实验一_碱变性法抽提质粒DNA
质粒DNA的提取
质粒DNA的提取一、原理采用碱变性发抽提取质粒DNA。
该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。
在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。
而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、方法1.挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。
2.将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。
反复数次，收集全部菌体。
3.倾去上清，滤纸吸干。
4.加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。
5.加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/LNaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。
6.加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染色体DNA。
7.上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。
8.上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。
9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。
10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。
lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。
12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。
质粒DNA的提取实验一
实验一质粒DNA的制备一、实验目的掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。
二、实验原理碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
三、实验材料:大肠杆菌 DH5ɑ pET HIS四、仪器与主要试剂(一)仪器设备1．恒温培养箱 2．恒温摇床 3．台式离心机 4．高压灭菌锅(二)器材1． 1.5mL 离心管 2．枪头、枪三)试剂溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L EDTA 、25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)溶液II： 200 mmol/L NaOH、1% SDS（新鲜配制：0.8ml ddH2O,0.1ml 2mol/LNaOH,混匀，0.1ml 10% SDS混匀）溶液III： 3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.5、1 mmol/L EDTA五、实验步骤1.取DH5ɑ pET HIS大肠杆菌菌液于LB（含Amp）平板上37℃过夜培养；2. 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇床~250 r/min 过夜培养；3.吸取1.5 ml菌液，12000 g离心5分钟，去上清（尽量将上清倒干净），收集菌体；4 加入100 μl溶液 I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）；（剧烈）5.加入200 μl溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟；6.加入150 μl溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；（温和）7.12000 g离心10分钟；取上清液400 μl（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf 管中8.加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，-20度2小时（或2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟）；9.12000 g 常温离心15分钟；10 倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）；11.室温放置或超净台上风干DNA；12. 加20 μl灭菌超纯水或TE溶解；13.质粒、BAC的质量检测，于-20℃保存。
实验一碱变性法抽提质粒DNA
(出现拉丝现象)
加入150μl溶液III，温和混匀10s，冰上放置3～5min。 (云雾状 沉淀)
12000rpm离心5min，取上清到一新Ep管(约440μl ) 上清加等体积氯仿/异戊醇（24/1），颠倒混匀2min，12000 rpm离心5min。 (分离蛋白质及核酸，氯仿可使蛋白质变性，异戊醇防止发泡) 取上清(约400μl )至新Ep管中。 加入2倍体积100%冰乙醇,混匀，室温放置5min。 12000 rpm 离心5min。 (沉淀质粒DNA ) 弃上清，加入70％乙醇1ml，颠倒漂洗（保持沉淀在管底），12000 rpm离 心3min。 (清除残余离子 )
DNA复性，变性蛋白－SDS＋, 线性DNA沉淀)
• 氯仿/异戊醇（24：1） ： 氯仿可使蛋白质变性，异戊醇 有助于消除抽提过程中出现的泡沫; • 无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀
• TE（pH8.0）: 10mmol/L Tris-Cl(pH8.0); 1mmol/L
EDTA(pH 8.0) (溶解DNA)
溶液Ⅰ
50mmol/L 葡萄糖; 25mmol/L Tris-Cl(pH8.0); 10mmol/L EDTA(pH 8.0) (主要作 用：Solution I 中的EDTA可以螯合二价金属离子进而抑制依赖于二价金属离子的DNA
酶的活性，对DNA起到保护作用。加入solutionⅠ后一定要充分打散菌体。)
上午下午碱变性抽提质粒dna核酸浓度和纯度分析核酸电泳及分子量测定质粒dna的酶切感受态细胞的制备质粒dna的酶切产物电泳试剂盒回收dna目的基因与载体的连接重组子筛选鉴定方法蓝白斑筛选真核基因组dna抽提1连接子的转化真核基因组dna抽提2菌落的pcr鉴定pcr产物的电泳质粒plasmid是一种染色体外的稳定遗传因子为双链闭环的dna分子并以超螺旋状态存在于宿主的细胞质中
实验一-碱裂解法提取质粒DNA
实验一、碱裂解法提取质粒DNA及检测一、实验目的与原理简介实验背景：质粒DNA的提取是基因工程操作中常用的基本技术。
质粒作为载体应具备下列四个特点:①有足够的容纳目的基因的幅度，并且对于携带的目的基因能够借助载体的复制和调控系统得到忠实的复制与增殖。
②在非必要的DNA克隆区有多种限制性核酸内切酶的单一识别位点，易于基因片段与载体的连接、重组与筛选。
③与宿主细胞有相同一个或多个遗传表型（如抗药性、营养缺陷型或显色表型反应等)。
④拷贝数多,易于宿主细胞的DNA分开，便于分离提纯。
分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA.实验原理：碱裂解法质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的.在强碱性pH时，染色体线性DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，调节pH值至中性时,变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性纠缠形成网状结构，经过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一直沉淀下来而被除去。
实验目的：提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法。
二．实验试剂1,SolⅠ100ml： 1M Tris-HCL（pH8.0）2。
5ml,0.5M EDTA 2ml, DDW 91ml, 20％葡萄糖4。
5ml( 葡萄糖单独灭,灭完后加入Sol I中），高压灭菌，4°保存.2,SolⅡ100ml:（新鲜配制，常温使用）10% SDS 50ml, 2M NaOH 50ml.使用前将两种溶液混合。
3，SolⅢ 500ml：KAc 147g， HAc57。
5ml，加300mlDDW搅拌,定容至500ml。
高压灭菌，4°保存。
4，70%乙醇无菌水DDW5，苯酚/氯仿/异戊醇（25：24:1)氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。
质粒DNA的提取分析
质粒DNA的提取一、原理采用碱变性法抽提取质粒DNA。
该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。
在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。
而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、方法1.挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。
2.将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。
反复数次，收集全部菌体。
3.倾去上清，滤纸吸干。
4.加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。
5.加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/LNaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。
6.加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染色体DNA。
7.上清液转移至另一微离心管中，加等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。
8.上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。
9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。
10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。
lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。
12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。
实验一 碱法提取质粒DNA
实验一碱法提取质粒DNA一、目的掌握微量移液器、高速离心机等的正确使用掌握碱法提取质粒DNA的原理和方法。
二、原理从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。
碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。
首先用含一定浓度葡萄糖的缓冲液（溶液Ⅰ）悬浮菌体，再加入溶液II（NaOH、SDS）后，碱性环境下菌体的细胞壁裂解，而使质粒缓慢释放出来，并且碱性条件使DNA的氢键断裂，宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主染色体DNA相对分子质量大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速配对恢复原来的构型而溶解在上清液中。
然后用酚、氯仿多次抽提进一步纯化质粒DNA 。
氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。
再用两倍体积的无水乙醇洗涤沉淀，以去除残留的氯仿。
最后用75％乙醇溶液洗涤沉淀，以去除残留的盐离子。
最后获得的质粒DNA储存在TE溶液中，-20℃保存。
用于下一步凝胶电泳鉴定。
三、仪器设备、材料与试剂仪器设备恒温培养箱恒温摇床台式离心机高压灭菌锅制冰机电子天平pH计量筒（10 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL）烧杯（50 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL）一次性手套无粉乳胶手套（光明牌，大、中、小三种号码）玻璃棒称量勺微量移液器（1 000 μL，200 μL，20 μL）酒精灯灭菌的1.5 mL 离心管（eppendorf管）灭菌吸头（1 000 μL，200 μL），相应的吸头盒吸水纸250mL三角瓶材料：含pKS质粒或pUC系列质粒的大肠杆菌。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于～这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、取培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
12000r/min，离心5min。
质粒DNA的提取实验报告
质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。
三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。
2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。
3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。
5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。
6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。
质粒DNA的提取——碱变性提取法
姓名系年级学号科目分子生物学实验题目质粒DNA的提取——碱变性提取法组别周一一、实验目的1．掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。
2．掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。
二、实验原理碱变性提取质粒DNA一般包括三个步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分解和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。
溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。
由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。
质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
三、实验仪器和材料试剂仪器：恒温振荡培养箱，高温冷冻离心机，漩涡振荡器，水浴锅，1.5ml离心管，不同型号吸头，微量移液管，三角瓶等菌体：含质粒puc19菌株 E.coli DH5α受体菌试剂：LB培养基，氨苄青霉素AP，溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNase A母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇混合液，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液1X，上样缓冲液。
四、实验步骤1.含质粒puc19菌株的培养及收获E.coli DHSα（puc19）→LB培养基+AP→37°c 12~16h→LB培养基+AP→37°c 4~6h→500μl管称重(14.239g) →取菌液300μl→配平离心6000转5min→弃清→加5ml Sol I混匀→6000转5min→弃清→称重(菌体与离心管总重量为14.425g)→菌体称重（0.187g）2. 细胞裂解提取质粒DNA加Sol I 2ml 菌体漩涡混匀，冰浴5min加Sol II 2ml 轻柔颠倒混匀，冰浴5min加Sol III 1.5ml轻柔颠倒混匀，冰浴5min平衡，12000转15min→转上清至新50ml管（V1=8.8ml）加（2V1=17.6ml）冰乙醇，颠倒混匀→-20°c 30min12000转15min→弃上清→5ml 70%乙醇洗涤12000转2min→弃上清→重复洗涤一次→37°c 5min1mlTE溶解→粗提物3.质粒DNA的纯化1.0ml粗提物+100μg RNaseA→37°c 1~2h→等分500μl x2份→加等体积分液，混匀→12000转姓名系年级学号科目分子生物学实验题目质粒DNA的提取——碱变性提取法组别周一5min→转上清至新管→加等体积酚，氯仿异戊醇→12000转5min→转上清至新管→加等体积氯仿异戊醇混匀→12000转5min→转上清于新管→加1/10体积=22.0μl 3M NaAc，混匀，此时两管中液体体积均为242μl→加2倍体=484μl的积冰乙醇混匀→-20°c 30min→12000转15min→弃上清→70%乙醇500μl洗涤→12000转2min→弃上清→重复洗涤一次→37°c 5min→25μl TE管溶解→共50μl质粒DNA/组4. 琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA五、实验结果1.本次试验电泳条带还算清晰，点样处有亮带，说明有杂蛋白2.染色体DNA条带比较暗，说明含量很低，提取样品纯度还算理想3.与marker比较我们提出的质粒分子量在范围之内4.与未添加RNase相比较，我们未出现模糊条带，证明RNase效果明显且操作方法正确5.出现RNA条带可能的原因是RNase反应时间不够或者反应混合不充分造成六、注意事项1.酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。
实验1质粒DNA碱变性法小量提取
实验一质粒DNA碱变性法小量提取南京大学生命科学院一、实验目的1、学习和掌握碱变性法快速提取质粒DNA的原理和方法2、学习如何用琼脂糖凝胶电泳法鉴定质粒DNA的纯度3、学习有关琼脂糖凝胶电泳的技术4、熟悉核酸染色的方法和DNA条带的观察二、实验原理质粒（plasmid）通常指细菌中独立于染色体外，能自主复制的遗传因子，它能够稳定地遗传某些性状。
天然的质粒都是环状双链DNA，大小从5kb到400kb不等。
质粒虽然独立于染色体外自主复制和遗传，但其复制又依赖于宿主编码的酶和蛋白质复制因子。
质粒按照其稳定拷贝数的多少可分为严谨型和松弛型，严谨型质粒在每个细菌细胞中有1～5拷贝，松弛型质粒在每个细菌细胞中可达10～200个，甚至更多拷贝。
强碱性条件下，宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不易被破坏。
当条件恢复正常时，质粒DNA迅速恢复天然状态。
离心除去变性沉淀物，质粒DNA留在上清液中，用乙醇或异戊醇沉淀质粒即可得到较纯的质粒DNA。
琼脂糖凝胶电泳是基因工程最常用的技术，主要用于分离、鉴定和纯化DNA分子。
带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，成为电泳。
以琼脂糖凝胶为支持介质的电泳方法已广泛用于核酸的研究中，DNA分子在高于其等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
DNA分子在电场中通过凝胶介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及分子形态有关。
由于带电分子的分子量差异或分子形态不同，电泳时呈现迁移位置的差异。
电泳后用核酸染料染色，形成一种荧光络合物，凝胶中含有的DNA即可直接用254nm紫外线分析仪观察到绿色荧光条带。
三、实验仪器和试剂一）仪器：1、台式高速离心机2、漩涡振荡器3、低压电泳仪4、水平电泳槽及梳齿5、紫外投射仪二）药品：1、STET 溶液2、RNase A (10mg/ml)3、酚4、氯仿5、NaAc(pH 5.2)6、无水乙醇7、75％乙醇8、RNase A (2mg/ml)9、TE 缓冲液:10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA pH8.0,10、溶液I ：50 mmol/L 葡萄糖，10 mmol/L EDTA ，25 mM Tris-HCl pH8.011、溶液II: 0.2mol/L-NaOH, 1%SDS12、溶液III:乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)：60mL 的5mol/L KAc,11.5ml 冰醋酸，28.5mL O H 213、电泳级琼脂糖：1％琼脂糖凝胶14、电泳缓冲溶液（1×TAE）15、染料：GoldView 5μL/100mL凝胶四、操作步骤质粒提取1.取过夜培养的细菌液1.5ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100μl溶液I，10μL的RNase A 充分混匀；2.加入200μl新配制的0.2mol/L NaOH+1％SDS（溶液II ），加盖颠倒6次使之混匀动作不可太大；3.加入150 μl乙酸钾溶液(溶液III)，加盖后颠倒6次混匀，动作不可以太大；4.12000rpm离心10min，将上清液转移至新的eppendorf管中，加入700μl无水乙醇；5.上清液中加酚抽提，振荡后10000rpm离心1min，吸300μL上清至新管中；同法用氯仿抽提一次，吸300μL上清至新管中，不足300μL加氯仿补足；6.上清中加2.2倍体积的无水乙醇，混匀后－20℃保存；7.12000rpm离心5min，弃去上清液，用1ml75％乙醇洗涤沉淀；8.12000rpm离心2min，弃去上清液，真空抽干后溶于30μLTE溶液。
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弃上清，将Eppendorf管于吸水纸上倒置1min，室温放置5min
加40μl TE（pH8.0，含无DNA酶的RNA酶20μg/ml），溶解DNA ，短暂混 匀，室温放置30min以消化RNA。
取10μl进行电泳，其余放置用于内切酶酶切实验，或-20℃贮存。
注意事项
• • • • 碱变性的时间严格控制 酸中和的时间可以适当延长 离心取上清时，不要吸取中间的蛋白层 漂洗沉淀时不要将沉淀冲掉
重组子筛选、鉴定方法 蓝白斑筛选 真核基因组DNA抽提1 菌落的PCR鉴定 PCR产物的电泳
试剂盒回收DNA 目的基因与载体的连接
连接子的转化 真核基因组DNA抽提2
实验一 碱变性法抽提质粒DNA
质 粒（plasmid）
• 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子, 为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于 宿主的细胞质中。 • 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它 具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒 定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
分离质粒DNA的方法
1. 碱变性法；
2. 煮沸法；
3. SDS法；
4. 羟基磷灰石层析法等
一、实验目的
通过本实验掌握碱变性法提取质粒DNA。
二、实验原理
质粒DNA
分子量小 超螺旋
细菌染色体DNA
分子量大 线性双螺旋
• 在pH 12-12.5时，线性DNA被彻底变性，但共价闭环质 粒DNA虽然氢键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠 绕结合在一起。 • 当在溶液体系中加入pH4.8的NaAC时，溶液恢复中性， 质粒DNA迅速复性，染色体DNA不能恢复，形成网状结构， 通过离心可以把变性的染色体DNA和蛋白-SDS复合物沉 淀分离出来。
漩 涡 混 合 器
离心&沉淀
云雾状沉淀
溶液Ⅱ (pH 12.6)
0.2mol/L NaOH ;1%SDS (现用现配) (主要作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和
蛋白质变性. Solution II要新鲜配置,NaOH可吸收空气中的二氧化碳而减弱碱性。加入 solution II后放置时间不要超过5min，以免变性质粒不易复性)
溶液Ⅲ (pH 4.8) 100ml 5mol/L NaAc 60ml; 冰醋酸 11.5ml; 双蒸水 28.5ml (作用：中和碱液，质粒
医学分子生物学实验
基因克隆实验技术部分
梁晓红 王晓燕 山东大学医学院免疫学研究所 2011-6
共100分
实验设计60% 考勤+实验报告40%
实验设计（3000~4000字）：
选题：结合自己的专业，利用基因工程技术
内容：1）立题依据；2）原理；3）实验材料；4）
实验方法；5）预期结果；6）参考文献（＞3篇） 评分标准：1）项目完整35分；2）创新性15分； 3）可行性5分；4）合理性5分。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生 素的抗性等。
（ 1）
存在于细菌染色体外的小 的共价、闭环双链DNA分 子。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:
严紧控制型(Strengent control)：复制受 宿主细胞的严格调控，拷贝数低； 松驰控制型(Relaxed control)：复制不受 宿主细胞的调控，拷贝数高, 适用于基因工程中 做载体。
三、实验仪器、材料与试剂
（一） 仪器
1. 恒温摇床
2. 超净工作台
3. 高压灭菌锅
4. 高速离心机
5. 微量取液器
（二） 材料
大肠杆菌JM109（pBR322-HBV）
HBV片段
pBR322-HBV
（三） 试剂
1. LB培养基 2. LA培养基（LB+Amp）
四、实验步骤
甘油保存的菌种JM109-PBR322-HBV,涂布于LA琼脂平板 37℃，培养过夜 挑取单克隆于2ml LA液体培养基中 37℃，220rpm振荡培养过夜 取1.4ml菌液入1.5ml的EP管中 12000rpm、离心30s，弃上清 重复上述步骤一次 100ul溶液I悬浮菌体（充分振荡) 加入200uL溶液II,颠倒混匀5次（轻柔），冰浴3～5min。
溶液Ⅰ
50mmol/L 葡萄糖; 25mmol/L Tris-Cl(pH8.0); 10mmol/L EDTA(pH 8.0) (主要作 用：Solution I 中的EDTA可以螯合二价金属离子进而抑制依赖于二价金属离子的DNA
酶的活性，对DNA起到保护作用。加入solutionⅠ后一定要充分打散菌体。)
注意事项
1.分组（4人/组） 2.隔离衣 3.离心机、移液器等使用
Restriction enzymes: 重组DNA技术的基本过程
选（分）
切
接
转→筛→扩
总体实验安排
上午 1
碱变性抽提质粒DNA
下午
核酸浓度和纯度分析 核酸电泳及分子 4
感受态细胞的制备 质粒DNA的酶切产物电泳
DNA复性，变性蛋白－SDS＋, 线性DNA沉淀)
• 氯仿/异戊醇（24：1） ： 氯仿可使蛋白质变性，异戊醇 有助于消除抽提过程中出现的泡沫; • 无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀
• TE（pH8.0）: 10mmol/L Tris-Cl(pH8.0); 1mmol/L
EDTA(pH 8.0) (溶解DNA)
(出现拉丝现象)
加入150μl溶液III，温和混匀10s，冰上放置3～5min。 (云雾状 沉淀)
12000rpm离心5min，取上清到一新Ep管(约440μl ) 上清加等体积氯仿/异戊醇（24/1），颠倒混匀2min，12000 rpm离心5min。 (分离蛋白质及核酸，氯仿可使蛋白质变性，异戊醇防止发泡) 取上清(约400μl )至新Ep管中。 加入2倍体积100%冰乙醇,混匀，室温放置5min。 12000 rpm 离心5min。 (沉淀质粒DNA ) 弃上清，加入70％乙醇1ml，颠倒漂洗（保持沉淀在管底），12000 rpm离 心3min。 (清除残余离子 )