周建平-药品热原检查及细菌内毒素检查方法介绍

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细菌内毒素检查法的目的和前提
确保药品不含有能导致患者发热反应发生 的足量的细菌内毒素。
一定量的细菌内毒素可以被人体耐受，也 是SFDA允许的。
前提是假定引起发热反应的热原几乎全部 是内毒素。
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细菌内毒素检查法
凝胶法 光度测定法
浊度法（终点浊度法和动态浊度法） 显色基质法（终点显色法和动态显 色法）
1995年附录收载了经修订的细 菌内毒素检查法，正文收载了 13个品种。
2000年收载69个品种，并收载 了《细菌内毒素检查法应用指 导原则》
2005年版改热原73品种，增订 112品种，共计252个品种
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国内鲎试剂的生产情况
安度斯生物技术有限公司 湛江海洋生物制品厂 福州新北鲎试剂厂 厦门鲎试剂厂 福州东方鲎试剂厂 福州平潭东方鲎试剂厂 广西北海鲎试剂厂
细菌内毒素 鲎试剂 鲎试剂与内毒素的反应机理 细菌内毒素检查
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细菌内毒素
（细菌内毒素与热原的关系）
热原（Progen） 指临床上能使哺乳类动物产生热原反应的物质。
细菌内毒素（Endotoxin） 革兰阴性细菌细胞壁的构成成分，具有多种生物活 性，其化学结构是脂多糖（LPS）。
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实验动物
动物品系：均为远交系动物，普通级饲养。日本大 耳白（Japanese White），新西兰白（New Zealand White），青紫蓝，比利时白（Belgian White），Chinchillas 和 Dutch Belts
要求：健康合格、1.7～3.0kg、同一来源和品系。 性别:雌雄均可。雌性动物，比较温顺，易于捉持，
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鲎试验的发现
1956年Johns Hophins 大学动物学家Frederik. Bang发现革兰阴性细菌的粗制品能使鲎的血细胞 凝聚。
1963～1964年 Jack.Levin和Bang对细菌引起鲎 血凝聚进行研究，用内毒素和鲎血细胞溶解物证 明鲎血凝聚机制是一种酶反应。
• 广泛存在 • 非常稳定 • 其疏水末端非常易于自身或者与玻璃
容器结合而聚集，而不是与水混合 • 致热活性的高度不均一性
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细菌内毒素标准品的建立
不同细菌的内毒素对于鲎试剂的反应活性不同， 为保证鲎实验法的平行性和重复性，要建立一种 内毒素的标准物质作为实验中的控制标准。
由于大肠杆菌内毒素在天然内毒素中的致热活性 比较高，在各种细菌内毒素对鲎试剂反应的灵敏 性上处于中值的位置，且其稳定、可溶，因此一 般都采用大肠杆菌的内毒素作为标准内毒素标准 品。
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内毒素发热的峰型
呈典型的双峰型，前2小时内，先是持续 15-18分钟的缓慢升温，随后是快速地达到 高峰，经短暂的温度降低之后是第2个升温 时相，经6-9小时后体温恢复到基线值。
但当内毒素的量很高时，表现为快速的升 温，没有典型的双峰型。
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影响实验的其他因素
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注射体积和注射速度
通常给药剂量 ≤10 ml/kg体重，并应在10 分钟内完成注射。一般情况下，注射的速 度和体积并不影响发热反应，大部分受试 溶液可以在1-2 min内注射完成，但部分受 试产品具有明显和迅速的药理作用，可影 响或干扰发热反应，需要缓慢进行注射
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活化的G因子
G因子
凝固酶原
凝固酶
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凝固蛋白（凝胶）
凝固蛋白原
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美国和中国BET发展历史
USP24版收载 680多品种进行内 毒素检查，保留 热原检查的药品 不足30种
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1991部颁标准规定了4个品种 采用细菌内毒素检查方法，结 果阳性时以家兔热原检查法判 定。
1993年中国药典第二增补本开 始收载该法
8次测温变化≤ 0.4 ℃（可供3周使用）
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实验兔重复使用
1、结果符合规定的实验兔，休息48hr 2、复试用兔升温＜0.6℃且供试品合格，休息48hr 3、使用次数未达10次的实验兔 4、复试用兔升温≥0.6℃且供试品合格，按新兔测温合
格
（以上实验兔可重复使用）
5、结果不符合规定的实验兔 6、使用次数达10次的实验兔
（以上实验兔不可再使用）
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家兔重复使用
美国药典27版仅仅规定了家兔使用频率， 并没有规定年龄限制和重复使用长度，使 用的频率规定不得超过每2天1次，若在热 原实验中最大升温0.6度或更高，以及热原 实验结果为阳性时，间隔时间不得小于2周。 动物重复使用的长度在很大程度上取决于 所检测的样品的性质，当家兔成熟时开始 进入热原实验，至少可使用2年
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热原剂量确定
实验的设计是基于在不超过10分钟的时间内，给 予家兔静脉注射使动物能够耐受的，不多于 10ml/kg体重剂量的受试药物。
《中国药品检验标准操作规程》2005版提出 “ 供试品的剂量应按各该药项下的规定注射， 未规定剂量的药品，可根据该药的药理性质，在 不影响家兔正常生理的前提下，按体重计算（人 按50kg计），用临床一次剂量的3-10倍”
内毒素单位（ EU， Endotoxin Unit）
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细菌内毒素标准品的稀释
➢ CP2000年版规定内毒素标准品溶解后要在旋 涡混合器上混合15分钟，以后的每一步稀释前 要至少混合30秒，其他国家药典也有类似要求；
➢ 具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀 分布
➢ 不按要求进行旋涡混合会使所稀释的内毒素 效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对照不 凝等不正确的实验结果
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结果判断
1、复试：初试3只兔中仅1只升温≥0.6℃或 3 只兔升温均小于0.6℃、但升温总和≥1.4℃，
应另取5只复试。
2、合格：初试3只兔升温均小于0.6℃且升温 总和＜ 1.4℃； 5只复试中仅1只升温 ≥0.6℃且初试、复试共8只兔升温总和≤ 3.5℃。
3、不合格：初试3只兔中有2只升温≥0.6℃； 复试5只中2只以上升温≥0.6℃；初试、复 试共8只兔升温总和≥ 3.5℃。
多位学者对鲎血细胞溶解物（LAL）进行研究， 阐释了凝聚机制
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鲎试剂与分类
鲎试剂：鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成
鲎试剂的种类：
依据鲎的种类分：
美洲鲎试剂（LAL）
中国鲎试剂（TAL）
Biblioteka Baidu
圆尾鲎试剂（CAL）
依据检查方法分：
凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂
依据内毒素和鲎试剂反应的专一程度分：
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检查法
1、取合格兔，停食、停水，称重并固定约1小时
2、每隔30分钟测温一次，致连续2次温差≤ 0.2℃，并算得2次均值为正常体温。
3、及时配制供试液并预热至37～38 ℃
4、选兔并分组（初试3只/组、组内温差＜1.0℃ ； 复试5只/组）
5、注射供试液（分组后15分钟内）
6、计时开始并记录6次体温，间隔0.5小时，以6 次中最高温度减去该兔正常体温为升温值
普通鲎试剂和特异性鲎试剂
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鲎试剂的质量控制指标
灵敏度 自身凝集 缓冲能力 水分 微生物检查
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凝胶法鲎试剂与内毒素的反应机理
——复杂的酶促反应过程
内毒素 二价阳离子
C因子 B因子
活化的C因子 活化的B因子
（旁路反应）
β(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM
热原与内毒素的关系在学术上仍有争论，但在GMP 的条件下，内毒素是主要的热原物质，可以说无内 毒素就无热原，控制内毒素就控制热原。
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细菌内毒素定义变化
过去一直认为，细菌内毒素来源于革兰阴 性细菌，但最近发现革兰阴性菌之外的其 它菌中发现内毒素或内毒素样分子结构， 如真核小球藻样绿藻。
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热原检查（Pyrogen Test)
热原的含义 热原检查法基本原理 热原检查法基本操作 试验操作注意事项
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热原的含义
热原系指某些药品中含有的能引起体温升高 的杂质。
热原经静脉注入人体后15分钟即能产生强烈 的发热反应，重者昏迷甚至危及生命。
热原主要来源于革兰阴性菌的细菌内毒素。
所有内毒素均为脂多糖（LPS），但并非 所有的脂多糖均为内毒素，因为其不具有 相关的毒性。如：肽聚糖、葡聚糖 。
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细菌内毒素的生物活性
➢ 致热性 ➢ 引起血液中粒细胞下降 ➢ 激活凝血系统 ➢ 血压下降 ➢ 引起淋巴细胞的有丝分裂 ➢ 与鲎试剂反应
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细菌内毒素的特征
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标准内毒素
标准内毒素： 指经人工提取精制并经生物效价
测定的细菌内毒素，作为细菌内毒素检查的
标准品。
国际标准品（IS）
标准品
（RSE）
国家标准品（RSE）
标准内毒素
工作标准品 （CSE）
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细菌内毒素的量值
➢ 80年代以前以重量作为内毒素的单位 ➢ 1982年USP20引入以生物效价为量值的
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凝胶法
最简单、经济、应用最广泛，中国药典的 “仲裁”方法
体重增长较缓慢 动物的检疫、标记：一周的检疫期，动物编号和笼
具编号
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实验环境
实验室温度： 17-25℃ 实验室与饲养室温差：≤ 5 ℃ 实验温度变化： ≤ 3 ℃ 实验室：保持安静，避免强光、噪音等刺
激，注意实验兔之间相互影响。
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供试液配制
1、固体样品注意称量、稀释时的操作，避免 热 原和其它污染。
2、样品稀释时应注意准确性并尽量减少误差。 3、配制时应注意含量或效价(抗生素）的折算
问题以及总量是否够试验之用。 4、稀释用的灭菌注射用水及氯化钠注射液宜
经鲎试剂检查合格再用于稀释。
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新兔预选
1、新兔→饲养7日以上 2、预测体温（条件同热原检查）：测温
8次、间隔0.5小时。 3、中选条件：体温在38.0～39.6 ℃，
家兔热原实验中的热原阈值剂量应当认为是最低 标准，对于人体而言应尽可能的提高几倍实验的 安全范围。
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热原检查法基本操作
实验材料及设备 新兔预选
实验准备
家兔重复使用
实验动物
检查法
实验环境 供试液配制
结果判断（合格、复试、 重做、不合格）
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实验材料及设备
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热原检查法基本原理
被测物
试验 给药 动物 方法
测定设 备
判断标准
供试品溶液 （输液、小 家
针、粉针、 兔 注射用原料）
耳静脉 注射
肛温计 给药后体
或
温变化
测温仪
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试验基本原理
家兔热原实验与人体的热原反应有什么样 联系？
1969年Greisman 和Hornick研究比较了三 种纯化内毒素对家兔和健康男性志愿者的 反应，结果表明：人和家兔产生热原反应 需要大约相同重量的细菌内毒素，但当热 原的剂量增加时，人体反应较家兔更为强 烈。
药品热原检查与细菌内毒 素检查方法介绍
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北京市药品检验所药理室 周建平
2005年11月
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药品安全性检验内容
热原检查（Pyrogen Test) 细菌内毒素检查（Bacterial Endotoxin Test） 异常毒性检查 降压物质检查 过敏法反应检查法 降钙素生物测定法 生长激素生物测定法 溶血与凝聚检查法
导致发热减低药物不适合家兔热原实验， 如：解热镇痛药物、催眠药物、局麻药物、 吩噻嗪衍生物等。
磷酸缓冲液和其他特异的缓冲液，即使不 含有细菌内毒素，静脉输入足量的离子也 可引起家兔热原样反应
甾体激素和抗生素在许多哺乳动物可引起 发热
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鲎试剂与细菌内毒素检查法
细菌内毒素检查相关理论及概念
计量设备（天平、公斤称等）
电热干燥箱（可达250℃以上） 恒温水浴（37～38 ℃） 家兔固定盒
热原测温仪或肛温计（测温探头或肛温计）
其它用品（7#针头、 12#针头、注射器、 直镊、配制容器、灭菌注射用水、氯化钠 注射液、酒精棉球等）
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实验准备
热原测温仪或肛温计定期校验，符合计 量认证的要求。 实验用具的除热原处理：试验用注射器、 针头及一切与供试品溶液接触的器皿， 洗涤，干燥， 250℃,30分钟以上。