甲基化检测方法

甲基化检测(detection of methylation)

概念：DNA 甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA 甲基化转移酶(DNMTs) 的作用下使CpG 二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。DNA 甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA 修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA 的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG 岛以外的CpG 序列非甲基化程度增加，CpG 岛中的CpG 则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。现有检测方法

1.甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA ，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA 链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化; 反之，说明被检测的位点不存在甲基化。

2.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA ，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR,在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR 产物进行测序就可以判断CpG

位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR 产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。

3.高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting ，HRM）

在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物, 这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR 扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC 含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。

送样要求

细胞（＞106个）、组织（＞300mg）、血液（＞1ml）、血清（》等样品材料，基因组DNA（体积》20卩I，浓度》50 ng/口l）。