细胞免疫组化步骤
免疫组化基本步骤
细胞免疫组化染色步骤1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。
4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。
2. 用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
3．加1%的Triton X-100 30μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。
蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。
5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。
PBS洗三次，每次5分钟。
6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。
PBS洗三次，每次5分钟。
7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。
PBS洗三次，每次5分钟。
8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。
9. 将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。
10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1min11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。
12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。
稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。
淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化)另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。
苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。
盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。
我没用淡氨水溶液。
若为悬浮细胞则需涂片，20µl即可。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理大家好，今天咱们聊聊免疫组化这门技术。
它可是生物医学研究中的一把好手，能让细胞和组织的秘密无所遁形。
咱们先从免疫组化是什么说起。
首先得明白，免疫组化是一种研究方法，它通过给样品加上抗体，让它们跟细胞里的蛋白质或分子“亲密接触”，然后通过染色来观察这些蛋白质或分子的位置和分布。
听起来是不是挺高大上的？不过别急，咱们慢慢来，一步步揭开它的神秘面纱。
1.1 准备工作开始之前，你得确保所有材料都是新鲜的、高质量的，还有那试剂啊，得是实验室里常用的那种。
别忘了准备一个显微镜，这可是观察的关键哦！1.2 固定和包埋接下来就是让细胞和组织固定在一块，这个步骤叫做固定。
把样本放到甲醛溶液或者丙酮里面一泡，就能把它们牢牢地锁住，防止它们移动。
之后呢，把固定好的样本放进树脂里，这样它们就能稳稳当当的了。
这一步是为了保护细胞和组织的结构不被破坏，方便后续的切片和染色工作。
1.3 切片把处理好的样本切成薄片，这就是切片。
切片的时候得小心，别让样本碎掉或者变形。
切片后，还得把那些乱七八糟的东西去掉，比如蜡质啊、气泡啊，这样才能让下面的染色工作顺利进行。
1.4 染色染色可是个技术活。
你得选对染料，颜色要鲜艳，还要能穿透细胞膜，把里面的物质找出来。
染色的方法有很多种，比如直接法、间接法和免疫荧光法等等。
每种方法都有它的特点，就像不同的人有不同的爱好一样。
1.5 观察染色完成后，就可以用显微镜来观察啦！看看细胞和组织里的蛋白质、分子是怎么分布的。
有时候，你还能发现一些有趣的现象，比如某些细胞里藏着很多糖，还有些地方有抗体的“家”。
这些观察结果可是非常宝贵的，能帮助我们更好地理解生物体内的奥秘。
2.1 注意事项做免疫组化实验的时候，可不能马虎哦。
记得要戴好防护眼镜和手套，避免接触到有毒有害物质。
操作时要轻柔，不要破坏样本的结构。
还有啊，处理完样本后得洗手，保持实验室的清洁和卫生。
2.2 常见问题及解决方案有时候会遇到一些问题，比如样本太干或者太湿，这时候可以试试加一点水或者甘油来调整。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种常用的实验诊断技术，它通过检测细胞或组织中的特定蛋白质来帮助诊断疾病。
免疫组化的完整步骤包括抗原制备、抗体制备、预处理、染色和结果分析等几个环节。
下面我将详细介绍每个环节的原理及操作步骤。
首先是抗原制备。
抗原是指能够与特异性抗体结合的物质，常见的抗原有蛋白质、多肽和核酸等。
在免疫组化中，我们需要选择一种合适的抗原，并将其制备成适合免疫反应的浓度和形式。
一般来说，抗原可以采用化学合成法、生物来源法或基因工程技术等方法进行制备。
接下来是抗体制备。
抗体是指能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白，它是免疫组化的核心成分。
在抗体制备过程中，我们需要先确定需要检测的抗原类型和数量，然后选择合适的动物或植物源材料，进行细胞融合或表达纯化等步骤，最终得到高纯度的单克隆抗体。
第三步是预处理。
在进行免疫组化之前，我们需要对样品进行一系列的预处理操作，以去除杂质和干扰物质的影响。
预处理包括样品稀释、缓冲液调整、基质效应消除等步骤。
还需要根据具体的实验设计选择合适的预处理方法和条件。
第四步是染色。
染色是免疫组化的核心步骤之一，它可以将标记有抗体的二抗与待测样本中的抗原结合，形成可视化的斑点分布。
常用的染色方法包括直接荧光法、间接荧光法、免疫印迹法等。
在染色过程中，需要注意染料的选择、浓度和作用时间等因素，以保证染色效果的质量和稳定性。
最后一步是结果分析。
免疫组化的结果分析需要综合考虑多个因素，如阳性对照品的比较、背景值的控制、图像处理和统计分析等。
常用的结果分析方法包括图像分析软件(如ImageJ)和统计分析软件(如SPSS)。
在结果分析过程中，需要注意数据的可靠性和准确性，避免误判和漏判的情况发生。
免疫组化是一项复杂而精细的技术，它需要综合运用多种知识和技能才能完成高质量的实验诊断任务。
希望以上的介绍能对您有所帮助！。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种非常神奇的实验技术，它可以让科学家们观察到细胞内部的微小世界。
那么，这个神奇的过程到底是怎么进行的呢？下面就让我们一起来揭开免疫组化的神秘面纱吧！我们要了解一下什么是免疫组化。
简单来说，免疫组化就是利用特定的抗体去识别和标记细胞表面或者细胞内部的一些蛋白质分子。
这些抗体可以是医生们自己设计的，也可以是从动物或者植物中提取出来的天然抗体。
当这些抗体与目标蛋白结合时，就会发生一些特殊的反应，比如说颜色的变化、荧光的产生等等。
通过观察这些反应，科学家们就可以了解到细胞内部的结构和功能特点。
接下来，我们来看一下免疫组化的完整步骤及各步原理。
首先是样品制备，也就是把待测的细胞样本取出来进行处理。
这个过程非常重要，因为只有处理好的样品才能够被抗体识别和标记。
接着就是抗体制备，也就是把医生们设计好的抗体合成出来。
这个过程需要一定的技术和经验，因为不同的抗体可能适用于不同的细胞类型和目标蛋白。
然后就是抗原检测，也就是把制备好的抗体加入到样品中，看看它们是否能够与目标蛋白结合。
如果结合了，就会发生一些特殊反应，比如说颜色的变化、荧光的产生等等。
最后就是结果分析，也就是根据观察到的反应来推断出细胞内部的结构和功能特点。
虽然免疫组化看起来很复杂，但是只要掌握了其中的原理和技巧，就可以轻松地完成实验了。
当然啦，在实际操作过程中也会遇到各种各样的问题和挑战，比如说抗体的选择、样品的质量等等。
但是只要我们保持耐心和信心，相信总会找到解决问题的方法的。
免疫组化是一项非常重要的技术，它可以帮助我们更好地了解细胞内部的结构和功能特点。
虽然它看起来有些复杂难懂，但是只要我们认真学习和实践，相信一定可以掌握其中的精髓并取得优异的成绩！。
免疫组化的操作流程
免疫组化的操作流程免疫组化是一种常用的分子生物学技术，用于检测细胞和组织中特定分子的存在和表达水平。
它可以帮助科学家深入了解细胞和组织的功能和病理改变，是研究和诊断疾病的重要工具之一、以下是免疫组化的操作流程简介：1.样本制备：根据实验目的，选择合适的样本，可以是细胞培养物、冻存组织切片或石蜡包埋的组织切片。
对于细胞培养物，通常直接进行固定处理，而对于组织切片，则需要进行脱水、清洁等预处理。
2.细胞固定：将细胞或组织切片进行固定处理。
常用的固定剂包括甲醛、醋酸乙酯和乙醇等。
固定过程中需要注意不同抗原固定条件的优化，以保持抗原的完整性和免疫反应的灵敏性。
3.抗原恢复：某些抗原在固定过程中可能会丧失其免疫原性，需要进行抗原恢复处理。
常用的恢复方法包括加热诱导抗原修复（如煮沸、蒸汽加热或微波辅助加热）和酶解法等。
4.阻断非特异性结合：在进行免疫组化反应之前需要对样本进行非特异性结合的阻断处理，以减少背景信号。
常用的阻断剂包括牛血清白蛋白（BSA）、鱼胶和奶粉等。
5.标记抗体：选择合适的一种一抗和二抗，一抗通常是用于识别目标抗原的物质，可以是单克隆抗体或多克隆抗体；二抗是特异性地识别一抗，并携带标记物，如荧光素或酶。
6.免疫反应：将样本与一抗和二抗进行免疫反应。
通常，一抗在特定的条件下与目标抗原结合，然后二抗与一抗结合。
标记物将被聚集在含有目标抗原的区域，形成可视化的免疫复合物。
7.信号增强：为了增强免疫反应的信号，可以使用信号增强剂，如生物素-亲和素体系和酶联免疫吸附法（ELISA）等。
这些方法可以增加检测的灵敏性和特异性。
8.示性显示：为了观察并记录实验结果，可以使用荧光显微镜、电子显微镜或者染色反应等方法来可视化免疫反应。
9.数据分析和解释：根据实验结果进行数据分析和解释。
通过比较免疫反应的强度和位置，可以确定目标抗原的存在和表达水平。
总结起来，免疫组化的操作流程包括样本制备、固定处理、抗原恢复、非特异性结合阻断、标记抗体、免疫反应、信号增强、示性显示以及数据分析和解释等步骤。
免疫组化相关步骤
免疫组化相关步骤免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种基于抗原抗体反应的方法，用于检测组织或细胞中其中一种特定蛋白质的表达。
下面将详细介绍免疫组化的相关步骤。
免疫组化的步骤包括样品制备、抗原修复、阻断、一抗反应、二抗反应和染色，具体如下：1.样品制备：首先，需要获取组织标本。
通过活体组织切片、细胞涂片或冷冻切片等方法制备标本。
制备好的标本需要保持完整和有代表性，通常要求切片不超过5μm厚。
2.抗原修复：组织切片在固定过程中会损害抗原的完整性，因此需要进行抗原修复，以恢复抗原的表达。
常用的抗原修复方法包括热解修复（如加热、压力煮等）和酶解修复（如胰蛋白酶消化等）。
3.阻断：组织切片会与非特异抗体结合，影响免疫反应的特异性，因此需要进行阻断。
常用的阻断方法包括用牛血清白蛋白（BSA）或奶粉进行阻断，以防止非特异性背景信号的产生。
4.一抗反应：将含有特异性抗体的试剂加到组织切片上，使其与目标抗原结合。
特异性抗体可针对不同的抗原进行选择，如研究一些蛋白质的表达，可以选择该蛋白的特异性抗体。
5.二抗反应：一抗与抗原结合后，需要加入与该一抗来自不同物种的二抗。
二抗通常是免疫出来的，其与一抗结合后，可形成复合物，具有荧光或酶标记。
6.染色：最后，通过染色方法来显示抗原的表达。
染色可以是荧光染色或酶标染色。
荧光染色利用特定颜料对特异性标记的抗体进行荧光标记，并在荧光显微镜下观察。
酶标染色则使用酶标记的二抗，再加入相应的底物进行染色。
除了以上的基本步骤1.控制组：为了验证实验是否准确，通常需要设置阴性和阳性对照组。
阴性对照组通常是替代一抗的种属、浓度和机制抗体；阳性对照组是已知具有目标蛋白表达的组织切片。
2.负载密度和反应时间：一抗的负载密度和反应时间需要优化，以确保对目标蛋白的增强标识，同时最大限度地减少背景信号。
3.显微镜观察和图像分析：观察染色结果时，要选择合适的显微镜，以获得清晰的图像。
免疫组化流程
免疫组化流程
免疫组化是一种生物技术，用于研究一个或多个蛋白质的交互性及它的细胞上的定位，从而探究蛋白质在复杂的细胞环境中的功能及其作用机制。
免疫组化是以抗体作为特异性
捕获识别分子的标记物，以检测某一特定的蛋白质在细胞中的形态分布，其主要分为三个
步骤：样本处理、抗体淬取和检测荧光。
1. 样本处理：由于免疫组化需要在细胞环境下完成实验，所以在处理样品前，先要
将细胞或组织悬浮，再利用活细胞分离技术将其分离出来，以制备出水平固定、正常形态
的细胞阵列。
2.抗体淬取：抗体淬取是查找蛋白质在细胞中的分布的主要步骤，将具有指示特定蛋
白质的特定抗体喷射在分离的细胞上是大多数实验的基本过程，抗体可以通过多种不同的
方法混合到细胞上，例如管接收、块接收和碰撞接收。
3.检测荧光：检测荧光是一种利用荧光探针标记抗体和膜蛋白，在荧光显微镜上观察
膜蛋白的分布情况，字膜上的膜蛋白和脱离细胞膜的膜蛋白也可以由不同颜色的荧光探针
标记，从而确定膜蛋白的分布情况。
以上三个步骤合在一起，就能完成免疫组化实验，从而检测蛋白质在细胞中的空间分布，免疫组化还可以用来分析蛋白质如何在细胞周围的其他分子之间相互作用。
这个实验
技术具有高灵敏度、可重复性强和节省时间等优点，可以大大提高细胞内目标蛋白质的分
析能力，同时为细胞医学研究和更深入地研究细胞功能提供重要的实验证据。
细胞免疫组化实验步骤
细胞免疫组化实验步骤细胞免疫组化实验步骤：1）脱蜡与水化：将石蜡切片放置于60°烤箱烤片30-60min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固地贴在玻片上。
而后依次将其放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各2min，水洗5min（不要直接对着切片冲洗）。
PBS洗3次，3 min/次。
2）细胞通透与封闭：用预热的封闭通透液（40ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸润切片30min（RT 避光），降低内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗3次，3 min/次。
3）抗原修复：由于制作石蜡切片时，甲醛固定使得蛋白之间交联及醛基的封闭作用从而失去抗原性，这一步就是让胞内的抗原决定簇重新“满血复活”。
这里常用微波修复，pH 6.0的0.01M柠檬酸钠缓冲液浸泡切片，在微波炉里高火4min至沸腾后，取出自然冷却至室温，重复2次，每次补足液体以免干片。
（当然有的朋友用酶修复法也是可以的）。
PBS洗3次，3 min/次。
4）血清封闭：用与二抗同一来源的血清封闭一些非特异性结合位点。
此时可用“祖传”的油性笔围绕组织画圈，并对圈内的组织滴加稀释好的血清，37℃温箱中30min,用滤纸吸去多余的血清。
5）孵育一抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的一抗20ul，4℃过夜或者37℃1-2h。
PBS洗3次，3 min/次。
（一般4℃过夜后，需要将切片放置37℃复温45min，防止脱片以及可使抗原抗体结合的更稳定）6）孵育二抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的二抗20ul，37℃1-2h，PBS洗3次，3 min/次。
7）切片显色：用DAB-H2O2显色10min，显色液最好是现用现配，此时要通过显微镜观察染色是否明显，10min内即可用蒸馏水终止显色。
8）复染及封片：为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可用Mayer苏木素染色30s，水洗，盐酸酒精分化2s，流水浸入15min。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
（2010-06-19 21:40:50）
细胞免疫组化（SABC法）步步看：
细胞冻存够了，且状态良好！咋们就开始做细胞免疫组化吧！开始做实验了，先看要准备些什么吧！
实验准备：
实验用品：
移液枪：1ml 、200ul 、10ul
枪头：1ml 、200ul 、10ul
枪头盒：1ml 、200ul 、10ul
EP 管：
湿盒
需要灭菌的东西：培养皿（可以是重复用的）、细胞爬片（多聚赖氨酸处理，并经过环氧乙
烷消毒）、常规细胞培养物品。
试剂：
细胞消化液、完全培养基、4彩聚赖氨酸、0.01M PBS（）、3%H2O（现配）、％Txiton X-100、浓缩型SABC式剂盒（血清封闭液、二抗、三抗《SABC ）、苏木素、ddH2O DAB显色试剂盒
操作步骤：
一、细胞爬片的制作
1、细胞用消化液消化后，用完全培养基重悬（4-5ml ）或者密度为1-5x106/ml
2、在灭菌的培养皿中铺上3 块细胞爬片（圆片），圆片间不要重叠
3、取细胞悬液分别滴到圆片上，注意不要滴到圆片外，让细胞贴片30min 左右
4、30min 后，在培养皿中补加完全培养液（轻微的加入，以免冲力将贴壁的细胞打下来），放于37° C, 5%CO培养箱中培养3h左右（让其贴壁更牢）。
二、组化前处理
1、取岀培养皿，用PBS漂洗2x2min （PBS可以不灭菌）
2、4%多聚甲醛处理（室温）20min；
3、PBS漂洗，3x2min ；
4、%Txiton X-100 处理（室温）20min；
5、PBS漂洗，3x2min ；
6、3%H2O处理（室温）15min ；
7、PBS漂洗，3x2min ；
三、组化
1 、血清封闭：试剂盒中的血清封闭液，37° C，20min；
2、取岀甩干封闭液（不漂洗）；一抗（1: 200）（PBS稀释），阴性对照用PBS弋替一抗，37° C1-2h 或4°C过夜；
3、PBS漂洗，3x2min ；
4 、二抗孵育：试剂盒中的生物素化...37 ° C，20min；
5、PBS漂洗，3x2min ；
6、SABC孵育：湿盒内37° C, 20min；
7、PBS漂洗，3x4min ；
8、DAB显色：DAB式剂盒中的A B、C三种试剂，我是按照500ul蒸馏水中各加4ul，混匀。
在镜下观察显色情况，在没有背景色的条件下可继续显色。
一般在2-10min
9、自来水冲洗；
10、苏木素复染，15-30s；
11、自来水冲洗；
12、封片剂封片（有细胞一面对着载玻片），镜下观察
若要长期保存片子，可以对爬片进行脱水处理：
70%（ 1 次，1min）-80%（ 1 次，1min）-95%（ 1 次，1min）-无水乙醇（2x3min）-二甲苯
（2x1min），观察是否彻底脱水，看观察片子放入二甲苯时，容器周围有白色雾状产生，若有则说明脱水不彻底。
可重新进行！得到结果：实验组中，细胞浆为棕黄色，细胞和为蓝紫色；阴性细胞中，只有核被染为蓝色，胞浆无色！在此抱歉不能将图片上传，还得用来发文章之用！
在爬片时，圆片不好用镊子夹起，可在圆片之下垫上封口膜，这样操作起来即省事省时，又节约试剂的用量和提高试剂的有效性。