在此时灭菌;2、土壤取样及其悬液梯度稀释选定取样点最好是有机质含量高的菜地,按对角交叉五点法取样;先除去表层约2cm的土壤,将铲子插入土中数次,然后取2～10cm处的土壤;盛土的容器应是无菌的;将5点样品约1kg充分混匀,除去碎石、植物残根等,土样取回后应尽快投入实验;3、称土样10g于盛有90mL无菌水并装有玻璃珠的三角瓶中,振荡10～20min,使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散,此即为10-1浓度的菌悬液,静置30s;另取装有9ml无菌水的试管4支,编号10-2、10-3、10-4、10-5;用无菌吸管无菌操作取10-1浓度的土壤悬液1ml 并加入编号10-2的无菌试管中,并吹吸吸管3~4次,使与9ml水混匀,即为10-2浓度的土壤稀释液;依此类推,直到稀释至10-5的试管中每个稀释度换1支无菌吸管;稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行;4、稀释倒平板法分离土壤中放线菌取3支1毫升移液管分别从10-3、10-4、10-5菌悬液中吸取1毫升菌悬液,分别注入编号10-3、10-4、10-5的培养皿内,每一梯度两个平板;将温度为45～50℃的高氏一号培养基倒入上述各培养皿内,轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀,凝固后,将培养皿倒扣放置在温暖处28℃左右培养一周,每天观察培养基表面有无微生物菌落;将平皿上的放线菌菌落挑取在淀粉琼脂平皿上四区划线进行分离纯化,28℃恒温培养一周左右,观察放线菌菌落特征;5、抗菌谱测定：1配制LB培养基：蛋白胨10g/L, 酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L,琼脂20g/L;灭菌后倒平板; 2将摇床培养12h的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分别涂布于固态LB培养基,静置10min; 3挖取一个放线菌菌落含培养基,倒置于平板分区的中央,培养一天后,观察并测量抑菌圈大小;实验器材及试剂：菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌试剂：蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂、可溶性淀粉、硝酸钾、氯化钠、K2HPO4 •3H2O 、MgSO4•7H2O 、FeSO4•7H2O 、酒精、土壤器材：培养箱、灭菌锅、三角瓶、摇床、天平、。