谷氨酸发酵生产

谷氨酸发酵生产

谷氨酸发酵

一、实验目的

谷氨酸(glutamic acid)是最先成功地利用发酵法进行生产的氨基酸。谷氨酸发酵是典型的代谢调控发酵，其代谢途径相对研究得比较清楚。因此，了解谷氨酸发酵机制，掌握其发酵工艺，将有助于对代谢调控发酵的理解，有助于对其他有氧发酵的理解和掌握，也有助于对已掌握的生化、微生物知识的融会贯通。

通过本次实验，掌握有氧发酵的一般工艺，熟练掌握通用机械搅拌罐的设备使用。

二、实验原理

1、谷氨酸发酵机制

谷氨酸发酵是菌体异常代谢的产物，菌体正常代谢失调时，才能积累谷氨酸。在正常的微生物代谢中，由葡萄糖生成的磷酸烯醇式丙酮酸比天冬氨酸优先合成谷氨酸。谷氨酸合成过量时，谷氨酸抑制谷氨酸脱氢酶的活力和阻遏柠檬酸合成酶的合成，使代谢转向天冬氨酸的合成。天冬氨酸合成过量后，反馈抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活力，停止草酰乙酸的合成。所以，在正常情况下，谷氨酸并不积累。

谷氨酸生产菌由葡萄糖生物合成谷氨酸的途径见图5-7。它包括糖酵解途径(EMP途径)、磷酸己糖途径(HMP途径)，三羧酸循环(TCA循环)、乙醛酸循环，伍德-沃克曼反应(CO的固定反应等)。 2

由于谷氨酸生产菌生理方面有以下共同特征，体内的代谢控制平衡被打破，使谷氨酸得以积累。

? 谷氨酸生产菌大多为生物素缺陷型。谷氨酸发酵时，糖酵解经过EMP

及HMP两个途径进行。生物素充足时，HMP途径所占比例是38%，

控制生物素亚适量的结果，发酵产酸期，HMP途径所占比例下降到约

为26%，EMP途径所占的比例得以提高。通过控制生物素亚适量，更

重要的是由生物素促进的脂肪酸及磷脂合成减少，谷氨酸向膜外漏出，

引起代谢失调，使谷氨酸得以积累。

? 谷氨酸生产菌的CO固定反应酶系活力强，可通过羧化作用(更多地2

供应固定CO生成苹果酸或草酰乙酸转化成柠檬酸。 2

? 谷氨酸生产菌的异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，使进入谷氨酸生成

期后的乙醛酸循环弱，使异柠檬酸更多地转化成α-酮戊二酸。

? 谷氨酸产生菌应丧失或仅有微弱的α-酮戊二酸脱氢酶活力，使α-酮戊二酸不能继续氧化。但谷氨酸脱氢酶活力很强，同时NADPH氧化能力2

弱，这样就使α-酮戊二酸到琥珀酸的过程受阻，在有过量铵离子存在

时，α-酮戊二酸经氧化还原共轭的氨基化反应生成谷氨酸而分泌泄漏

于菌体外。

? 谷氨酸产生菌不利用菌体外的谷氨酸，谷氨酸最终得到积累。

2、谷氨酸发酵工艺

三、谷氨酸发酵方法

(一)谷氨酸菌种的制备

1、斜面种子的制备

(1)斜面培养基配方:葡萄糖 0.1,;蛋白胨 1,;牛肉膏 1,;氯化钠 0.5,;

琼脂 2,;pH 7.0。

(2)接种后于30?恒温培养24 h，备用。

2、一级种子的制备

(1)培养基配方:葡萄糖2.5%;尿素0.5%;硫酸镁0.04%;磷酸氢二钾0.1%;

-6玉米浆2.5%,3.3% (按质增减);硫酸亚铁、硫酸锰各2 ×10 g/L;pH 7.0。

(2)用1000 ml三角瓶装300 ml培养基，封口膜封口，0.1 MPa灭菌30 min，

接种后30?、 120 r/min培养12 h。

(3)种子质量标准:ΔA560(560 nm吸光度净增值)> 0.5;pH 6.4?0.1。 3、二级种子的制备

(1)培养基配方:葡萄糖2.5%;尿素0.5%;硫酸镁0.04%;磷酸氢二钾0.16%;

-6玉米浆2.5% (按质增减);硫酸亚铁、硫酸锰各2 ×10 g/ L(0.0002,);

pH 7.0。

(2)用1000 ml三角瓶装300 ml培养基，封口膜封口，0.1 MPa灭菌30 min，接种量为10,(300 ml培养基中接入一级菌种30 ml)，接种后30?、 120

r/min培养7,8 h。

(3)种子质量标准:ΔA560 > 0.6;pH 7.2;无杂菌检查阴性(镜检、平板涂布);噬菌体检查阴性(斑点试验法)。二级种子培养结束时，无杂菌或

89噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数为10-10 /ml。镜检:a、用无菌操作方式取发酵液少许～涂布在载玻片上,

b、自然风干后～用番红或草酸铵结晶紫染色1，2 min～水洗,

c、干燥后在油镜下观察。

平板涂布检查:

a、配制营养琼脂培养基,蛋白胨1,～牛肉膏0.3,～NaCl

0.5,～琼脂2,～pH7.2,～灭菌～倒平板,

b、取少量待检发酵液经稀释后涂布在营养琼脂平板上～适宜

条件下培养,

c、观察菌落形态。

噬菌体检查,斑点试验法,:

a、培养基:葡萄糖0.1,～蛋白胨1,～牛肉膏1,～NaCl 0.5,～

琼脂2,～pH7.0

b、采用混菌法制备好混有发酵菌种的平板～再用接种环或无

菌吸管取少许发酵液在平板上点种～培养后～观察是否有

噬菌斑出现。

(二)谷氨酸发酵

1、发酵培养基

葡萄糖 13,;尿素 2,;磷酸二氢钾 0.1,;硫酸镁 0.06,;硫酸亚铁、

-6硫酸锰各2 ×10 g/(0.0002,)L;玉米浆0.6,。

2、发酵工艺参数

(1)装料系数:0.7(30 L发酵罐装料20 L)。

(2)培养基灭菌:实消。0.1 MPa灭菌30 min。

(3)接种:火焰封口法。

(4)接种量:10,。

(5)发酵过程工艺控制

? pH控制:酸碱调节。2 mol/ L NaOH溶液(称取80 g NaOH 溶于100 mL 蒸馏水中);1 mol/ L HCl 溶液(量取36 mL 盐酸溶于64 mL蒸馏水中)。

? 罐压:0.03,0.05 MPa

? 消泡:

(6)发酵过程分析

发酵过程中，按以下频次测定、记录以下指标(按表2-1要求及时记录): pH、风量、还原糖、A、温度 1次/小时 560

谷氨酸含量 1次/4 h，发酵12 h起开始 (7)质量检测:每4h检查一次，无杂菌检查，噬菌体检查。 (8)放罐:达到放罐标准后，及时放罐。

放罐标准:残糖在1,以下且糖耗缓慢(<0.15, / h)或残糖<0.5,。