谷氨酸发酵

谷氨酸发酵目前工业上应用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒状杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌、噬氨短杆菌等。

我国常用的菌种有北京棒状杆菌、纯齿棒状杆菌等。

谷氨酸除用于制造味精外，还可以用来治疗神经衰弱以及配制营养注射液等。

我国的谷氨酸发酵虽然在产量、质量等方面有了较大的提高，但与国外先进水平相比还存在一定差距。

主要表现在：设备陈旧，规模小，自控水平、转化率和提取率低，易受噬菌体污染，废水污染问题尚未完全解决等。

一、菌种的选育主要通过基因突变、基因工程、细胞工程得到优良的菌种。

可以从自然界中先分离出相应的菌种，再用物理或化学的方法使菌种产生突变，从突变个体中筛选出符合生产要求的优良菌种。

在谷氨酸发酵中，如果能够改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断地排到细胞外面，就会大量生成谷氨酸。

研究表明，影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。

因此，对谷氨酸产生菌的选育，往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手，以提高细胞膜对谷氨酸的通透性，如生物素缺陷型菌种的选育。

1.谷氨酸生产菌的生化特征1. α-酮戊二酸氧化能力微弱: α-酮戊二酸脱氢酶丧失或活性低.2. 谷氨酸脱氢酶活性强.3. 还原性辅酶Ⅱ(NADPH+H+)进入呼吸链能力缺陷或微弱.4. 异柠檬酸裂解酶活力微弱.5. 不利用谷氨酸.6. 耐高糖耐高谷氨酸 .7. CO2固定能力强.8 .解除谷氨酸反馈抑制.9. 具有向胞外分泌谷氨酸的能力.2.谷氨酸产生菌棒杆菌属：北京棒杆菌钝齿棒杆菌谷氨酸棒杆菌短杆菌属：黄色短杆菌产氨短杆菌小杆菌属：嗜氨小杆菌节杆菌属：球形节杆菌3.共同点：1. α-酮戊二酸氧化能力微弱: α-酮戊二酸脱氢酶丧失或活性低.2. 谷氨酸脱氢酶活性强.3. 还原性辅酶Ⅱ(NADPH+H+)进入呼吸链能力缺陷或微弱.4. 异柠檬酸裂解酶活力微弱.5. 不利用谷氨酸.6. 耐高糖耐高谷氨酸 .7. CO2固定能力强.8 .解除谷氨酸反馈抑制.9. 具有向胞外分泌谷氨酸的能力.谷氨酸棒状杆菌谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)是好氧细菌，可用于微生物发酵工程生产谷氨酸来制取谷氨酸钠（味精），谷氨酸棒状杆菌在发酵过程中要不断地通入无菌空气，并通过搅拌使空气形成细小的气泡，迅速溶解在培养液中（溶氧）；在温度为摄氏30到37度，pH为7到8的情况下，经28到32小时，培养液中会生成大量的谷氨酸。

在谷氨酸生产中，培养基中碳氮比为4:1时，菌体大量繁殖而产生的谷氨酸少；当碳氮比为3:1时，菌体繁殖受抑制，但谷氨酸的合成量大增。

在发酵过程中，当pH呈酸性时，谷氨酸棒状杆菌就会生成乙酰谷氨酰胺；当溶氧不足时，生成的代谢产物就会是乳酸或琥珀酸。

二、合成途径：谷氨酸棒状杆菌在一定的条件下能够利用环境中的葡萄糖来合成谷氨酸。

谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经糖酵解(EMP途径)和己糖磷酸支路(HMP途径)生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A(乙酰COA)，然后进入三羧酸循环，生成α-酮戊二酸。

α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。

谷氨酸的生物合成葡萄糖中间产物a－酮戊二酸谷氨酸谷氨酸脱氢酶NH4＋抑制谷氨酸的生物合成葡萄糖6-P-葡萄糖6-P-葡萄糖酸3-P-甘油醛5-P-核糖丙酮酸乙酰CoA草酰乙酸柠檬酸苹果酸异柠檬酸延胡索酸琥珀酸α-酮戊二酸谷氨酸透过细胞膜谷氨酸三、培养基（一）培养基培养基应满足微生物生长所需要的碳源、氮源、水、无机盐和生长因子等营养需求。

在工业生产过程中常采用天然成分作为营养物质的液体培养基（1）液体培养基能使营养物质在发酵过程中得到充分的利用，还能为菌体提供更大的生存空间。

同时，也有利于生产过程中培养条件的控制以及产物的提取。

（2）采用天然物质作营养物质既能满足菌体的营养需求，又能降低生产成本，还能减少对环境的污染。

（二）培养基的配制原则：（1）根据不同的菌种，应选择不同的材料配制培养基。

配制的培养基应满足微生物在碳源、氮源、生长因子、水、无机盐等方面的营养要求，并为微生物提供适宜的pH。

（2）培养基的营养要协调，以利于产物的合成。

（3）培养基在满足微生物的营养需求的基础上应尽量降低生产成本，以得到更高的经济效益。

例如：发酵生产常采用天然成分的液体培养基。

而且，经常用野生的植物淀粉、甘蔗渣、秸秆水解物以及乙醇、醋酸等石化产品代替粮食来配制培养基。

1. 碳源：淀粉水解糖、糖蜜、乙醇、烷烃（1）淀粉水解糖的制备（2）糖蜜原料2.氮源：铵盐、尿素、氨水C/N＝100：15~21，实际高达100：28因为：1）用于调整pH。

2）分解产生的NH3从发酵液中逸出。

产酸阶段：NH4+过量：促使谷氨酸生成谷氨酰胺。

3.无机盐：磷酸盐、镁、钾、钠、铁、锰、铜，其中磷酸盐对发酵有显著影响。

不足：糖代谢受抑制，菌体生长不足。

过多：a.细胞膜磷脂生成量多，不利于谷氨酸排出。

b.促使丙酮酸和乙醛（由丙酮酸脱羧生成）缩合生成缬氨酸的前体物——α－乙醛乳酸，使缬氨酸在发酵液中蓄积。

4. 生长因子：生物素生物素：B族维生素的一种，又称维生素H或辅酶R。

是合成脂肪酸所必需的。

作用：影响细胞膜通透性和代谢途径。

（1）作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，进而影响磷酯的合成。

（2）浓度过大：促进菌体生长，谷氨酸产量低。

因为：a.乙醛酸循环活跃，α-酮戊二酸生成量减少。

b.转氨酶活力增强，谷氨酸转变成其它氨基酸。

生物素：B族维生素的一种，又称维生素H或辅酶R。

是合成脂肪酸所必需的。

脂肪酸的生物合成：利用乙酰CoA（直接原料是丙二酸单酰CoA）在乙酰CoA羧化酶（辅基为生物素）催化下合成。

四、灭菌“灭菌”指的是用化学或物理的方法杀灭或除去物料及设备中所有的有生命物质的技术或工艺流程。

灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指菌体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后，其细胞发生溶化、消失的现象。

工业上常用的方法有：干热灭菌、湿热灭菌、化学药剂灭菌、射线灭菌和介质过滤除菌等几种在酵母菌发酵的过程中通常采用加热进行灭菌。

五、谷氨酸发酵的工艺控制①氧。

谷氨酸产生菌是好氧菌，通风和搅拌不仅会影响菌种对氮源和碳源的利用率，而且会影响发酵周期和谷氨酸的合成量。

尤其是在发酵后期，加大通气量有利于谷氨酸的合成。

②温度。

菌种生长的最适温度为30～32 ℃。

当菌体生长到稳定期，适当提高温度有利于产酸，因此，在发酵后期，可将温度提高到34～37 ℃。

③pH。

谷氨酸产生菌发酵的最适pH在7.0～8.0。

但在发酵过程中，随着营养物质的利用，代谢产物的积累，培养液的pH会不断变化。

如随着氮源的利用，放出氨，pH会上升；当糖被利用生成有机酸时，pH会下降。

④磷酸盐。

它是谷氨酸发酵过程中必需的，但浓度不能过高，否则会转向缬氨酸发酵。

发酵结束后，常用离子交换树脂法等进行提取。

六、影响菌体的发酵条件：发酵生产中温度、pH、溶氧量等对发酵过程有重大影响；随着代谢的进行，产热的增加、营养物质的消耗，以及某些酸性和碱性物质的产生，会使温度、pH等发生变化，这些都会对微生物的生长造成不利影响。

因此，需要对发酵过程的中温度、pH、溶氧量等发酵条件进行严格的控制，以保证菌体生长和代谢途径朝着有利人类的方向进行。

七、谷氨酸的提取方法1.等电点沉淀法（1）水解等电点法（2）低温等电点法（3）低温连续等电点法2. 不溶性盐沉淀法（1）锌盐法谷氨酸＋锌离子--→谷氨酸锌沉淀--→溶液--→谷氨酸结晶（2）盐酸盐法：Glu在浓盐酸中生成并析出谷氨酸盐酸盐。

这是用盐酸水解面筋生产谷氨酸的原理。

（3）钙盐法：高温谷氨酸钙溶解度大，与菌体等不溶性杂质分开，降温，析出谷氨酸钙沉淀，加NaHCO3 直接得到味精。

3.离子交换法用阳离子交换树脂吸附谷氨酸形成的阳离子，再用热碱（ 60 ℃ 4% NaOH ）洗脱，收集相应流分，加盐酸结晶。

GA+ GA± GA- GA=<2 3.22 7.0 >12pI谷氨酸是酸性氨基酸，含2个羧基1个氨基，与阴离子交换树脂要比与阳离子交换树脂强，但阴离子机械强度差，价格贵，因而用阳离子交换树脂。

理论上讲发酵液上柱的pH值应低于3.22，但实际上控制在5.0 6.0之间，因Na+、NH4+交换能力>谷氨酸，优先交换，置换出H+使pH值低于3.2，使谷氨酸成为阳离子，但不能>6.0。

4.电渗析法膜分离过程，利用的是电位差。

二次电渗析法：pH3.2：除去各种盐类。

pH 3.2:除去蛋白质、残糖和色素等非电解质。

如何得到高产量的谷氨酸在谷氨酸发酵中，如果能够改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断地排到细胞外面，就会大量生成谷氨酸。

研究表明，影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。

因此，对谷氨酸产生菌的选育，往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手，如生物素缺陷型菌种的选育。

生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA的辅酶。

生物素缺陷型菌种因不能合成生物素，从而抑制了不饱和脂肪酸的合成。

而不饱和脂肪酸是磷脂的组成成分之一。

因此，磷脂的合成量也相应减少，这就会导致细胞膜结构不完整，提高细胞膜对谷氨酸的通透性。

当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。

因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。