激光多普勒用于脑血流的测量

2.显微镜和holder使用一定要细心，认真操作，摸索经验。
3.玻璃电极充夜时一定要排出气泡，否则不能将药导入。
示例：
Histamine 对大鼠脑皮质血管的作用
赵建军 email: zhaoj@
激光多普勒用于脑血流的测量
LDPM原理
激光由光纤到探头尖接触的组织。光线进入组织，被散射或吸收。激光照射区内运动的血细胞散射光，使光发生频移，这种频移称为多普勒效应。组织内非多普勒频移和多普勒频移光混合在一起。频移光与非频移光量的比例与光路上运动的物体数量相关。物体运动的方向对测量值几乎无影响。组织内部分光散射到探头，并由光纤通路返回到光探测器，在那里转换为电信号。从光探测器来的电信号被加工、虑过、分为不同的信号，表示为各种参数。组织内相关生理参数为：血液灌注量、测量区域内运动的血细胞数量、细胞的平均运动速率。信号之间的主要关系是：
TB值主要是一个技术参数，且必须在一定范围内。如TB值过低，仪器闪烁显示LLL(低光水平)；过高则显示OL（过载）。PF5010LDPM单元用于测量人类皮肤和肌肉微循环血流。它也可以用来监测动物所有组织的微循环血流。
LDPF使用原则
按照说明要求定期进行校准。
时间常数
使用前面板的时间常数按钮可以选择0.03、0.2、或3.0。时间常数是有关信号过滤、使信号平滑、清晰、容易分析。用于人体时应设在0.2（可显示心率）或3。时间常数是3时，反复的干扰值可能使提升信号水平。测量心率高的动物时，要求设成0.03以便了解细节。显示器数值更新频率不受时间常数影响。
实验准备：
仪器设备：激光多普勒血流仪（PeriFlux system 5000, PERIMED）；
脑立体定位仪（NARISHIGE,SN-2N）；
电刺激器（NIHON KOHDEN,SEN-3201）；
隔离器（NIHON KOHDEN,SS-102J）；
电脑万用表电钻
主要器械：手术器械（手术刀、镊子、止血钳、持针器、缝合针、注射器等），微量进样器，刺激电极，
4．另外一种给药方式：
1）同3.1。
2）用进样器直接在记录槽中加药(需要计算好给药浓度，保持记录槽中液体体积恒定，稀释后为最终工作浓度),同时观察和记录血管变化。血管的选取需要靠近脑片上表面。
注意事项：
1.必须保证脑片活性，否则直接影响实验结果。影响脑片状态的主要因素有：ACSF的PH值，保证在7.4左右；取脑的速度，必须快，最少要在1min内完成；修整脑块的时间尽可能短；ACSF的温度（呈冰水混合状态最好）；在孵育时，脑片不能重叠，并使其两面都能接触到ACSF。
微量进样器：精度要达到1μl，抽取用ASCF配制的1mmol谷氨酸，将其注射至要刺激的核团，能使神经元兴奋，进而观察到血流的变化。
示例：HA对脑血流的作用
赵建军email: zhaoj@
灌注量=测量区域内运动的血细胞数量×细胞的平均运动速率
血液灌注量
LDPM测量的血液灌注量是个相对的值（半定量）。它代表导致多普勒频移的相关移动血细胞数量，和相关细胞移动速度。这个值表示为灌注单位（PU）。血液灌注量在微循环研究中是个非常重要的参数。
运动的血细胞浓度
CMBC（运动的血细胞浓度）代表导致多普勒频移的相关移动血细胞数量。这个值随细胞数量的增加而成线性增加。当研究例如动物应用药物的影响或研究镰状细胞或其他血细胞的影响时，这个参数非常有用。只有少数科学论文研究CMBC信号。
2.0
0.493
0.986
1.972
*CaCl2
110.99
2.0
0.222
0.444
0.888
*C6H12O6·H2O
198.17
10
1.982
3.964
7.928
*用前加入，以免浑浊或污染。
4.玻璃电极制备：玻璃电极拉制仪按使用说明操作。
实验程序:
1．脑片制备：
1）ACSF置冰箱中至冰晶形成。
2）冰盒内放入50ml烧杯，加冰ACSF；手术器械在冰面上预冷，培养皿倒置冰面上，上覆一条滤纸，滴加ACSF。在250ml烧杯内加入100ml左右ACSF，再放入尼龙筛。在切片盒内加入冰ACSF。向ACSF内通入CO25%O295%混合气。在标本台上加502胶。
2）打开电脑、显示器、摄像记录系统、显微镜光源、电动holder。
3．镜下观察神经递质对脑血管的作用：
1）用吸管将脑片移入记录槽，尼龙弓固定脑片。63×水浸镜头下观察脑片状态，脑片选取以神经元状态良好为准（神经元胞体和突起清晰，立体结构明显）。寻找血管形态清晰，带有梭形平滑肌的血管。
2）预先用ACSF配制所需浓度的神经递质溶液，用加样器加入溶液，必须用手指轻弹排除气泡，装入holder。
工作浓度mM
配液浓度（g/L）
1L
2L
4L
NaCl
58.44
124
7.247
14.494
28.98
KCl
74.55
3
0.224
0.448
0.896
NaHCO3
84.01
26
2.184
4.368
8.736
NaH2PO4·2H2O
156.01
1.24
0.193
0.386
0.772
MgSO4·7H2O
246.47
LDPM血流探头的应用
把探头放在要测量的部位，探头尖轻轻接触组织，保持无压力接触。如接触有压力，则组织供血受到一定阻断，读数会不正确。把探头光纤线固定在测量目标最近的固定物体上，使其在测量过程中不会移动。应减少从灯直射来的光（光会影响测量值）。仪器输出的数据应该通过计算机，用软件(如PSW)记录、存储。
连接探头
注意仪器上的每个光接头各有一个防尘帽，接探头前应取下，用过后盖上。
步骤如下：
1.接探头前取下防尘帽，最好常用无绒布蘸酒精擦净光学接头部位以确保光路畅通，以防灰尘降低光的通量。灰尘及油污等物积累过多可能会堵塞激光多普勒或探头光接头的光路，使仪器测不出数据（此时TB值不在允许范围内即0-10之间），应该蘸酒精擦净所有光接头。
微分相差干涉显微镜及图像摄像记录系统
图像摄像记录系统（HAMAMASU Cameracontroller, C2400－60、Japan）
振荡切片机（Vibroslice）
玻璃电极拉制仪（SUTTER INSTRUMRNT COMPANY）
微电泳仪（自制）
3． 人工脑脊液(ACSF)配制：
分子式
分子量
应用DIC显微镜观察神经递质对大鼠脑片血管作用的方法
实验准备：
1．器械：剪刀、止血钳、不锈钢铲、50ml、250ml烧杯、注射器、培养皿、剃须刀片、玻璃钩、滤纸、加样器、尼龙筛（尼龙网和直径6cm塑料瓶盖制成）、尼龙弓玻璃电极毛胚。
器：微分相差干涉显微镜（DIC,带水浸镜头，LEICA DMLFS）
3.待血流平稳后，给予刺激，观察并记录血流变化。
电刺激参数：采用长串方波，波宽＜1ms，常用0.4或0.2ms，强度＜20V或200μA,频率在100Hz以下。
刺激电极尖端定位：判定刺激电极的位置是判定刺激效果的决定性步骤，一般采用直流电凝固法。即将单极刺激电极接阳极，动物头皮连阴极，或同心圆电极外套连阳极，内芯连阴极通电流1mA左右，15－60s的直流电。将脑固定，做组织学鉴定。
2.把探头上的插头轻轻插入仪器前面板上的接头中。仪器上的红色接头接探头上的红色接头。红色接头上有一个对准突起，应确保把它接到插孔上的槽中。轻轻用力推并顺时针旋转。
3.轻拉探头试一下，确保接头接好。
4.不用时盖上防尘帽。
给LDPM血流探头做清洁、消毒、灭菌。
探头可用中性清洁剂和水清洗。尽快除去血迹和灰尘。探头接头应该用无绒布蘸酒精擦(光通路部分)，以确保光路畅通。探头或探头座上的胶可用医用苯清除。
3）在5×镜下，调节holder，使电极尖端置于显示屏中心点，到电极和脑片皆清晰为止，转换63×镜头（务必先将镜头抬起，再转换）。在63×水浸镜头下，仔细控制holder，将电极置于血管旁1-2μm。微电泳仪正极与玻璃电极相连，负极联入记录槽。电流强度20μA。
4）给予刺激后观察血管舒张和收缩情况。
试剂及药品：人工脑脊液（ACSF）用于配置药品。
动物：SD大鼠20－250g
实验方法：
1.打开LDPM和电脑，运行PSW程序。
2.大鼠用1%戊巴比妥钠40mg/kg麻醉，去除头顶的毛，放到立体定位仪上，按照使用说明固定好大鼠。碘伏消毒，剪开皮肤，暴露颅骨，在其上定位并标记要刺激核团和记录脑血流的点，用电钻小心开颅。一臂固定刺激电极或微量进样器，另一臂固定LDPM探头，仔细将电极、探头插入特定部位。
3）50－150g大鼠用剪刀断头，迅速取脑，放入50ml烧杯内，用不锈钢勺取出放培养皿上，剃须刀片切取相应部位，干滤纸条蘸干水份，并粘于标本台上。振荡切片，片厚350-500μm，用吸管转移脑片至500ml烧杯尼龙筛上，25℃孵育1h备用。
2．仪器及设备连接：
1）ACSF倒入滴瓶内，输液管连于记录槽入液口，调节流速1ml/min，打开蠕动泵排出液体，通入CO25%O295%混合气。打开水浴锅，利用虹吸原理给载标本台加温，使记录槽温度保持载32℃。
细胞运动速率
V代表测量体积内相关血细胞的平均移动速度。这个值与血细胞速度线性相关。当研究例如药物或不同刺激的影响时，这个参数非常有用。只有少数科学论文研究V信号。
回光总量（TB）
是返回到光探测器的激光总量，包括发生多普勒频移和未发生频移的。TB值与诸如组织特性（颜色、组织内血细胞数量）有关。因为血细胞中的血红蛋白吸收光，所以血细胞密集程度越高，反射的光越少，因而TB值越低。这样，TB值与组织中的血细胞含量而不是血液灌注量相关。TB值也与与功率、探头光纤间距、探头中光纤总的接收面积等技术参数有关。