HLA配型
HLA分型及抗体检测的临床应用
第一节HLA简介
一、主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex, MHC）
1956年Snell等将控制同种组织或肿瘤移植中急性排斥反应的基因称为主要组织相容性基因，其编码基因的产物包括MHC-I类和MHC-II类抗原。
在生命的进化过程中，机体内各个细胞必须共存与合作，同时又要防止被同一物种的其它个体吞并。MHC的限制作用可看作为同一个体细胞之间自我识别的暗号。没有自我识别，每个细胞和每种组织会被隔离而无法维系生命。
在诱发免疫应答过程中，无论是T细胞和B细胞、T细胞和巨噬细胞、还是T细胞之间的相互作用，或是T细胞对靶细胞的攻击，都涉及细胞间的识别。即T细胞对细胞表面抗原的反应时，不仅是对抗原识别，而且也必须识别细胞上的MHC分子。否则，反应就不会产生，这便是MHC的限制作用。其本质是：T细胞识别抗原要有两种识别，一种是TcR与MHC沟槽中的特异性多肽结合，而此多肽的基序只能与某一型号MHC分子结合，不是与所有MHC分子结合；另一种是TcR识别抗原槽两侧的同种异型部位的α螺旋结构。由此限制了TcR只能识别自身MHC分子递呈的抗原。
同种异体组织移植时，若供受体移植抗原不同，尤其是主要组织相容性抗原不匹配，将会诱发受体产生明显的移植排斥反应。虽然MHCⅠ类和Ⅱ类分子均是主要移植抗原，但这两类抗原在移植中所起的作用是不相同的。体外实验表明，供受体Ⅱ类分子不同时，供体Ⅱ类抗原能直接刺激受体CD4+T细胞增殖和淋巴因子分泌，即MLR。这一反应是免疫应答的中心，因为B细胞抗体的生成及CD8+T细胞发育和分化，都有赖于CD4+T细胞的活化以及淋巴因子的分泌。而Ⅰ类分子不同以及次要组织相容性抗原不同，就会诱发CD8+T细胞增殖和分化成熟，导致移植物的破坏。
总之，MHC Ⅱ类抗原错配启动了免疫应答，而Ⅰ类抗原错配是导致免疫效应阶段被攻击的靶子。因此，临床上器官
和骨髓移植时，要首先选择与受体HLAⅡ类匹配的供体，其次选择Ⅰ类抗原相配的供体，Ⅱ类抗原的匹配比Ⅰ类抗原的匹配更为重要。
表1 MHC的一些性质
───────────────────────────
性质Ⅰ类抗原Ⅱ类抗原
────────────────────────────
同种移植物排斥作用的大小＋＋＋＋＋＋
诱发产生体液抗体＋＋＋＋＋＋＋＋
MLR的刺激作用＋＋＋＋＋
GVHD ＋＋＋＋＋＋
CML的靶细胞＋＋＋＋＋
Ir基因功能＋＋＋＋＋
靶细胞溶解的限制作用＋＋＋＋＋
抗原递呈的限制作用＋＋＋＋＋
组织中的分布所有体细胞 B细胞、巨噬细胞等
小鼠H-2基因 K,D,L Ir
人类HLA基因 A,B,C DR,DP,DQ
化学结构重链45kDL(MHC)编码α链35kDL(MHC)编码
轻链12kDL(非MHC)编码β链28kDL(MHC)编码
物种间的交叉反应常见少见
注：MLR为混合淋巴细胞反应；GVHD为移植物抗宿主反应；CML为细胞介导的淋巴细胞溶解；Ir为免疫反应。
二、人类白细胞抗原( human leukocyte antigen，HLA)
HLA是由 Dausset在1958年首先发现。HLA抗原是人类主要组织相容性复合物抗原。它们与同种异体移植中的排斥反应有密切关系。HLA是由 HLA基因复合体所编码的产物，HLA复合体是人类中最复杂的基因复合体，其遗传主要特点是共显性复等位基因遗传，是调节人体免疫反应和异体移植排斥作用的一组基因，位于第六号染色体的短臂上。每个座位上的 HLA基因均可编码一种特异性抗原，主要表达在细胞膜上，或以游离状态存在于血液和体液中。
HLA抗原可根据不同基因位点的产物和它们的功能加以分类。目前研究较充分的有HLA-A，B，C，D，DR，DQ和DP七个位点。每个位点上均有很多等位基因，为共显性复等位基因。目前已确定 HLA复合体共有1028种等位基因。其中，HLA-A、B、C座位上的基因编码的抗原成分称为 I类抗原。 I类抗原是一种膜糖蛋白，存在于所有有核细胞的膜上，以淋巴细胞上的密度最大。 II类抗原是由 HLA-D、DR、DQ、DP座位基因所编码的抗原。它是由两条糖基化的跨膜多肽链构成，分别称为α链和β链，其抗原特异性主要与β链有关；主要表达在 B细胞、巨噬细胞和其他抗原递呈细胞上。
第一类抗原： HLA-A，HLA-B，HLA-C
第二类抗原： HLA-D，HLA-DR，HLA-DQ，HLA-DP
第三类抗原： C4A，C4B，C2，Bf等补体成分
通过遗传，人每套染色体有两条，一条来自父亲，一条来自母亲。每个位点含有两个等位基因，一个来自父亲，一个来自母亲。两个等位基因是相互独立的，既一个基因不能抑制另一个基因的表达。某一个体，如果一个位点的两个基因是不同的，称为杂合子基因；如同一位
点具有同样的等位基因，称为纯合子基因。HLA位点具有众多的等位基因，造成HLA的极端多态性。
第二节HLA分型的临床应用
HLA分型技术常应用于器官移植和骨髓移植时供者和受者组织相容性的配型，以及HLA与某些疾病关联性、成分输血时HLA抗体所致的输血副作用等的研究； HLA分型技术也成为亲子鉴定和犯罪法医学鉴定，以及遗传学方面研究人类进化的重要手段。
一、HLA与疾病相关
1、研究HLA与疾病相关的意义
(1) 疾病的诊断或辅助诊断
(2) 研究疾病的遗传因素
(3) 疾病分型
(4) 有助于对疾病的预测、预防及预后的判断
2、HLA特异性与许多临床疾病相关。据不完全统计，迄今已研究了500余种疾病与HLA相关联，已经肯定有50多种疾病与HLA有密切相关。如：具有HLA-A1，B8单倍型者，感染HIV病毒后可迅速发展为爱滋病。此外，HLA-DR2与嗜眠症，HLA-B8，DR3与重症肌无力，HLA-DR2，DR7与多发性硬化症，HLA-B8与疱疹皮肤病，HLA-DR3，DR9与胰岛素依赖性糖尿病等，均得到证实。
(1)HLA与自身免疫病：I型糖尿病(IDDM)、多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、重症肌无力(MG)等。
自身抗原及其优势表位、表位特异性T细胞的分离及其功能特征、多肽表位对等位基因的结合亲和力、等位基因对多肽的相对递呈水平、TCR对肽-HLA复合物的亲和力大小。
HLA与疾病易感性的机制学说：分子模拟学说；受体学说；自身抗原提呈学说；连锁不平衡学说；免疫耐受学说。
2、HLA与病毒感染：一些由病毒编码的免疫调节因子可通过直接或间接干扰HLA分子给T细胞递呈抗原肽而使病毒逃避机体的免疫反应。
3、HLA的保护作用：对疾病特异性T细胞的克隆去除或无能化；依赖于抗体分子对疾病特异性抗原表位的俘获；HLA II类分子介导的对有保护作用的一些T细胞的正选择。
HLA-B27与强直性脊柱炎（AS）
HLA-B27抗原为一类抗原，存在于所有的有核细胞和血小板，能刺激产生同种抗体并控制细胞毒T效应细胞的特异性。
1973年Terasaki等率先报道了HLA-B27抗原与强直性脊柱炎
(ankylosing spondylitis，AS)的关联。在AS患者中，80%~96%的患者具有HLA-B27抗原，而正常对照组人群中具有B27抗原者仅为4%~8%。随后，许多国家的研究者证实了HLA-B27与AS的强关联关系。从此，引发了世界范围内对HLA抗原与相关疾病的广泛研究。
90-95%的强直性脊柱炎(AS)患者具有B27抗原。
60-80%的反应性关节炎(ReA)患者具有B27抗原。
HLA-B27基因频率与种族有关，中国人为3.4%。
流行病学调查示，中国人群AS的发病率为0.26%。
?具有B27 抗原者其患AS的概率为7.6%，而非B27抗原者患AS的概率为万分之1.3。
?传统上AS诊断主要靠晚期X光片，大部分患者脊柱已发生变形。
?过去的20年中，大量不典型AS和ReA通过B27检测而证实。
利用B27与AS和ReA的强关联，可早期诊断，降低致残率。
HLA-B27检测对儿童不同性质关节炎的鉴别诊断十分重要。
HLA-B27检测可使临床医生和患者警惕AS和ReA的并发症。
AS和ReA发病机理的研究，为临床提供了早期治疗的机会。
二、HLA与人类学的研究
人类历史上的迁移造成HLA抗原分布在不同种族或同一种族不同人群中明显不同，而不同人群中HLA抗原频率的分布又为人类学的研究提供了条件，既HLA抗原频率的分布可反映人群的迁移史。如南美印第安人无HLA-B27抗原，而北美印第安人和北美爱斯基摩人却有很高的HLA-B27抗原频率。由此推断，北美印第安人是由亚洲不同地区人群经过多代移居北美所组成。又如：欧洲白种人也不是同源人群。北欧人HLA-DR5的频率为5%，而南欧人HLA-DR5却为15%。不同人群HLA抗原频率有明显差异，如东方人HLA-A位点，A24占50%以上，而黑人A24的抗原频率不到10%。东方人B46、B54频率很高，而白种人与黑人几乎没有，故又称东方抗原。
三、HLA与亲子鉴定
HLA系统具有高度多态性，在无关个体间HLA表现型全相同的概率极低，故HLA复合体被看作是伴随个体终生的特异性遗传标记。如果只考虑HLA-A位点上23个抗原，HLA-B位点上53个抗原和HLA-DR 位点上18个抗原，按相关公式计算
（[24+（24-1）（24-2）/2][54+（54-1）（54-2）/2][19+（19-1）（19-2）/2]），将有三千万种表现型。因此，在亲子鉴定和法医学中的作用远远大于血型基因鉴定。
四、HLA抗体与输血
溶血性输血反应主要由红细胞抗原不合引起，在一些溶血性反应，如发热、寻麻疹中，部分由红细胞抗体引起。慢性血小板减少症患者，输入随机供体的血小板往往会发生“无反应”现象。如果使此种病人接受HLA相容性的血小板，就会延缓和阻止“无反应”的发生。
五、HLA与器官移植
许多器官功能衰竭的患者，器官移植是唯一的解救途径。HLA抗原与同种异体器官移植的排斥反应密切相关，故又被称为移植抗原。HLA组织配型在60年代开始临床应用后，器官移植的存活率和器官移植的数目均明显增高。但仍不能满足临床的需要。许多患者因得不到器官而死亡。
HLA与器官移植的关系，可以说是一个互相认识、互相促进和互相发展的过
本世纪初，由于血管吻合技术的进步，开启了外科医生对器官移植的兴趣。从1905年法国医生Carrel突破血管吻合技术瓶颈，展开了各种器官移植的实验研究；从50年代初期的人体器官移植失败经验，正式提出了移植失败的原因是免疫反应所致。1954年美国哈佛大学Merril为首的移植小组首次成功地完成同卵双生子之间的肾脏移植，证实了组织相容性的重要性。同时，也极大地促进和推动了HLA的基础研究和组织配型技术的发展。从60年代到80年代初期的20多年里，HLA与器官移植的关系受到广泛重视。随着对HLA研究的不断深入，发现它是目前所知的最高度多态性遗传系统，在无关个体中寻找完全相同的HLA供者的比例很低。80年代初期强力免疫抑制剂环孢素A(CsA)的问世与临床应用，极大地改善了器官移植的短期存活。如肾移植的1年存活率提高了20%以上。这些均使HLA配型的临床价值受到质疑。在90年代初期逐渐形成了在无关供体实质性器官移植中进行HLA配型支持和反对截然相反的两种观点。
近1-2年来，随着大量器官移植临床随访资料的逐渐积累分析，HLA配型在活体亲属移植中的重要意义为大家所公认。但在非亲属移植、尸体移植中HLA配型的临床价值存在不少争议。于是有关HLA配型在器官移植中的临床意义的争论已逐渐统一认识：
1．HLA配型在器官移植中是必要的 HLA的相容性程度仍然是CsA时代影响移植物长期存活的主要因素之一。同时，其他因素的影响也是不容忽视的。
2．肾移植Ⅰ类抗原主要影响长期存活，尤以HLA-B抗原重要。Ⅱ类抗原对长期存活和短期存活均有影响，但以1~3年存活率的影响最明显。总体上分析，尸肾移植中HLA-DR抗原最为重要。
3．骨髓移植 HLA分型的精细程度要求更高。除HLA-A、B、DR抗原外，HLA-C抗原、HLA-DP抗原的影响也是不容忽视的。
4．其他实质性器官移植包括心脏移植、肝脏移植、胰腺移植等，现已逐渐考虑和重视HLA相配的临床价值。但首先考虑的是ABO血型的相容性。
六、HLA相容对肾脏移植的影响
由于影响肾移植的因素很多，小样本数据分析容易出现混杂便异（Bias）。为此，美国器官联网组织（UNOS）委托洛杉矶加州大学（UCLA）组织配型中心，每年将美国数百个移植中心的数据，进行大样本数据的分层处理，分析影响肾移植的因素。
综合目前的临床研究结果，HLA相容性程度无论对首次移植还是再次移植、活体移植还是尸体移植、成人移植还是儿童移植，均具有不同程度的影响。这些影响是多方面的，主要包括对早期肾功能的影响、对排斥反应和激素冲击治疗的影响、对移植物存活率的影响、对致敏受者和高危组受者的影响等。
(一) HLA相容对早期肾功能的影响
研究结果证实，移植肾缺血灌注损伤可以引起HLA抗原表达的增强，从而增加移植器官的免疫反应。同时，HLA
的错配也可诱发受者体内抗移植物的免疫反应，导致移植物早期功能的损害。HLA错配对肾脏移植早期功能的影响主要包括移植物功能延迟恢复(DGF)，术后第1天无尿和术后需要继续透析治疗等三方面。
(二) HLA相容对排斥反应和激素冲击治疗的影响
移植物排斥反应的本质是一种免疫反应，其根本原因是移植物中含有受者体内所缺如的移植抗原。从移植免疫学角度选择理想供体和合理应用强有力的免疫抑制剂是目前控制排斥反应的主要措施。良好
的HLA相容对于减少移植物排斥反应和激素冲击次数，从而减少慢性排斥反应，提高移植物存活率。
(三) HLA相容对移植物存活率的影响
移植物有功能的长期存活是器官移植科学研究与临床工作的最终目标，也是衡量器官移植整体水平的最佳标准。目前，提高移植物长期存活的研究主要集中在三个方面：
第一，免疫耐受的研究。尚缺乏在成熟的高等级动物上诱导成功免疫耐受的可靠实验模型。要过渡到人类器官移植临床的应用还有一段漫长的距离。
第二，免疫抑制剂的研制、开发和合理应用。如何合理的联合应用这些新的免疫抑制剂，根据个体特性调整以达到最佳个体化用药，是影响移植物存活的重要因素之一。
第三，移植供受者HLA相容性选择。近10万例尸肾移植的临床回顾性分析显示，CsA时代的尸肾移植，HLA相容性仍然是影响移植物长期存活的最主要因素之一。HLA-A、B、DR六抗原无错配受者，半寿期高达15.5年，而错配者仅有6-8年；两者比较，1年肾存活提高12%、3年肾存活提高19%、10年肾存活提高33%。
因此，就目前器官移植的现状而言，提高移植物长期存活真正具有实际临床价值的措施主要是免疫抑制剂的合理应用和选择HLA相容的供体。
(四) 再次移植和高危组病人HLA相容对移植物存活的影响更为重要
由于种族间遗传学的差异, 黑人受者选择合适的HLA供体较为困难，错配率显著高于白人受者,因此, 临床上将黑人受者和接受高危供肾的病人统称高危病人, 和再次移植的病人一样, 是临床上并发症较多, 存活率较低的患者。如何提高这部分移植病人的GS, 除采取综合性措施外, 寻找理想的HLA相容的供体无疑是至关重要的。
第三节 HLA的分型技术
HLA研究的发展和广泛应用，得益于国际间的协作，通过国际间的协作建立了HLA分型的标准化，使方法学得到统一。HLA分型方法包括血清学分型、细胞学分型和基因分型。血清学和细胞学分型技术主要侧重于分析HLA抗原的特异性，基因分型方法则侧重于分析基因本身的多态性。细胞学分型技术由于分型标准细胞来源困难，且方法繁琐，不适于常规检测使用，正渐被淘汰。
六十年代初期，HLA的血清学研究拉开序幕。在Snell和Dansset等创建免疫遗传学组织相容性抗原系统，解决了识别HLA抗原的抗血清来源的基础上，1963年Rood 和Lecuwen采用计算机方法
分析抗血清中复杂的抗体成份，提出了等位基因的概念。1964年Terasaki发明了HLA微量淋巴细胞毒实验方法（Microlymphocytotoxicity test）及相应的组织配型板，并于1970年被美国国立卫生研究院（NIH）确定为国际通用标准技术。HLA的血清学研究得到了迅速发展。同时，通过交流标准细胞株和交换标准抗血清，使之进入国际大协作阶段。血清学方法成为免疫遗传学和组织相容性研究的基本方法与手段。
进入八十年代后期，分子生物学技术的迅速发展与成熟，尤其是1985年美国Cetus公司发明了具有划时代意义的体外基因扩增技术—聚合酶链反应技术(Polymerase Chain Reaction, PCR)，为分子生物学技术应用于HLA研究领域提供了有效的方法和捷径。至80年代末、90年代初期，HLA的研究进入了DNA分型研究阶段。1990年世界卫生组织（WHO）统一了HLA基因分型的命名以及与血清学分型的对应关系，并公布HLA核苷酸序列，为规范HLA分子生物学研究提供了科学的依据。1991年第11届国际组织相容性专题研讨会，对HLA 血清学研究进行了总结。至此，经过近30年的国际合作研究，HLA 血清学研究大体告一段落，全面转入DNA分型研究。
一、 HLA血清学分型方法
（一）淋巴细胞分离
淋巴细胞分离的方法很多，主要有直接沉淀法、密度梯度分离法、细胞分离器法和免疫磁珠法等。现国内大多数实验室多采用密度梯度法，而有条件的实验室已采用免疫磁珠法分离淋巴细胞。
免疫磁珠法分离T、B淋巴细胞[原理] FluoroBeads?是一种可荧光染色的免疫磁珠，由特异性的单克隆抗体和可磁化的金属颗粒结合而成。磁珠磁化后，受磁力的吸引可被分离。当磁力移开后，磁珠不会带有磁力但可被反复磁化。已和磁珠结合的特异性单克隆抗体和相应的淋巴细胞结合，既可分离淋巴细胞。
（二）微量淋巴细胞毒实验
这是一种补体依赖性淋巴细胞毒实验。该方法目前仅用一微升抗体、一微升细胞、一微升补体，孵育一小时。即抗原+抗体+补体结合。故称快速微量淋巴细胞毒实验方法。
[原理] 淋巴细胞具有HLA抗原，在补体存在的情况下，HLA细胞毒抗体(IgG,IgM)能够结合到带有相应抗原的活淋巴细胞膜上，并在膜上打洞致淋巴细胞死亡。如淋巴细胞不带有相应的抗原，则无此作用。死细胞可用数种方法观察到，最简单的方法是染色法。染色液可通过死细胞膜进入细胞内，以便细胞着色。目前常用的染料为荧光液和曙
红(CFDA和EB)。在荧光显微镜下，活细胞呈绿色(CFDA与细胞膜结合)，死细胞呈红色(EB可通过被破坏的细胞膜进入细胞与DNA结合)；在相差显微镜下，活细胞因不被着色而明亮，死细胞由于曙红进入细胞而色暗无光。估计死细胞占全部细胞的百分比，可以反映出抗原与抗体反应的强度。目前，国际通用的判断方法为NIH计分法。
在T和B淋巴细胞上都存在HLA-A，B，C抗原，因此检测这些抗原一般可直接用淋巴细胞。但是某些HLA-A，B，C分型血清中同时存在DR抗体，所以，为了避免DR抗体可能造成的干扰，通常用T淋巴细胞做ABC分型。近几年，HLA单克隆抗体的出现，可避免DR抗体的影响，而可用总淋巴细胞检测HLA-A，B，C分型。HLA-DR，DQ抗原存在于B淋巴细胞上。所以，测定HLA-DR，DQ抗原时，需从总淋巴细胞中分离出B淋巴细胞进行测定。
（三）HLA抗原血清学分型现状
血清学分型技术创立30多年，在研究HLA的多态性及其功能意义，器官移植组织配型，尤其是筛选异基因骨髓移植无关供体，建立“骨髓库”等方面发挥了主要作用。同时，血清学分型技术本身也得到了迅速发展：
1．分型技术微量化一微升抗体，一微升细胞，一微升补体，成为国际通用的标准技术。
2．交流标准细胞株和交换标准抗血清的国际大协作，基本上满足了不同地区、不同种族的人群HLA分型的要求。HLA领域的国际大协作是迄今为止各类技术合作中最有效、最成功的典范。
3．分型技术与方法得到了进一步完善。如：
1）1994年美国加州大学组织配型中心建立了单克隆抗体技术用于标准抗血清的筛选，大大提高了标准抗体的特异性，简化了
抗血清筛选的程序。同时，采用单克隆抗体干板代替血清板，
更利于运输和保存。
2）同期建立的免疫磁珠淋巴细胞分离技术，使T淋巴细胞和B淋巴细胞的分离简捷、快速，特异性更强。
3）快速荧光染色技术的发展，使计算机读板成为可能。
4．自动化程序提高目前从加样到读板均已实行自动化操作，大大提高了工作效率，使大批量样本的HLA分型成为可能。如UCLA配型中心周处理样本量可达到数千份到10000份。这是其他HLA分型技术难以做到的。
综上所述，HLA血清学分型技术成熟，操作简捷、快速，标准化和自动化，对HLA-Ⅰ类A、B抗原分型结果基本可靠，仍然是目前HLA 分型，尤其是HLA-Ⅰ类抗原分型技术的主要方法之一。
（四）血清学分型技术的局限性
尽管血清学技术对HLA-Ⅰ类抗原分型结果有较高的准确性，提供了组织配型的基本手段，并有力推动了HLA研究的发展。但血清学方法也存在诸多的限制。
1．随着分子生物学技术的发展，对HLA分子结构与核苷酸序列分析研究的深入，每年都有许多新的等位基因特异性被发现和确定。血清学方法已经无法获得能够分辨出所有特异性的标准抗血清。
2．HLA等位基因序列的高度同源性，使血清学出现较多、较强的交叉反应，影响了分型结果的准确性，并使亚型的进一步确定带来困难。如B40、B48同时存在时，确定B60、B61、B48较为困难，常常只能根据不同人群种族与地域的抗原频率分布高低来判断。存在B62时，B71就难以分辨出来。A19分裂子的判断也常常出现误差。 3．分型血清本身的问题：①Ⅱ类分型血清一般比较弱，容易出现假阴性反应；②相当多的Ⅱ类分型血清是用血小板吸收去除Ⅰ类抗体的方法得到的，可能造成抗体效价的下降，同时残留的Ⅰ类抗体也可以干扰分型结果。
4．HLA-C抗原血清学分型，至今缺乏理想的单特异性的抗血清。 5．血清学方法检测的是淋巴细胞膜表面的HLA表现型。血清学的表型相同，DNA核苷酸序列不一定完全相同。HLA的个体遗传学差异的本质不是在血清学方法所检测的基因产物上，而是在编码基因产物的DNA水平上。
6．淋巴细胞膜抗原的表达受多种因素的影响与干扰。最近的研究显示：膜上的HLA抗原有可能被遮盖或表达能力下降。如HLA-C抗原等位基因序列目前血清学尚不能分辨，淋巴细胞膜表面C抗原表达只有A抗原或B抗原的10%。
7．HLA-Ⅱ类抗原主要在B淋巴细胞表达，血清学分型较Ⅰ类A、B抗原误差率更高。
8．目前用于血清学分型的抗血清或单克隆抗体，主要依据白种人群的HLA背景与频率分布特点而定，中国人的标准抗血清很少。因此，源于白种人群的血清学分型用于非白种人群的检测，本身就存在一定的误差。
9．标准抗血清或单克隆抗体的筛选技术复杂，难度大，试剂来源受到限制。
10．血清学需要活的淋巴细胞，对于特定条件下的尸体移植，样本的来源受到一定的限制。
综合DNA分型与血清学分型结果，结合我国器官移植的实际情况，建议：
1）HLA-I类A、B抗原分型仍以血清学方法为主，尤其是大样本量的检测，如建立“骨髓库”，更适用于血清学分型作为初步筛选。对于血清学分型困难、空白或交叉反应明显，影响亚型确定者，有必要采用DNA分型作进一步确认。
2）HLA-II类抗原尤其是DR抗原分型，推荐采用DNA分型技术取代血清学方法。
二、HLA基因分型方法
HLA基因分型是在编码基因产物的DNA水平上，因此自90年代以来，DNA水平的HLA分型研究，尤其是HLA II类抗原的DNA分型研究，发展十分迅速，并在临床器官移植的组织配型中得到实际应用。 HLA的DNA分型方法很多，各有其特点。目前常用的方法大致可分为五大类。
（一）限制性片段长度多态性分析(Restricted Fragment
Length Polymorphism，RFLP)
RFLP方法的基本原理与技术是根据HLA(主要是II类抗原)的核苷酸序列，在不同部位存在多个不同的酶切位点，利用核酸内切特异性消化和切割这些位点，形成各种大小不等的DNA片段，经电泳分离再转移到硝酸纤维素滤膜(NC膜)上，与cDNA探针杂交，采用放射性自显影技术观察分型结果。
PCR-RFLP技术行HLA分型，大大提高了分型方法的敏感性和精确性，并缩短了检测时间。但复杂的分型方法学和复杂的结果判断程序，限制了PCR-RFLP技术的广泛应用。
（二）聚合酶链反应单链构象多态性分析(PCR With Single Strand Conformation Polymorphism PCR-SSCP)
PCR-SSCP系Drita等1989年首先提出，其方法原理可概括为：在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，单链DNA因碱基序列不同所形成的构象不同，泳动速度也不同。通过PCR扩增包括发生单个碱基臵换部位及两侧DNA片段，变性后进行SSCP分析，可分辨出单个碱基的改变，有效地检出点突变和DNA的多态性。主要步骤包括PCR扩增，产物酶消化切割，热变性为单链DNA，电泳后染色观察结果。主要应用于检测癌基因的突变和HLA多态性。在要求精确配型的异基因骨髓移植中，PCR-SSCP已初步显示出优越性。但在实质性器官移植的临床配型中，如同RELP一样，构象分析的
主要问题也是检测技术与结果的判断程序太复杂，影响了该项技术的实际应用。
（三）聚合酶链反应寡核苷酸探针杂交方法(PCR With Sequence-Specific Oligonucleotide Probe，PCR-SSO)
PCR-SSO方法是目前最常用的DNA分型技术之一。主要技术包括提取模板DNA，以位点间或组间特异性引物进行PCR扩增，其产物转移到NC膜上，再与数十个寡核苷酸特异性探针杂交，从而分辨出等位基因的特异性。 SSO分型除存在杂交污染外，与SSCP一样，并不能对所有等位基因多态性均作出精确的分辨。
（四） DNA序列测定(Sequencing)
采用自动测序仪对HLA分子的核苷酸碱基序列测定是目前HLA分型最直接、最精确、最可靠的方法。常用于对新发现的HLA特异性进行DNA序列分析。但所需设备昂贵，检测时间长，即使采用全自动测序仪，目前每天也只能完成5份样本的HLA-I类、II类分型。
（五）序列特异引物聚合酶链反应技术(PCR With Sequence-Specific Primers，PCR-SSP)
根据HLA 抗原的核苷酸序列，设计出一系列针对各亚型的顺序特异引物，通过PCR扩增各等位基因的型别特异性DNA片段；扩增产物借助常规的琼脂糖凝胶电泳，即可根据是否存在特异性扩增产物的电泳条带直接进行分型。该方法已被大多数HLA实验室所采用。
PCR-SSP技术的显著特点是结果容易判断、根据实际需要调整分辨度水平、分型速度快，特别适用于尸体移植。
（六）应用寡核苷酸芯片技术进行HLA I、II类抗原的分型
HLA I类、II类抗原中的A、B、DR、DQ等位点是器官移植中主要应用的免疫排斥相关的配型位点，以往对I类抗原分型主要是血清学分型，成本高，存在交叉反应；对二类抗原主要是用PCR-SSP方法，一次需进行十几管或几十管PCR反应，操作复杂且易产生假阳性和假阴性，影响结果判断的可靠性。基因芯片由于其本身的技术特点，一次可以在芯片上放上成千上万的不同的基因片段，因此一次可以检测多种突变位点，对于HLA来说，理论上可以实现在一块芯片上同时探测A、B、DR、DQ等所有已知的多态位点，是一种理想的高效的检测配型手段，在方法学上具有不可替代性。
三、HLA交叉反应组(CREG)
目前，临床HLA配型常规检测的HLA抗原有100种左右。在
这100种抗原中，供者与受者HLA抗原相同的机率很低。然而，许多HLA抗原在分子结构上具有相同部分，称为公共抗原决定族。既某些抗原因为分子结构接近，而发生与某一抗体的交叉反应。这些抗原被称为交叉反应组(C ross Reactive Group， CREG)。根据CREG 的不同，可将目前常规检测的100种HLA抗原分为10个CREG。
大量临床数据表明，在同一CREG中，即便供者和受者的抗原不同，其发生移植后免疫排斥的机率明显低于非同一CREG中的HLA抗原错配。而器官移植存活率也明显高于随机HLA抗原错配的患者。因此，有人称此为可接受错配。例如，供者的HLA-A位点的抗原为A3，受者
HLA-A位点的抗原为A11。由于A3和A11均属于CREG分类中的A01C，所以供者对受者无异体的CREG。其移植存活率虽不如A3与A3，或A11与A11的配型关系，但可明显高于非同一CREG的错配。
第四节抗HLA抗体筛选在器官移植中的意义移植物体内含有高水平循环抗HLA抗体称之致敏。PRA为Panel ReactiveAntibody的缩写，为一组特定HLA反应抗体。根据抗体水平的高低，可分为未致敏(PRA 0~10%)、轻度致敏(PRA >10~50%)、中度致敏(PRA >50~80%)和高度致敏(PRA >80%)。
实质性器官移植受者的致敏性早在70年代初期(1971年)就受到移植临床的广泛关注。早期的研究显示：致敏抗体与肾移植超急性排斥反应(HR)有关。随后的研究显示，致敏抗体还与移植物功能延迟、急性排斥反应和移植物存活降低有关。美国UNOS (国家器官分配网络委员会) 对57,303例肾移植的分析表明: 影响肾移植存活率的前五个因素为:
1.移植中心；
2. 供者死亡原因；
3. HLA配型(HLA抗原检测)
4.
PRA百分比(HLA抗体检测)；5. 供者年龄
根据中国的国情, 移植中心, HLA配型（检测HLA抗原）和PRA 百分比（检测HLA抗体）是影响中国肾移植存活率的主要因素。
目前, HLA配型工作在中国的大中型肾移植中心已经列为常规检测项目。HLA抗体的检测也于1998年开始在大的器官移植中心开展, 尤其是一部分二次以上的器官移植患者、反复输血患者和有过妊娠史的女患者，PRA检测能帮助临床医生系统地了解其体内的抗体水平并及时有效的选择器官和决定移植时机。对于降低术后超急排斥和急性排斥的发生提高器官移植的存活率具有重要意义。
一、致敏因素分析
目前的研究结果显示，致敏的主要原因可归纳为术前输血、妊娠
史和移植史三大类。
80年代的肾脏移植，术前输血几乎是每例肾脏移植的常规准备措施。将输血、环孢素和HLA配型并列为影响移植物存活的三大因素。如三大因素达到最佳水平，1年移植
肾存活率可达89%，三者都差的1年移植肾存活率仅为49%。
进入90年代，术前输血的利弊得失受到临床的广泛关注，尤其是输血导致的致敏性受到临床医师的高度重视。同时，促红细胞生成素(EPO)在临床的广泛应用，也使术前输血的病人明显减少。首次尸肾移植的致敏性与术前输血呈线性增加关系，尤其是PRA 11~50%和PRA 50~100%的致敏性，术前输血组和未输血组具有极显著性差异(p<0.0001)。
目前，无特殊情况下，等肾受者是不主张术前输血的。
2、妊娠
1986年UNOS的随访资料显示：术前输血的男性受者的致敏率大约是15%，而女性受者如果有妊娠史和输血史，致敏率达40%。妊娠，是女性受者致敏性显著高于男性受者的主要原因。因此，尤其对多产妇，在移植前检测抗HLA抗体具有重要的临床意义。
3、移植物失功
移植物失功产生致敏抗体的主要原因是供、受者的HLA相容性差异。
4、原发病导致慢性肾功能衰竭的原发病中，系统性红斑狼疮受者的致敏性最高，总体上有31%的受者PRA 51~100%，明显高于其他原发病(p<0.01)。胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、高血压肾病(HTN)、慢性肾小球肾炎(CGN)和多囊肾(PKD)的致敏性均在8~10%之间，致敏性大致相同。
二、致敏在器官移植中的临床问题
（一）致敏与超急性排斥反应
致敏受者最早引起临床重视的主要原因之一是认为高致敏受者是导致超急性排斥反应(HR)的主要原因。由于新的抗体检测技术和新的强力免疫抑制剂的应用，目前，HR和不典型HR的发生率已明显下降。因此，HR与致敏，尤其是高度致敏之间存在着一定的关系，但致敏并不是引起HR的唯一原因。
（二）致敏与急性排斥反应
PRA大于50%的首次尸体移植术后六个月内46%的受者至少发生一次以上急性排斥反应，再次移植者高达53%；而非致敏者只有38%。而且，这种急性排斥多出现在移植早期。
对于致敏受者，过去通常采用抗淋巴细胞抗体作为诱导治疗，试图减少急性排斥反应的发生。目前有的文献认为，这种诱导治疗的措施并不能减少急性排斥反应的发生率。
（三）致敏与移植物功能延迟
致敏受者最常见的临床问题是移植物功能延迟，从而在总体上影响移植物存活率。虽然推荐应用抗淋巴细胞抗体诱导治疗，但70%的致敏病人并无显著效果。因此，致敏者发生原发性无功能肾(PNF)的比例明显升高。
（四）致敏与HLA配型
HLA-A、B、DR无错配或者HLA氨基酸残基无错配的肾移植，不但能够显著提高移植物存活率和半寿期，而且在移植物失功后引起致敏的可能性也大大减少。对于致敏者，与其说采用抗淋巴细胞抗体诱导治疗，还不如寻找HLA抗原相配或氨基酸残基相配的供肾更为实用和有效。
三、抗HLA抗体筛选的主要临床用途
实体器官移植，如肾脏、肝脏和心脏移植，移植前应定期检测其
血清中是否存在抗HLA抗体，确定抗体的水平(致敏程度)以及确定抗体的特异性。主要临床意义包括：
1. HLA抗体阳性(>10%)的受者，移植物存活率明显低于抗体阴性(<10%)受者，而抗体>50%的受者，存活率又明显低于抗体水平11~50%的受者。>80%的阳性受者，一般认为是移植的禁忌症，除非找到HLA相配的供肾。
2.由于抗体的波动性，应定期检测，一般为每月检测一次。尤其是对于首次移植失功、术前有输血史和妊娠史的受者，更应密切监测。
3.根据受者体内的HLA抗体的水平和性质，选择移植器官、决定移植手术的时机。对于抗体阳性的受者，需采用适当的治疗方法改善机体的免疫状态，待抗体水平降到允许范围后再考虑移植。
4.确定抗体的特异性，避免应用具有相应靶抗原的供体器官。如受者体内存在HLA-A11抗体时，应避免选择具有HLA-A11抗原的供体器官。
5. HLA配型可克服致敏对移植物存活率的影响、降低致敏率。高致敏受者，尤为重要。
6. HLA抗体阳性的受者，移植前一定要行交叉配型。
7.移植后HLA抗体水平的监测，有助于判断机体的免疫状态，
帮助调整免疫治疗方案及指导免疫抑制剂的应用。
8.在美国，组织相容与免疫学会规定：肾脏移植前一定要通过合格的HLA抗体筛选。
四、致敏受者的处理对策
致敏是器官移植尤其是肾脏移植面临的一个临床难题。
首先，移植受者体内存在高水平的抗HLA抗体对移植临床效果的影响是多方面的。既可引发各种类型的排斥反应、延缓移植物功能恢复，还与早期移植物失功、降低移植物短期与长期存活有关。
其次，移植前峰值PRA(peak PRA)对移植物存活的影响比PRA水平更有预测性。也就是说，术前有高水平PRA史，即使移植当前的PRA水平正常，同样影响移植物存活。
第三，致敏受者明显增加等肾时间，不但增加经济负担，而且有可能在漫长的等肾期间出现并发症，失去移植的机会。
第四，致敏抗体与其他因素，如年龄、种族、性别等具有协同作用，影响受者的免疫反应性。
目前，对致敏受者的临床治疗与处理缺乏公认的理想措施，预防抗体的产生是第一位的。
（一）预防对策
针对致敏的三大主要原因，采取相应的预防措施，最大限度地减少致敏的发生是最根本、最有效的途径。
1.术前输血如无特殊需要，应避免移植前任何时间输血或输入血液成份。对术前贫血的处理采用EPO治疗。
2. 避免反复的妊娠、流产，尤其应避免多次分娩。
3. 尽最大努力减少首次移植物免疫原因的排斥反应和失功。
4.再次移植应避免HLA的重复错配，尤其是HLA-DR抗原的重复错配。
（二）致敏受者的处理原则
1.确定致敏抗体的类型，并确定抗HLA-IgG抗体的特异性。
临床研究结果显示：只有抗HLA-IgG抗体才是真正影响移植物存活的抗体。因此，筛选出抗HLA-IgG抗体并确定其特异性具有重要意义。
抗HLA-IgG抗体包括Ⅰ类抗体和Ⅱ类抗体。现有的临床研究显示，Ⅰ类抗体对移植物的影响是明确的，既影响早期、短期存活和排斥反应，也影响其长期存活。Ⅱ类抗体的作用尚有争论，有资料显示对移植物早期存活和排斥反应影响不明显，可能对长期存活不利。
2.避免供体具有致敏抗体的靶抗原。确定抗HLA-IgG抗体特异
性的另一个重要性在于挑选供体时，通过避免选择含有相应靶抗原的供肾，使移植获得成功。如肾移植致敏受者的抗体特异性为A11、DR7，在挑选供肾时，不要选择具有HLA-A11、DR7抗原的供肾。这样，特异性抗体就失去了靶细胞，避免了对移植物的攻击和破坏作用。
3.规范交叉配型方法，选择交叉配型阴性的供体。高敏受者紧急救治方案(save our souls, SOS方案)
SOS方案简述：高敏受者血清送到UKTS，分别与100
份供者淋巴细胞制成的试剂板(panel tray)进行交叉试验，确定抗体的频率后进入SOS筛选程序。血清样本每4个月与二份SOS血清板试验，其中一份是已知的，另一份为混合的，均根据ABO血型分组。当找到合适的供肾，交叉配型试验由SOS供肾中心进行。如果交叉配型阴性，再重复一次，以肯定阴性结果。交叉配型阴性+缺乏前次失功肾重复HLA错配和缺乏其他不可接受的HLA错配，作为筛选标准。筛选到的供肾和供者血清送到受者所在的移植中心，再与移植受者血清重复交叉配型。如交叉配型重复阴性，尽管存在HLA错配(可接受的错配)，则行移植。
随访结果与影响因素分析：
(1)进入SOS方案的高敏受者，以女性首次移植多见，显示女性更容易成为高致敏者，可能与术前输血和妊娠史有关。
(2)移植物存活率 6个月：69%，1年：65%，2年：60%。与Opelz 于1988年报道的欧洲首次尸肾移植1年存活率71%、再次移植为68%，十分接近。
(3) HLA相容程度对SOS移植肾存活有重要影响，强度依次为HLA-B+DR、HLA-DR、HLA-B，HLA-A的影响很小，与Opelz报道的未致敏者尸肾移植结果相同。如HLA-B+DR无错配(35例)、1年肾存活率80%，1 个错配(50例)、1年肾存活率67%，2个以上错配组1年肾存活率56%；HLA-B抗原无错配(73例)、1年肾存活率74%，1 个B错配其1年肾存活率59%，2个B错配组1年肾存活率60%；具有统计学差异。
(4)早期移植物丧失是SOS移植的主要问题(但无超急性排斥)。HLA-DR相配可降低移植物丧失的机率。
(5)关于DR1的作用 DR1阳性受者的存活率好于DR1阴性受者，原因不清。可能与下列因素有关：① DR1与低免疫反应性有关。②高敏受者中DR1阳性频率9.4%、供肾中DR1频率为16.2%、未致敏人群中DR1阳性频率为17.8%，显示DR1不易成为高敏者。
(6)结论 SOS方案可成功地施行尸肾移植，具有交叉配型阴性、DR相配的移植在高敏受者中是可行的。
4.在交叉配型阴性的前提下，寻找HLA相容的供肾。此乃移植成
功并长期存活的根本措施。高敏受者跨中心供肾交换计划。1991年Opelz报道高敏受者通过跨中心肾脏交换，使200例尸肾移植得以实施并获得成功。分析随访结果总结如下：
(1)作者原来的设想是高敏受者只要交叉配型阴性，应该对任何HLA错配都是允许的，而无需强调HLA的相容性程度。但实际情况恰恰相反，HLA相容显示出十分重要的作用。
(2)筛选高敏受者的供肾条件交叉配型阴性、HLA错配可允许(不存在致敏抗体的靶抗原)。
(3)HLA相容的影响程度 DR > B > A。
(4)HLA-DR抗原的要求 1个DR错配而交叉配型阴性是允许的，2个DR均错配，原则上不应移植。
(5)1年肾存活率首次移植72%、再次移植71%、三次及以上移植降低25%(45%)。如果高敏受者选择交叉配型阴性，HLA-DR+B抗原无错配，1年肾存活率可达88%。
5、血浆臵换与吸附
对高敏受者，术前采用血浆臵换、碳棒吸附或免疫吸附等措施，降低PRA水平至允许范围，再行移植，国内外均有成功的报道。
Schaub(1998年)报道1例PRA>50%的受者，多次交叉配型阳性。经过大容量的血浆臵换和输入经照射处理的供者淋巴细胞等处理，使PRA水平降到可监测水平以下，移植获得成功。
国内多家中心报道术前通过血浆臵换或碳棒吸附，使PRA水平降低到允许范围，使移植获得成功。，
评价：采用血浆臵换、血浆分离或吸附等方法处理高敏受者，再行移植获得成功，国内外均有报道。但均属于个案报道或小样本经验，不能作为普遍经验，冒然应用于临床。
6、HLA相容对高敏受者肾脏移植的影响
从移植免疫学角度，挑选HLA相容的供受者，是目前处理高敏受者移植问题最有效的措施。分析结果显示：
(1)致敏是肾脏移植面临的重要临床问题。
(2)HLA-A、B、DR相匹配可克服致敏对尸肾移植存活的影响。致敏受者的首次移植，如果HLA-A、B、DR相容，其1年肾存活率十分接近于未致敏组有HLA错配受者尸肾移植的效果。
(3)HLA无错配的致敏者，首次移植3年存肾活率可提高10%以上、半寿期提高3年。
(4)HLA无错配的致敏受者，首次尸肾移植的4年肾存活率可达72%、半寿期11.8年，与3个以上HLA错配组(4年存活率55%、半寿期7.4年)比较具有非常显著性差异。
(5)致敏者再次移植中，HLA相容的作用更加明显，无错配者的4
年肾存活率可达68%。
(6)HLA相容还可降低移植失败者的致敏性、降低术后无尿、早期透析、早期移植物失功和急性排斥的发生率。
HLA氨基酸残基相配对致敏受者肾移植的影响类似于HLA抗原相配。如首次尸肾移植致敏者如果残基相配，4年肾存活率达65%、半寿期10.4年，而错配组的4年存活为53%、半寿期只有7.8年，均具有非常显著性意义(p<0.01)。再次移植致敏者如果残基相配，其1年肾存活率可达84%，错配组为76%，差异有极显著性意义(p<0.001)。4年肾存活率残基相配组达68%，与抗原相配组相同。
五、PRA的检测方法：
移植前，检测HLA抗体的特异性及PRA百分比可有效的帮助医生选择器官和决定移植时机。移植后，监测血清PRA水平可帮助临床医生调整治疗方案。尤其是对免疫抑制剂的应用。目前，临床常用的HLA抗体的检测方法分为：
1、标准补体依赖性细胞毒实验（CDC）
原理将已知抗原的淋巴细胞通过特殊处理，以固定的细
胞含量事先点在微孔板上。应用时，将患者血清点在细胞板上，经过一段时间的孵育（90分钟）及补体的参与，如患者血清中含有与淋巴细胞表面特意性结合的抗体，可发生细胞溶解作用，根据细胞的溶解程度判断患者的免疫状态及HLA抗体的特异性。
2、酶联免疫法PRA检测：
原理将事先纯化的具有HLA抗原性的IgG包被在酶免板上，利用酶联免疫的原理，将患者血清点在此种抗原板上。通过颜色的变化判断PRA水平和抗体的特异性。
3、流式细胞仪PRA（FLOW-PRA）检测
原理流式细胞仪PRA检测是将纯化的HLA I类和II类抗原分别包被在数十个微颗粒珠上，纯化的HLA抗原包括所有常见的HLA抗原及稀有HLA抗原。这些颗粒珠与待检血清孵育一段时间后与带有荧光标记的抗人IgG抗体结合，通过流式细胞仪可检测出血清标本中HLA抗体的特异性及强度（PRA%）。