血红素加氧酶-1对急性肺损伤大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的保护作用

·实验研究·血红素加氧酶－１对急性肺损伤大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的保护作用谭泽龙　陈淼　曹海军　钱明江　王洪敏　谢海辉 【摘要】　目的　探讨血红素加氧酶－１（ＨＯ－１）对急性肺损伤（ＡＬＩ）大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（ＡＥＣ－Ⅱ）的保护作用。

方法　雄性ＳＤ大鼠３２只，随机均分为四组：正常对照组（Ｃ组），油酸损伤组（ＯＡ组），阿司匹林预处理组（ＡＳ组）和锌卟啉ＩＸ预处理组（ＩＸ组）。

测定动脉血气，支气管肺泡灌洗液（ＢＡＬＦ）和血清中肺表面活性物质相关蛋白Ａ（ＳＰ－Ａ）含量，肺组织湿／干重比（Ｗ／Ｄ）；免疫组化法测肺组织ＨＯ－１蛋白表达，电镜下观察ＡＥＣ－Ⅱ超微结构的变化。

结果　与Ｃ组比较，其余各组Ｗ／Ｄ、ＨＯ－１蛋白表达明显升高（Ｐ＜０．０１）。

与ＯＡ组比较，ＡＳ组Ｗ／Ｄ明显下降（Ｐ＜０．０１），ＨＯ－１蛋白表达明显升高（Ｐ＜０．０１）；ＩＸ组Ｗ／Ｄ明显升高（Ｐ＜０．０５），ＨＯ－１蛋白表达明显下降（Ｐ＜０．０１）。

电镜显示ＯＡ组可见ＡＥＣ－Ⅱ相对不规则，细胞变性甚至崩解，细胞表面微绒毛减少，胞浆内板层小体排空，部分排入肺泡腔。

ＡＳ组较ＯＡ组轻；ＩＸ组较ＯＡ组重。

结论　ＨＯ－１的高表达具有明显的保护ＡＥＣ－Ⅱ的作用，进而对急性肺损伤有防治作用。

【关键词】 血红素加氧酶－１；急性肺损伤；肺泡Ⅱ型上皮细胞；大鼠Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｈｅｍｅ　ｏｘｙｇｅｎａｓｅ－１ｏｎ　ａｌｖｅｏｌａｒ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｔｙｐｅⅡｃｅｌｌ　ｉｎ　ａｃｕｔｅ　ｌｕｎｇ　ｉｎｊｕｒｙ　ｒａｔｓ　ＴＡＮＺｅ－ｌｏｎｇ，ＣＨＥＮ　Ｍｉａｏ，ＣＡＯ　Ｈａｉ－ｊｕｎ，ＱＩＡＮ　Ｍｉｎｇ－ｊｉａｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｈｏｎｇ－ｍｉｎ，ＸＩＥ　Ｈａｉ－ｈｕｉ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ＩＣＵ，Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｚｕｎｙｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｚｕｎｙｉ　５６３００３，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＣＨＥＮ　Ｍｉａｏ，Ｅｍａｉｌ：ｃｈｅｎｍｉａｏ６４＠１６３．ｃｏｍ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｈｅｍｅ　ｏｘｙｇｅｎａｓｅ－１（ＨＯ－１）ｏｎ　ｒａｔ ｓａｌｖｅｏｌａｒ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｔｙｐｅⅡｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ａｃｕｔｅ　ｌｕｎｇ　ｉｎｊｕｒｙ（ＡＬＩ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｉｒｔｙ－ｔｗｏ　ｍａｌｅ　ＳＤ　ｒａｔｓｗｅｉｇｈｉｎｇ　１８０－２００ｇ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　４ｇｒｏｕｐｓ（ｎ＝８ｅａｃｈ）：ｇｒｏｕｐ　Ｃ（ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ）；ｇｒｏｕｐＯＡ（ｉｎｊｕｒｙ　ｇｒｏｕｐ）；ｇｒｏｕｐ　ＡＳ（ａｓｐｉｒｉｎ　ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ）；ｇｒｏｕｐ　ＩＸ（ｚｉｎｃ　ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ　ＩＸｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ）．Ｔｈｅ　ａｒｔｅｒｉａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｇａｓ，ｔｈｅ　ＳＰ－Ａ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ　ｌａｖａｇｅ　ｆｌｕｉｄ（ＢＡＬＦ）ａｎｄ　ｓｅｒｕｍ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｗｅｔ／ｄｒｙ（Ｗ／Ｄ）ｗｅｉｇｈｔ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｌｕｎｇ　ｔｉｓｓｕｅ　ｗｅｒｅ　ｅｘａｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＨＯ－１ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｕｎｇ　ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ＡＥＣ－Ⅱｗｅｒｅ　ａｌｓｏｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｗｅｔ／ｄｒｙ（Ｗ／Ｄ）ｗｅｉｇｈｔ　ｒａｔｉｏ　ａｎｄ　ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＨＯ－１ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ａｌｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐｓ　ｅｘｃｅｐｔ　ｇｒｏｕｐ　Ｃ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｇｒｏｕｐ　ＯＡ，ｔｈｅ　ｗｅｔ／ｄｒｙ（Ｗ／Ｄ）ｗｅｉｇｈｔ　ｒａｔｉｏ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＨＯ－１ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　ＡＳ，ｂｕｔ　ｔｈｅ　ｗｅｔ／ｄｒｙ（Ｗ／Ｄ）ｗｅｉｇｈｔ　ｒａｔｉｏ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＨＯ－１ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐＩＸ．Ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ　ｉｒｒｅｇｕｌａｒ　ＡＥＣ－Ⅱ，ｃｅｌｌ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｒ　ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｓｕｒｆａｃｅｍｉｃｒｏｖｉｌｌｉ，ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｌａｍｅｌｌａｒ　ｂｏｄｙ　ｅｍｐｔｙｉｎｇ，ａｎｄ　ｐａｒｔ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ａｌｖｅｏｌａｒ　ｓｐａｃｅ　ｗｅｒｅ　ｆｏｕｎｄ　ｂｙｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｗｉｔｈ　ａ　ｓｅｖｅｒｉｔｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｇｒｏｕｐ　ＡＳ＜ＯＡ＜ＩＸ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＨＯ－１ｈａｓ　ａｎ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ａｃｕｔｅ　ｌｕｎｇ　ｉｎｊｕｒｙ　ｂｙ　ａｃｔｉｎｇ　ｏｎ　ＡＥＣ－Ⅱｃｅｌｌｓ．【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】 Ｈｅｍｅ　ｏｘｙｇｅｎａｓｅ－１；Ａｃｕｔｅ　ｌｕｎｇ　ｉｎｊｕｒｙ；Ａｌｖｅｏｌａｒ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｔｙｐｅⅡｃｅｌｌ；Ｒａｔ 基金项目：贵州省教育厅自然科学类科研项目（黔教科２００７０４２）作者单位：５６３００３　遵义医学院附属医院ＩＣＵ［潭泽龙（现在山东省泰安市中心医院麻醉科）、陈淼、曹海军、钱明江、王洪敏、谢海辉］通信作者：陈淼，Ｅｍａｉｌ：ｃｈｅｎｍｉａｏ６４＠１６３．ｃｏｍ 肺泡Ⅱ型上皮细胞（ＡＥＣ－Ⅱ）是肺泡上皮的干细胞，其功能包括增殖和损伤修复、合成和分泌表面活性物质（ＰＳ）、维持肺泡内外液体平衡和参与免疫调节等。

血红素加氧酶－１（ＨＯ－１）作为应激蛋白的重要一员，在氧化应激状态下，在心血管、肺、肝、肾等重要器官中诱导表达，催化血红素代谢生成胆红素、铁离子、一氧化碳（ＣＯ），通过多效和复杂的信号传导途径，产生抗氧化、抗凋亡、抗炎症、抗增殖等一系列生物学效应，参与了机体的多种病理生理过程［１，２］。

本实验探讨ＨＯ－１对急性肺损伤的防治作用及其机制。

材料与方法动物及分组　成年雄性ＳＤ大鼠３２只，体重１８０～２００ｇ（第三军医大学实验动物中心提供）。

随机均分为四组：正常对照组（Ｃ组），油酸损伤组（ＯＡ·６０４·临床麻醉学杂志２０１２年４月第２８卷第４期　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌ，Ａｐｒｉｌ　２０１２，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．４组），阿司匹林预处理组（ＡＳ组）和锌卟啉ＩＸ预处理组（ＩＸ组）。

实验方法　ＡＳ组在损伤前２ｄ由食料中加入阿斯匹林５ｍｇ／ｋｇ，一天一次，共２ｄ，末次给药后２４ｈ再制模；ＩＸ组接受ＨＯ特异性抑制剂锌卟啉ＩＸ（美国Ｓｉｇｍａ公司，批号：０９９０５ＨＨ）预处理，首次剂量为２０μｍｏｌ／ｋｇ，损伤前６ｈ皮下注射，３ｈ后再给相同剂量。

所有大鼠腹腔注射１０％水合氯醛０．３５ｍｌ／１００ｇ麻醉后，将大鼠固定在手术台上，分离出右股静脉，Ｃ组经右股静脉注入生理盐水０．１５ｍｌ／ｋｇ，其它三组注入油酸０．１５ｍｌ／ｋｇ（天津市科密欧化学试剂有限公司）制作ＡＬＩ模型［３］。

标本采集和指标监测　注入油酸后１２０ｍｉｎ经颈内动脉放血处死大鼠，取动脉血０．５ｍｌ用ＧＥＭ－ｐｒｅｍｉｅｒＴＭ３０００血气分析仪检测动脉血气。

同时抽取动脉血５ｍｌ，室温下自然凝固１５ｍｉｎ，３　５００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上凊测量血清中肺表面活性物质相关蛋白Ａ（ＳＰ－Ａ）含量（试剂盒为美国Ｓｉｇｍａ公司产品）。

打开胸腔，结扎右侧肺门，气管切开，插入０．２ｃｍ硅胶管，以４℃生理盐水２ｍｌ反复灌洗左肺３次，记录每次灌洗液回收量后３　０００ｒ／ｍｉｎ离心１８ｍｉｎ，取上凊测量支气管肺泡灌洗液（ＢＡＬＦ）中ＳＰ－Ａ含量。

右肺上叶８０℃恒温箱７２ｈ至肺干重恒定，称干重，计算湿／干重比（Ｗ／Ｄ）。

取右肺中叶０．３ｃｍ×０．３ｃｍ×０．５ｃｍ，用ｐＨ７．２～７．４、１０％中性甲醛固定２４ｈ后，做成肺组织病理切片分别作免疫组化。

免疫组化采用即用型二步法（非生物素）检测试剂盒（一抗、二抗、ＤＡＢ显色剂均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供），用Ｌｅｉｃａ　ＤＭ１０００显微镜进行光镜学分析，同时采片，用Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ　Ｐｌｕｓ　６．０光学分析系统测ＨＯ－１蛋白的积分光密度值，每次取同一张片子的五个视野，取平均值后再取对数。

随机取１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍ右肺下叶组织９块，用２．５％戊二醛固定；０．１ＭＰＢＳ漂洗２次，每次１０ｍｉｎ；１％锇酸后固定２ｈ；丙酮梯度脱水；环氧树脂６１８包埋；半薄切片定位；超薄切片，铀染，铅染；飞利浦ＴＥＣＮＡＩ１０电镜观察ＡＥＣ－Ⅱ的超微结构。

统计分析　采用ＳＰＳＳ　１３．０统计软件进行处理。

计量资料采用均数±标准差（珚ｘ±ｓ）表示，组间采用单因素方差分析，两两比较用Ｐｏｓｔ　Ｈｏｃ检验（方差齐时用ＬＳＤ，不齐时用Ｄｕｎｎｅｔｔ）。

结 果Ｃ组和ＡＳ组ＰａＯ２和ＰａＯ２／ＦｉＯ２显著高于、ＰａＣＯ２显著低于ＯＡ组和ＩＸ组（Ｐ＜０．０１），而ＩＸ组ＰａＯ２和ＰａＯ２／ＦｉＯ２明显低于ＯＡ组（Ｐ＜０．０５）（表１）。

表１　大鼠动脉血气分析结果（ｍｍ　Ｈｇ，珔ｘ±ｓ）组别只数ＰａＯ２ＰａＣＯ２ＰａＯ２／ＦｉＯ２Ｃ组８　９２．１３±１．２５ａｃ　３９．７５±１．６７ａｃ　４３８．７５±５．９９ａｃＯＡ组８　５６．２５±４．４６　６０．６３±４．０３　２６７．００±２０．６６ＡＳ组８　９１．００±１．３１ａｃ　４６．２５±１．９８ａｃ　４３１．００±５．５０ａｃＩＸ组８　５０．３８±１．６９ｂ　５８．１３±２．２３　２３９．８８±８．０１ｂ 注：与ＯＡ组比较，ａＰ＜０．０１，ｂ　Ｐ＜０．０５；与ＩＸ组比较，ｃ　Ｐ＜０．０１ 与Ｃ组比较，其余各组Ｗ／Ｄ、ＨＯ－１蛋白表达明显升高（Ｐ＜０．０１）。

与ＯＡ组比较，ＡＳ组Ｗ／Ｄ明显下降（Ｐ＜０．０１），ＨＯ－１蛋白表达明显升高（Ｐ＜０．０１）；ＩＸ组Ｗ／Ｄ明显升高（Ｐ＜０．０５），ＨＯ－１蛋白表达明显下降（Ｐ＜０．０１）（表２）。