五章 植物脱毒技术

第8章 植物脱毒技术（4学时） 第一节 无病毒苗培育的意义 第二节 植物脱毒的方法 第三节 脱毒苗鉴定 第四节 几种植物的脱毒苗培育技术 本章小结

目的要求： (1)掌握植物微茎尖培养的脱毒方法； (2)一般掌握无毒苗木的鉴定方法； (3)掌握组织培养脱毒苗在生产上的重要意义； (4)一般掌握脱毒苗木的保存和利用方法

病毒在植物上的危害 通常危害植物的病毒有几百种，并且随着生产栽培时间的延长，危害程度越来越严重，种类越来越多。尤其是靠无性繁殖的作物，如利用茎(块茎、球茎、鳞茎、根茎、匍匐茎)，根(块根、宿根)、枝、叶、芽(顶芽、侧芽、球芽、不定芽)等通过嫁接、分株、扦插、压条等途径来进行繁殖的。像苹果、葡萄、草莓等。花卉的百合、唐菖蒲、水仙、郁金香、香石竹、菊花等，蔬菜的马铃薯、姜等。而以种子进行繁殖的种类，除豆类外，其他均可随着世代的交替而去除病毒，即病毒只能危害一个世代。而在无性繁殖的种类中，由于病毒通过营养体进行传递，在母株内逐代积累，危害日趋严重。一些园艺植物以小规模集约栽培，造成连作危害问题，并加重土壤传染性病毒的危害。 病毒的危害给植物生产带来的损失是很大的，如草莓病毒的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。葡萄扇叶病毒使葡萄减产10％～18％，为害马铃薯的病虫害则更多，大约有几十种，因此，给马铃薯生产带来严重障碍。花卉病毒的危害一般会影响花卉的观赏价值，其表现是花少而小，产生畸形、变色等。 为了提高植物的产量和质量，根除病毒和其他病原菌是非常必要的。虽然通过防治细菌和真菌的药物处理，可以治愈受细菌和真菌侵染的植物，但现在还没有什么药物可治愈受病毒侵染的植物。若一个无性系的整个群体都已受到侵染，获得无病毒植株的唯一方法就是消除营养体的病原菌，并由这些组织中再生出完整的植株。一旦获得了一个不带病原菌的植株，就可在不致受到重新侵染的条件下，对它进行营养繁殖。用组织培养法消除病毒是唯一行之有效的方法。 由于病毒对植物造成如此严童的危害。所以世界各国都开始重视这方面的研究，如日本用柑桔茎尖微嫁接繁殖无病毒柑桔营养系。美国用组织培养法，使苹果无病毒苗已工厂化育苗，并在全国普遍开展。 第一节 无病毒苗培育的意义 采用生物、物理、化学等途径防治病毒病收效甚微，甚至毫无成效。自从50年代发现通过组织培养的方法可以脱除严重患病毒植物的病毒种类，提高产量、质量。因此，到60至70年代组织培养的技术在花卉、蔬菜和果树等得到广泛的应用。生产无毒苗已形成一种产业，满足生产者对这种苗的大量需要。用组织培养方法生产无毒苗，是一个积极有效的途径，由于排除了使用药剂，所以对减少污染，防止公害，保护环境都有积极的意义。

第二节 植物脱毒的方法 一、 茎尖培养脱毒 （一）通过茎尖培养脱毒的原理 1.病毒在植物体内的分布 感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低，生长点(约0.1～1.0mm区域)则几乎不含或含病毒很少。这是因为分生区域内无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。 2.茎尖大小与脱毒效果 在切取茎尖时越小越好，但太小则不易成活，过大又不能保证完全除去病毒。茎尖培养脱毒，由于其脱毒效果好，后代稳定，所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径。 （二）方法 1.取样与消毒 剪取顶芽梢段3～5cm，削去大叶片，用自来水冲干净，在75%酒精中浸泡30s，用1%-3%次氯酸钠溶液消毒10～20min，最后用无菌水材料冲洗4-5次 2.剥取茎尖与接种 3.培养 接种后材料置25±2℃，光照度1500～5000lx,每日光照10～16h条件下培养.光照对茎尖培养的影响更大 4.生根诱导 一些植物茎尖培养形成绿芽后,基部很快发生不定根.而另一些植物茎尖不产生不定根,需经再诱导、生根才能成为完整植株 (三)培养基与培养方式 1.培养基 MS培养基适于多种植物茎尖培养。 2.培养方式 在进行脱毒培养时，由于微小的茎尖组织很难靠肉眼操作，因而需要一台带有适当光源的简单解剖镜(8～40倍)。除了在进行植物组织无菌培养一般工具外，还需要一套解剖刀。剥离茎尖时，应尽快接种，茎尖暴露的时间应当越短越好，以防茎尖变干。可在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行操作，有助于防止茎尖变干。和其他器官的培养一样，在进行茎尖培养时，首要是获得表面不带病原菌的外植体。因此，一般来说，茎尖分生组织由于有彼此重叠的叶原基的严密保护，只要仔细解剖，无须表面消毒就可以得到无菌的外植体。有时消毒处理还会增加培养物的污染率，所以选取茎尖前，可把供试植株种在无菌的盆土中，放在温室中进行栽培。浇水时要直接浇在土壤中而不要浇在叶片上。另外，最好还要给植株定期喷施内吸杀菌剂，可用多菌灵0.1％和抗生素(如0.1％链霉素)。对于某些田间种植的材料，可以切取插条插入Knop溶液中令其长大，由这些插条的腋芽长成的枝条，要比由田间植株上直接取来的枝条污染小得多。 为了保险起见，在切取外植体之前一般仍须对茎芽进行表面消毒。叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只须在75％酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，如香石竹，蒜和马铃薯等，则要用0.1％次氯酸钠表面消毒l0min。对于这些消毒方法，在工作中应灵活运用，如在大蒜茎尖培养时，可将小鳞茎在75％酒精中浸蘸一下，再用灯火烧掉酒精，然后解剖出无菌茎芽。在剖取茎尖时，把茎芽置于解剖镜下，一只手用细镊子将其按住，另一只手用解剖针将叶片和叶原基剥掉，解剖针要常常蘸入90％酒精，并用火焰灼烧以进行消毒。但要注意解剖针的冷却，可蘸人无菌水进行冷却。当一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将分生组织切下来，为了提高成活率，可带1～2枚幼叶，然后将其接到培养基上。接种时确保微茎尖不与其他物体接触，只用解剖针接种即可。将接种好的茎尖置于22℃左右的温度下。每天以16h 2000～3000Lx的光照条件下培养。由于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎尖需数月培养才能成功。茎尖培养的继代培养和生根培养和一般器官的培养相同，这里不再叙述。 二、 其他组织培养脱毒方法 （一）愈伤组织培养脱毒 通过植物的器官和组织的培养去分化诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗。感染烟草花叶病毒的愈伤组织经机械分离后，仅有40％的单个细胞含有病毒，即愈伤组织无病毒植株。愈伤组织的某些细胞之所以不带病毒，其理由是：①病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度；②有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。对病毒侵袭具有抗性的细胞可能与敏感的细胞共同存在于母体组织之中。但是，愈伤组织脱毒的缺陷是植株遗传性不稳定，可能会产生变异植株，并且一些作物的愈伤组织尚不能产生再生植株。 (二) 珠心胚培养脱毒 （三）茎尖嫁接脱毒 木本植物茎尖培养难以生根成植株，将实生苗砧木在人工培养基上种植培育，再从成年无病树枝上切取0．4～1．0mm茎尖，在砧木上进行试管微体嫁接，以获得无病毒幼苗。这在桃、柑橘、苹果等果树上已获得成功，并且有的已在生产上应用。 (四)花药培养脱毒 三、理化方法脱毒 （一）物理方法 1.高温处理 又叫热处理或温热疗法。其基本原理是一些病毒对热不稳定，在高于常温的温度下即钝化失活。 2.低温处理 低温处理又称冷疗法。适当增加低温处理时间可提高脱毒效果 （二）化学处理 1.病毒抗血清预处理 用齿舌兰环斑病毒（ORV）的血清处理兰属离体分生组织，提高了再生株中无ORV的植株频率， 2.RNA合成抑制剂处理 烟草愈伤组织培养基中加入2-硫脲嘧啶，可除去组织中马铃薯Y病毒 3.三氮唑核苷处理 三氮唑核苷又叫病毒唑，是防治动物RNA病毒和DNA病毒病的广谱性抗病毒制剂。 第三节 脱毒苗鉴定 上述途径培育得到的植株，必须经过严格的鉴定，证明确实无病毒存在，才是其正的无病毒苗，才可以提供给生产应用。鉴定的方法有多种。 一、直接检测法 直接观察待测植株生长状态是否异常，茎叶上有无特定病毒引起的可见症状，从而可判断病毒是否存在。 二、指示植物(indicating Plant)法 利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法，就是枯斑和空斑的测定法。这种专门选用以产生局部病斑的寄主即为指示植物，又称鉴别寄主。它只能鉴定靠汁液传染的病毒。指示植物法最早是美国的病毒学家Holmes 1929年发现的。他用感染TMV的普通烟叶的粗汁液和少许金刚砂相混合，然后在烟叶子上摩擦2～3d后叶片上出现了局部坏死斑。在一定范围内，枯斑与侵染性病毒的浓度成正比。这种方法条件简单，操作方便，故一直沿用至今，仍为一种经济而有效的鉴定方法。枯斑法不能测出病毒总的核蛋白浓度，而只能测出病毒的相对感染力。由于病毒的寄生范围不同，所以应根据不同的病毒选择适合的指示植物。此外还要求所选择的指示植物不但一年四季都容易栽培，并且在较长的时期内还能保持对病毒的敏感性和容易接种，而且在较广的范围内具有同样的反应。指示植物一般有两种类型：一种是接种后产生系统性症状，其病毒可扩展到植物非接种部位，通常没有局部病斑；另一种是只产生局部病斑，常由坏死、褪绿或环状病斑构成。 在接种时从被鉴定植物上取1～3g幼叶，在研钵中加10ml水及少量磷酸缓冲液(pH值7．0)，研碎后用两层纱布滤去渣滓，再在汁液中加入少量的500～600目金钢砂作为指示植物叶片的摩擦剂，使叶面造成小的伤口，而不破坏表面细胞。以后用棉球蘸取汁液在叶面上轻轻涂抹2～3次进行接种，后用清水冲洗叶面。接种时可用手指涂抹、用纱布或用喷枪等来接种。为确保接种质量接种工作应在防蚜虫温室中进行，保温15～25℃。接种后2～6d 可见到上述症状出现。木本多年生果树植物及草莓等无性繁殖的草本植物，由于采用汁液接种法比较困难，所以通常采用嫁接接种的方法。以指示植物作砧木，被鉴定植物作接穗，常用劈接法。 三、抗血清(antiserum)鉴定法 物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白，因而是一种较好的抗原，给动物注射后会产生抗体，抗体存在于血清之中称抗血清。不同病毒产生的抗血清有各自的特异性。用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。这种抗血清就是高度专一性的试剂，这种方法特异性高，测定速度快，一般几小时甚至几分钟就可以完成。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。抗血清鉴定法要进行抗原的制备(包括病毒的繁殖，病叶研磨和粗汁液澄清等)，抗血清的采收，分离等。血清可分装到小玻璃瓶中，贮存在-15～25℃的冰冻条件下。测定时，把稀释的抗血清与未知的病毒植物在小试管内混合，这一反应导致形成可见的沉淀。然后根据沉淀反应来鉴定病毒。 四、分子生物学鉴定法 1.双链RNA法