高效液相色谱柱说课讲解
第五章高效液相色谱法6hppt课件-PPT精品文档
四、检 测 器 高效液相色谱仪中的检测器是三大关键部件 (高压输液泵、色 谱柱、检测器)之一，主要用于检测经色谱柱分离后的组分浓 度的变化，并由记录仪绘出谱图来进行定性、定量分析。一 个理想的液相色谱检测器应具备以下特征：灵敏度高；对所 有的溶质都有快速响应；响应对流动相流量和温度变化都不 敏感；不引起柱外谱带扩展；线性范围宽；适用的范围广。 可惜至今没有一种检测器能完全具备这些特征。 常用的检测器为紫外吸收检测器 (UVD)、折光指数检测器 (RID)、电导检测器(ECD)和荧光检测器(FD)。 在高效液相色谱技术发展中，检测器至今是一个薄弱环节， 它没有相当于气相色谱中使用的热导池检测器和氢火焰离子 化检测器那样的即通用又灵敏的检测器。但近几年出现的蒸 发激光散射检测器(ELSD)有望成为高效液相色谱全新的通用 灵敏的质量检测器。
第四节 高效液相色谱仪简介 高效液相色谱仪可分为分析型和制备型，虽然它们的性能 各异、应用范围不同，但其基本组件是相似的，对分析型商品 仪器可有如下两种组合方式： ①完全紧凑的整体系统。其死体积小，灵敏度高，体现高 效液相色谱仪总体实用的特点。 ②独立部件的组合系统。其灵活性高，可根据不同的分析 目的，组装成不同的联接方式。 现在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很 高，即能控制仪器的操作参数 ( 如溶剂梯度洗脱、流动相流量、 柱温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等 ) ，又能对获得 的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰 面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、功能齐全 的分析工具。
（二）柱连接方式 柱接头通过过滤片与色谱柱管连接，在色谱柱管的上 下两端要安装过滤片，过滤片一般用多孔不锈钢烧结 材料。此烧结片上的孔径小于填料颗粒直径，却可让 流动相顺利通过，并可阻挡流动相中的极小固体颗粒， 柱出、入口的连接管的死体积亦 应愈小愈好，一般常用窄孔 (内径0.13mm)的厚壁(1.5— 2.0mm)不锈钢管，以减少柱 外死体积。所用柱接头，联 接螺帽，密封圈及色谱柱接 头皆为不锈钢材料。
第18章高效液相色谱法分析化学课件
50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的 固定相颗粒直径多在 150~200m 范围内。即使这样，流速仍然 很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！
但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效 地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10 m ）！ 直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定 相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及
正相和反相键合色谱法
固定相极性小 流动相极性大 反相键合色谱法 分析对象
如硅胶-C18，硅胶-苯基； 甲醇-水、乙腈-水、水和无机盐的缓冲液。 多用于多环芳烃(PAHs)等低极性化合物分离；改变流 动相配比，也可分离极性化合物；缓冲液可用于易离 解的化合物，如有机有机酸、有机碱和酚类。
在HPLC分析中，有时要在流动相中加入适量的盐(碳酸铵、四烷基铵盐)或酸，为 什么？答：都是为了防止峰形拖尾。加入盐类是为了减少待测物与键合相表面的残 留硅醇基作用；加入酸是抑制酸类待测物的离解，使其以游离酸在柱内分离。
2. k的影响因素： 与流动相极性有关，还与pH值有关 选择流动相：应同时考虑极性及pH值 酸性物质——加入酸HAc tR↑，k↑ 碱性物质——加入碱NH3·2O tR↑，k↑ H 调节pH范围：3.0～8.0 pH>8.0 破坏键合相与载体的结合 pH<3.0 腐蚀柱子 3.适用：极弱酸碱物质 pH=3～7弱酸；pH=7～8弱碱；两性化合物
（三） 亲和色谱法(AC)
原理：利用生物大分子和固定相表面存 在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。
高效液相色谱法培训课件
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第二节 高效液相色谱仪
高压输液系统由 溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置 和压力表 等组成。
1.溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑 料制成，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流 动相。
2.高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部 件之一，其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连 续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。 由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小， 因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过
送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法 引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压 力可达4.9107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料 填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数 可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可 对流
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第一节 概 述
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第二节 高效液相色谱仪
合，再输至柱系统。 梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调
整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通 过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的 程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通 过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温 度（温度程序）来达到。
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第二节 高效液相色谱仪
色谱柱，就需要高压泵注入流动相。 对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无
脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀， 密封性好。
高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。 恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和 柱渗透无关。 恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而 变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流 量。
高效液相色谱HPLC简介PPT学习教案
2～50
5～15 10-6～10-2 0.05～1.0
0.001～0.3 0.1～10 1～20
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２.2 HPLC的特点（二）
项目 进样方式
流动相 分离原理
检测器
应用范围
高效液相色谱法
气相色谱法
样品制成溶液
样品需气化或裂解
溶液
惰性气体
吸附、分配、筛析、亲和等
吸附和分配
UVD、PDAD、RID等 TCD、FID、ECD等
◆恒压泵--------压力恒 定，但 流量不 恒定；
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3.3 阻尼器介绍
阻尼器----消除、减轻往复式柱塞泵输出的压力脉动。
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检测器简介（一）
紫外吸收检测器（UVD）
◆
原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率 的变化来测定样品浓度的检测器。它具有波长固定，波 长可变和光二极管阵列三种类型。
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特点：选择性检测器、对流量和温度敏感性低、灵敏度较 高（10-9g）。
折光指数检测器（RID）
◆
原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试 样浓度的检测器。
特点：通用性检测器，温变化要保持在±0.001℃、灵敏度 低（10-6g）。
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检测器简介（二）
◆ 电导检测器（ECD）
原理：监测溶液的电导率变化的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组 成变化有明显响应、灵敏度低（10-3g）。适用于离子 型化合物。
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色谱柱简介（三）
高效液相色谱法—高效液相色谱仪(仪器分析课件)
• 内梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入梯度混 合室，混合后进入色谱柱。
• 外梯度：一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混合。
柱子内径一般为1～6 mm。常用的标准柱型是内径为4.6或 3.9 mm ，长度为15～30 cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度5 ～10 μm ，柱效以理论塔板数计大约 7000～10000。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
（三）检测器 1. 紫外吸收检测器 紫外吸收检测器是目前HPLC中应用最广泛的检测器。 2. 光电二极管阵列检测器（PDAD） 3. 示差折光检测器（DRD） 4. 电导检测器 5. 荧光检测器 6. 蒸发激光散射检测器
HPLC
HPLC
高效液相色谱仪 一、高效液相色谱仪工作流程及组成
• 1.高效液相色谱仪的工作流程图
一、高效液相色谱仪工作流程及组成 流 动 相
高压泵
2.高效液相色谱仪组成
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
检测器
检测器
二、仪器操作 （一）开机前 的准备
• 在开机前应详细阅读 仪器使用说明书，了 解仪器的参数、熟悉 仪器操作规程。
高压输液泵
3.. 梯度洗脱装置
高压梯度： 用于二元梯 度，用两个泵分别按设定 的比例输送A和B两溶液 至混合器
（二）进样装置 常见的 进样装置有： 1.隔膜进样 2.停留进样 3.六通进样 4.自动进样
（三）色谱分离系统
色谱柱是色谱仪最重要的部件（心脏）。通常用后壁玻璃 管或内壁抛光的不锈钢管制作的，对于一些有腐蚀性的样 品且要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟乙烯管。
高效液相色谱法 教案
高效液相色谱法教案一、课程目标：了解高效液相色谱法的基本原理、操作方法及其在实验室中的应用；通过实验操作，掌握高效液相色谱法的基本操作技能，能够熟练操作仪器，准确分析样品。
二、教学内容：1. 高效液相色谱法的基本原理2. 高效液相色谱法的仪器及其组成3. 高效液相色谱法的操作方法4. 高效液相色谱法在实验室中的应用三、教学步骤：1. 高效液相色谱法的基本原理（1）讲解高效液相色谱法的基本原理，包括样品制备、进样、柱填充材料、色谱柱等。
（2）讲解高效液相色谱法的优点，如高分离效率、分析速度快、适用范围广等。
2. 高效液相色谱法的仪器及其组成（1）讲解高效液相色谱法的仪器及其组成，如进样器、柱、泵、检测器、计算机等。
（2）讲解各部分仪器的作用和原理。
3. 高效液相色谱法的操作方法（1）实验前准备工作，包括仪器的开机、检查仪器状态等。
（2）样品的制备和进样操作，包括样品的选取、制备、进样量的确定等。
（3）柱的调试和运行，包括柱的选择、柱效的调试、柱的平衡等。
4. 高效液相色谱法在实验室中的应用（1）讲解高效液相色谱法在实验室中的应用，如药物分析、食品安全检测、环境监测等。
（2）介绍高效液相色谱法的局限性和未来发展方向。
四、教学要点：1. 理解高效液相色谱法的基本原理和优点。
2. 掌握高效液相色谱法的仪器及其组成，了解各部分仪器的作用和原理。
3. 掌握高效液相色谱法的操作方法，包括样品制备和进样、柱的调试和运行等。
4. 了解高效液相色谱法在实验室中的应用和局限性，了解未来发展方向。
五、教学方法：1. 理论讲解与实验演示相结合的教学方式。
2. 重视实验操作技能的培养，强调实验操作的规范性和精确性。
3. 运用多媒体教学手段，加强教学效果。
六、教学评价：1. 实验操作成绩：考核学生实验操作技能的熟练程度和实验数据分析能力。
2. 课堂测试：考核学生对高效液相色谱法基本原理、仪器及其组成、操作方法等方面的掌握程度。
waters xbridge protein beh色谱柱使用说明
waters xbridge protein beh色谱柱使用说明一、引言Waters XBridge Protein BEH色谱柱是一种用于分离和纯化蛋白质的高效液相色谱柱。
本文将详细介绍该色谱柱的使用方法，并说明如何充填和平衡柱子，以及优化分离条件和储存建议。
二、色谱柱的充填与平衡1. 初始准备在充填色谱柱之前，需确认柱子和其他设备已进行有效的清洗和消毒。
请确保所有操作都在洁净和无尘的实验环境中进行。
2. 色谱柱的底部连接将色谱柱的底部与液相色谱系统连接，确保连接紧密无漏。
确认柱子与系统的兼容性以及接口的完整性。
3. 柱子的充填使用适当的方法将柱子充填物均匀地充入色谱柱中。
充填时要小心谨慎，以避免产生气泡或不均匀的充填物分布。
4. 床高检查充填完成后，使用适当的工具测量柱子的床高。
确保床高符合规定，并进行必要的校正。
5. 柱子的平衡连接柱子至液相色谱系统，使用流动相进行柱子的平衡。
按照柱子说明书中的建议流速和平衡时间进行操作。
确保柱子完全平衡以获得稳定和可重复的色谱分离结果。
三、优化分离条件1. 流动相配制根据待分离蛋白质的性质和需求，选择合适的流动相。
通常包括溶剂体系、添加剂和缓冲剂的选择。
确保流动相的配制和pH值调整符合实验要求。
2. 流速优化通过改变流速来优化对待分离蛋白质的分离度和分离时间。
一般来说，较高的流速可提高分离速度，但可能会牺牲分离的分辨率。
根据实际需要进行适当的调整。
3. 温度控制对于某些蛋白质的分离，温度的调控也是必要的。
根据实验要求，选择适当的工作温度和温度控制方法。
4. 采集条件根据分析和应用的不同，选择适当的采集条件来获取所需的色谱峰。
根据具体实验目的，灵活选择分析和监测方法。
四、储存建议1. 柱子的保养每次使用后，根据色谱柱说明书中的建议进行柱子的保养和清洁。
遵循正确的操作规程，确保柱子处于最佳状态。
2. 储存条件当柱子不使用时，将其储存在干燥、阴凉和无尘的环境中。