核酸酶I-SceI介导的转基因斑马鱼构建及连接蛋白Connexin48.5的定位研究

核酸酶I-SceI介导的转基因斑马鱼构建及连接蛋白Connexin48.5的定位研究刘俊;杨镇滔;李汉杰;田书也;韩家淮【摘要】细胞连接蛋白是由多基因家族编码的一类结构相似、分子质量不同的蛋白质.在细胞膜上,每6个相同或不同的连接蛋白围绕中央孔排列形成一个连接子,相邻细胞膜上的连接子相互对接形成细胞间隙连接,细胞间隙连接是一种重要的通讯连接,它不仅是细胞间代谢偶联、冲动传导的结构基础,而且可以通过介导与细胞的迁移、分化、增生和器官形成有关的信号物质而在胚胎发育中起重要作用.为了进一步探讨细胞间隙连接在生物体中的作用,采用斑马鱼胚胎显微注射核酸酶I-SceI 和质粒DNA的方法成功构建了绿色荧光蛋白GFP与细胞连接蛋白Connexin48.5融合表达的转基因荧光斑马鱼品系,并通过对荧光蛋白发光的观察在斑马鱼鱼体中进行连接蛋白Connexin48.5的定位.实验结果表明:核酸酶I-SceI介导下的斑马鱼转基因方法效率较高,可行性好;连接蛋白Connexin48.5在斑马鱼体内主要定位于眼球晶状体和脊索.所获得的Connexin48.5-GFP融合表达斑马鱼系,以及利用该品系进行的Connexin48.5定位研究对细胞连接蛋白在生物体内的功能研究将具有重要作用.%Connexinj are a group of proteins coded by multi gene family. On the cell membrane,every 6 Connexins combine together to form a Connexon,and two Connexons of two different cells connect with each other to form a gap junction. Gap junction is a very important kind of communicational connection between cells,which is not only the constructional basic of metabolic coupling and signal transduction betweens cells,but also the channel of signal substance controlling cell migration,differentiation,proliferation and or-ganogenesis. For a deeperstudy of gap junction function in organisms, we generated a transgenic zebrafish line that expresses Con-nexin48. 5-GFP fusion protein by co-injecting meganuclease I-Scel and plasmid DNA into zebrafish embryos. I-Scel mediated trans-genesis showed high efficiency,which made it a better way to get transgenic animals than the traditional method. While the working mechanism of I-Scel remains unclear, in our opinion, I-Seel binds to its recognition site after the cleavage and promotes nuclear localization of the transgene could be a good explanation. Using our transgenic zebrafish line, we found that Connexin48. 5 is highly expressed in lens and notochord in zebrafish. In addition to its expression in lens,which has been reported preciously,our new finding suggested that Connexin48. 5 could have important roles in notochord development or nervous system function【期刊名称】《厦门大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(051)006【总页数】4页(P1066-1069)【关键词】I-SceI;Connexin48.5;转基因;晶状体;脊索【作者】刘俊;杨镇滔;李汉杰;田书也;韩家淮【作者单位】厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005【正文语种】中文【中图分类】Q356.1斑马鱼属鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Brachydanio），原产于南亚，是一种常见的热带鱼，具有繁殖能力强、体外受精和发育、胚胎透明、性成熟周期短、个体小易养殖等诸多特点，特别是可以进行大规模的正向基因突变与筛选.这些特点使其成为功能基因组时代生命科学研究中重要的模式脊椎动物之一.由于斑马鱼具有胚胎透明这一突出优点，绿色荧光便于观察，我们选取其作为构建Connexin48.5－GFP融合表达品系的实验动物，从而进行细胞连接蛋白Connexin48.5的定位以及功能研究.细胞连接蛋白是构成间隙连接的基本单位，6个连接蛋白聚合成一个中间有孔道的连接子，两个连接子对接形成一个间隙连接.目前在哺乳动物中发现的连接蛋白至少有20种，分子质量从26～50ku不等，依分子质量的不同而分别命名为Connexin32、Connexin48.5、Connexin26、Connexin43、Connexin36等［1－2］.细胞间隙连接是在相互接触的细胞之间建立的有孔道的、由连接蛋白构成的亲水性跨膜通道，允许无机离子、第二信使及水溶性小分子质量的代谢物质从中通过，从而沟通细胞达到代谢与功能的统一，在细胞生长、细胞增殖与分化、组织稳态、肿瘤发生、伤口愈合等生理和病理过程中具有重要作用.我们的工作有助于进一步研究连接蛋白以及间隙连接在这些过程中的具体功能.1 材料与方法1.1 材料实验所用的pBSKI2转基因质粒，大肠杆菌DH5α，野生型斑马鱼由本实验保存；分子克隆所需试剂，Taq酶，核酸外切酶ExoⅢ，限制性内切酶，核酸酶I－SceI 等均购自 Takara公司；Tris－HCl、EDTA、氯化钠、十二烷基磺酸纳（SDS）、酚－三氯甲烷、蛋白酶K等购于上海生工生物工程有限公司.斑马鱼饲养：所用斑马鱼均饲养于厦门大学生命科学院斑马鱼室循环水系统中，温度：24～30℃，光照周期：14h（光照）∶10h（黑暗），每天3次定时投喂丰年虫.1.2 方法1.2.1 利用 LIC（ligase independent cloning）的高效克隆方法构建pBSKI2转基因质粒从斑马鱼基因组中采用PCR的方法分段扩增并回收目的片段，包括连接蛋白基因的表达调控区域及蛋白编码区域.用BamHⅠ和HindⅢ对质粒pBSKI2进行双酶切并回收.在冰上混合载体和片段，加入1μL ExoIII，吹吸混匀，反应1h，然后加入1μL 0.5 mol／L EDTA（pH 8.0），吹吸混匀，终止反应.将反应体系放入60℃水浴锅5min，然后冰浴5min.之后转化大肠杆菌DH5α，冰浴30min后42℃热激45s，冰上放置5min.涂板，37℃恒温培养箱中培养16h后挑取单克隆，扩增后进行质粒提取并鉴定，获得目的克隆.1.2.2 核酸酶I－SceI介导的高效率转基因斑马鱼构建1）斑马鱼胚胎获取：在繁殖的前一天，光周期的暗周期前用隔板将繁殖的亲鱼分开，并在水箱底部铺上隔离网以防止亲鱼产卵后吞卵.次日清晨，将水族箱中的隔板拆掉，在光照的刺激下，雄鱼开始追逐雌鱼，并用身体冲撞雌鱼的腹部，这时雌鱼产卵，雄鱼排精，受精卵落入隔离网下.在卵产下0.5h内，捞出亲鱼，收集受精卵，用培养液清洗数次，待用.2）斑马鱼胚胎显微注射：优化注射条件，尝试质粒DNA浓度梯度和重组酶浓度梯度，确定目的基因整合效率最高时的注射条件（表1）［3－4］.表1 显微注射体系Tab.1 The microinjection cocktail?将获取待用的斑马鱼胚胎在琼脂固定槽中摆放整齐，在胚胎发育的单细胞期（约受精后40min内），将适量注射液注入胚胎细胞中（确保注入细胞中，而不是卵黄中），注射体积不超过胚胎总体积的1／10，注射完成后，将胚胎置于斑马鱼胚胎培养液中，28℃培养.每晚挑出弃去死去的胚胎并换液，注射后第2天晚上，在倒置荧光显微镜下观察，挑出发荧光的胚胎置于另一培养皿中培养；注射后第4天，将小鱼移入斑马鱼幼鱼培养箱中饲养.2 实验结果2.1 GFP与Connexin48.5融合表达的转基因斑马鱼品系的构建共构建了4个不同亚型的连接蛋白与GFP的融合表达质粒（pBSKI2－Connexin48.5－GFP、pBSKI2－Connexin39.9－GFP、 pBSKI2－Connexin28.6－GFP、pBSKI2－Connexin43－GFP），经斑马鱼胚胎显微注射后，注射质粒pBSKI2－Connexin48.5－GFP 的胚胎可观察到较强的荧光（图1），其余3个质粒未见发光.挑选出注射后发荧光的胚胎后，通过饲养、杂交、自交等过程，获得了纯合的Connexin48.5－GFP融合表达的转基因斑马鱼品系.图1 pBSKI2－Connexin48.5－GFP 注射结果（60×）Fig.1Microinjection results of pBSKI2－Connexin48.5－GFP（60×）2.2 Connexin48.5在斑马鱼眼球晶状体和脊索中的表达鉴定在获得纯合的Connexin48.5－GFP融合表达的转基因斑马鱼品系后，为了确定Connexin48.5在斑马鱼全鱼中的定位，进行了共聚焦拍照，结果显示Connexin48.5在斑马鱼眼球晶状体和脊索中高表达（图2，红色箭头所指区域），在晶状体中的高表达与已有的研究结果相同［5－7］，而其在脊索中的高表达是我们的一个新发现.由于已知细胞连接蛋白表达于细胞间的连接处，为了验证获得的融合表达品系的Connexin48.5表达情况是否正常，对大量表达于细胞间隙的连环蛋白β（β－catenin）进行了免疫荧光染色（红光）从而确定细胞膜的位置，与Connexin48.5－GFP放出的绿光对比后发现存在共定位（图3），这表明获得的转基因品系的Connexin48.5的细胞内表达定位情况正常，与GFP的融合表达不影响其正常功能.3 讨论通过核酸酶I－SceI介导下的转基因方法，成功构建了Connexin48.5与GFP融合表达的转基因斑马鱼品系（Connexin48.5－GFP）.利用该品系斑马鱼，通过对绿色荧光蛋白发光的观察确定了Connexin48.5在斑马鱼全鱼中的定位，该结果在验证了已有的研究成果的同时还做出了新的发现.作为工具，该品系斑马鱼在将来Connexin48.5的功能研究中将具有重要价值.相对于直接注射线性DNA的传统转基因方法，所采用的I－SceI介导下的转基因方法具有更高的阳性率.不过对于I－SceI提高转基因效率的分子机制目前尚无研究定论，认为一个可能的解释是由于I－SceI在对质粒进行酶切后仍会继续在识别位点与DNA相互结合，这种结合可能会提高目的DNA向核内的转运效率，从而提高目的片段插入基因组的效率.过去已有的研究显示Connexin48.5在mRNA水平于斑马鱼晶状体中高表达，且有证据表明其在晶状体发育中至关重要［3－4］，我们的实验结果在蛋白水平验证了Connexin48.5在晶状体中的高表达，这对研究其在晶状体发育中的具体功能具有重要指导作用.在此基础上，还发现Connexin48.5在斑马鱼脊索中也存在高表达，这一新发现表明Connexin48.5可能在斑马鱼的脊索发育中或神经系统功能中具有重要作用，这为将来Connexin48.5的功能研究指出了新的方向.【相关文献】［1］Kibschull M，Gellhaus A，Winterhager E.Analogous and unique functions of connexins in mouse and human placental development［J］.Placenta，2008，29（10）：848－854.［2］Yeager M，Harris A L.Gap junction channel structure in the early 21st century：facts and fantasies［J］.Curr Opin Cell Biol，2007，19（5）：521－528.［3］Violette T，Clemens G，Filomena R，et al.I－SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish ［J］.Mechanisms of Development，2002，118（1／2）：91－98.［4］Minjung K，Kyung K，Cheol K，et al.Real－time imaging of mitochondria in transgenic zebrafish expressing mitochondrially targeted GFP［J］.Biotechniques，2008，45（3）：331－334.［5］Charles K，William B，Seth K，et al.Stages of embryonic development of the zebrafish［J］.Developmental Dynamics，1995，203（1）：253－310.［6］Shaohong C，Tara C，Gunnar V.Expression of Connexin48.5，Connexin44.1，and Connexin43during zebrafish（Danio rerio）lens development［J］.Developmental Dynamics，2003，228（4）：709－715.［7］Shaohong C，Teresa S，Rickie M，et al.Connexin48.5is required for normal cardiovascular function and lens development in zebrafish embryos［J］.The Journal of Biological Chemistry，2004，279（35）：36993－37003.。