微生物生理生化实验报告
微生物细菌实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解细菌的基本形态结构。
2. 掌握细菌的分离、纯化和鉴定方法。
3. 学习细菌生理生化反应的检测原理和应用。
二、实验原理细菌是单细胞微生物，具有典型的原核细胞结构。
通过观察细菌的形态、染色和生理生化反应，可以鉴定细菌的种类。
三、实验材料与仪器1. 材料：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等纯菌株。
2. 仪器：显微镜、接种环、培养皿、酒精灯、无菌水、生理盐水、革兰氏染色液、生理生化试剂等。
四、实验方法1. 细菌形态观察- 将细菌涂布在载玻片上，进行革兰氏染色。
- 使用显微镜观察细菌的形态、大小、染色性等特征。
2. 细菌分离与纯化- 将纯菌株接种于琼脂平板，进行划线分离。
- 观察菌落特征，挑选单菌落进行纯化。
3. 细菌生理生化反应检测- 进行糖发酵试验、吲哚试验、甲基红试验、V-P试验等。
- 观察反应结果，判断细菌的生理生化特性。
五、实验结果与分析1. 细菌形态观察- 大肠杆菌：革兰氏阴性，呈杆状，两端钝圆。
- 金黄色葡萄球菌：革兰氏阳性，呈球形，呈葡萄串状排列。
- 肺炎克雷伯菌：革兰氏阴性，呈短杆状，两端钝圆。
2. 细菌分离与纯化- 划线分离后，观察到单菌落形成。
3. 细菌生理生化反应检测- 糖发酵试验：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均能发酵葡萄糖。
- 吲哚试验：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均呈阳性。
- 甲基红试验：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均呈阳性。
- V-P试验：金黄色葡萄球菌呈阳性，大肠杆菌、肺炎克雷伯菌均呈阴性。
六、讨论与分析1. 通过观察细菌的形态、染色和生理生化反应，可以初步鉴定细菌的种类。
2. 细菌的生理生化反应具有特异性，可用于细菌的鉴定和分类。
3. 在实际应用中，细菌的分离、纯化和鉴定是微生物学研究和临床诊断的重要环节。
七、实验结论1. 通过本次实验，我们掌握了细菌的基本形态结构、分离、纯化和鉴定方法。
2. 我们学会了利用生理生化反应进行细菌的鉴定和分类。
3. 本实验有助于提高我们对微生物学基本理论的认识和应用能力。
微生物生理生化反应
微生物生理生化反应实验原理通过测定微生物细胞内某些酶类的有无、对某些底物的利用能力、代谢产物的类型等来研究微生物代谢的多样性。
某些细菌产生色氨酸酶，能分解培养基蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚，当吲哚遇到含有对二甲基氨基苯甲醛试剂，形成红色的玫瑰红吲哚，为吲哚反应阳性。
V-P反应也称乙酰甲基甲醇试验。
微生物发酵葡萄糖产生丙酮酸，2分子丙酮酸脱羧形成乙酰乳酸，继续脱羧形成乙酰甲基甲醇，后者在碱性条件下与胍类、肌酸类物质反应，形成红色化合物，为V-P反应阳性。
有些细菌发酵糖类产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使发酵液的pH下降到4.2以下，当加入甲基红试剂后，使发酵液变红色。
某种微生物能以某种糖类为碳源，产酸产气，则判断为发酵这种糖。
实验材料和方法：材料：培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖和蔗糖）、酚红半固体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基；菌种：大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus arueus）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）；试剂：V-P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲酚紫指示剂、抗生素；仪器及用具：酒精灯、接种环、超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、试管、移液管、滴管、杜氏小管、记号笔等。
实验方法：1.V-P反应取5只装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管，以无菌操作分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形均、枯草芽孢杆菌菌液0.1mL至上述相应试管的培养基中，空白对照不接种。
置于37℃恒温箱中培养48小时。
取出培养物，分别从中取出2.5mL培养液，再加入等量V-P试剂，充分震荡后放置在37℃培养箱中温育30min。
微生物实验报告
微⽣物实验报告动物微⽣物及免疫学实验报告⼀、实验⽬的（⼀）掌握⼀般培养基的制备原理及要求，掌握培养基酸碱度的测定，熟悉⼀般培养基的制备过程和各种器⽫灭菌⽅法。
（⼆）掌握细菌分离培养的基本要领和⽅法，掌握细菌抹⽚的制备⽅法和⾰兰⽒染⾊法及油镜的使⽤⽅法，并认识⾰兰⽒染⾊的反应特性。
（三）掌握学习⽤微⽣物学原理诊断疾病的⼀般⽅法及步骤。
⼆、实验⽤品（⼀）器材量筒、烧杯、电⼦天平、漏⽃、三⾓烧瓶、空试剂瓶、玻璃棒、玻璃平⽫、刻度吸管、pH试纸、纱布、脱脂棉、天平、电炉、试剂瓶瓶塞、扎绳、放⼤镜、包装纸、洗⽿球、酒精灯、载玻⽚、⽕柴、吸⽔纸、剪⼑、记号笔、接种环、注射器、镊⼦、钳⼦、毫⽶尺、培养箱、⽔浴培养箱、⾼压蒸汽灭菌锅、油镜（⼆）试剂及材料肘胨、蛋⽩胨、猪胆盐、氯化钠、琼脂、乳糖、0.01%结晶紫⽔溶液、0.5%中性红⽔溶液、⾎清、胰化蛋⽩胨、酵母提取物、氢氧化钠、盐酸、⽜⾎清、⾰兰⽒染⾊液、蒸馏⽔、⼩⽩⿏、病猪内脏三、实验步骤（⼀）培养基的制备（所有⽤到的器⽫都已121℃⾼压灭菌15~30min，倾注平板在⽆菌操作台内完成，并放在⽆菌操作台内）1、麦康凯培养基（1）组成：蛋⽩胨17g、肘胨3g、猪胆盐5g、氯化钠5g、琼脂17g、乳糖10g、0.01%结晶紫⽔溶液10ml、0.5%中性红⽔溶液5ml、蒸馏⽔1000ml（2）⽅法：将蛋⽩胨、肘胨、猪胆盐和氯化钠溶解于400ml蒸馏⽔中，调节pH⾄7.2。
将琼脂加⼊600ml蒸馏⽔中，并加⼊乳糖，加热熔化。
将两液混合，分装于烧瓶内，⽤纱布、扎绳等捆好后，121℃⾼压灭菌15~30min。
待冷却⾄50 ~ 55℃时，加⼊结晶紫和中性红⽔溶液，摇匀后倾注平板。
注：结晶紫和中性红⽔溶液配好后需经⾼压灭菌。
2、⾎清平板（1）组成：营养琼脂、⽜⾎清（2）⽅法：将灭菌的营养琼脂加热熔化，冷却⾄45~50℃时，加⼊⽜⾎清，并混匀，倾注平板。
注：不得将⽜⾎清⼀并加⼊后再灭菌。
微生物的生理生化反应
实验六微生物的生理生化反应一、实验目的掌握细菌鉴定中主要生理生化反应的常规实验法。
二、实验原理由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。
具体个原理如下：1、淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种两种细菌（1—枯草杆菌，5—大肠杆菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。
2、明胶水解试验：穿刺接种于明胶培养基中的细菌，若能产生明胶酶利用明胶，则该培养基在4摄氏度条件下会处于液体状态，从而区别于正常条件下4摄氏度时固态的明胶培养基。
3、糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。
酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。
若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。
4、IMVC实验包括四个试验，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水环境的细胞血检查。
①吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。
本次不做该试验。
②甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙算和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。
③柠檬酸盐利用试验：有些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一的碳源，而有些细菌则不能利用。
由于细菌不断地利用柠檬酸盐并生成碳酸盐，使培养基PH由中性变为碱性，培养基中的指示剂有浅绿色变为蓝色。
④伏-普试验（乙酰甲基甲醇试验 VP）：某些细菌在代谢过程中，能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸在羧化酶的催化下脱羧后形成活性乙醛，后者与丙酮酸缩合，脱羧形成乙酰甲基甲醇，或者乙醛化合生成乙酰甲基甲醇。
细菌的生理生化实验
1 目的1.1 了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理1.2 掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法2 原理各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。
由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，这种差异就表现的更加明显。
不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不相同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系统。
即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。
3 材料3.1 菌种大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面菌种3.2 培养基葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）3.3 试剂40％NaOH溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示剂。
3.4 器具超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。
4 流程糖发酵试验→V-P试验→甲基红试验→吲哚试验5 步骤(一) 糖类发酵试验1 目的了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法．2 原理可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。
是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。
是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。
3 材料3.2菌种大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）的斜面菌种3.３培养基葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管４流程发酵液试管→标记→接种→培养→观察→记录5 步骤5.1 试管标记图9-1 糖发酵产气取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管各Ａ不产气；Ｂ产气4支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。
微生物生理实验一
实验一IMViC 和H2S试验［目的］利用常规生理生化反应IMViC 和H2S试验来考察菌株对不同底物的利用［材料和培养基］（1）菌株：大肠杆菌菌株HDYM04（2）培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基（蛋白胨5g NaCl 5g 葡萄糖5g 水1L pH7.2），蛋白胨水培养基（蛋白胨10g NaCl 5g 水1L pH7.2），柠檬酸盐培养基（柠檬酸钠2g NaCl 5g MgSO4•7H2O 0.2g K2HPO4•3H2O 1g (NH4)2HPO4 1g 1％麝香草酚蓝水溶液10ml 琼脂20g 水1L 呈淡绿色），柠檬酸铁铵培养基（柠檬酸铁铵(棕色) 0.5g 硫代硫酸钠0.5g 牛肉膏3g 蛋白胨10g NaCl 5g 琼脂15g 水1L 直立）。
［实验内容］1．吲哚试验某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚，吲哚能与检测试剂形成红色的玫瑰吲哚。
取蛋白胨水培养液4支分别标注1，2，3，4。
用接种环挑取少量菌苔接种入相应的试管，37℃培养24-48小时，于各管中加入乙醚1mL，充分振荡后静置至分层，沿管壁滴入数滴吲哚试剂，观察结果。
2．甲基红试验某些细菌能够分解葡萄糖产生丙酮酸，进而产生甲酸、乙酸和乳酸等降低培养基的pH值，因此可以用甲基红指示剂（指示范围为4.4-6.3,由红变黄）进行检测。
取葡萄糖蛋白胨水培养液2支分别标注1，2。
用接种环挑取少量菌苔接种入相应的试管，滴入2滴甲基红指示剂，37℃培养24-48小时，观察结果。
3．VP试验某些细菌能够分解葡萄糖产生丙酮酸，进而形成乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性条件下形成乙二酰，乙二酰可以与胍基化合物形成红色化合物而被检测出来。
取葡萄糖蛋白胨水培养液2支分别标注1，2。
用接种环挑取少量菌苔接种入相应的试管，37℃培养24-48小时。
加入等量的NaOH（40％），混匀后加入少量肌酸，剧烈振荡15－30min后观察，红色为阳性。
4．柠檬酸盐试验有些细菌可以利用柠檬酸盐作为唯一碳源产生碳酸盐，使培养基由中性变为碱性，可以用指示剂进行检测。
微生物的生理生化试验
一、糖类代谢试验
5、β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）
二、蛋白质代谢试验
不同细菌分解蛋白质能力不同，可利用不 同氮源来合成菌体蛋白质，可通过检测加 入蛋白质分解后的产物或PH变化来鉴定细 菌。
二、蛋白质代谢试验
1、吲哚（indole）试验（又称靛基质试验） 目的：用于肠杆菌科细菌的鉴定。 原理：细菌分解蛋白胨中色氨酸生成的吲哚与试剂 中的二甲氨基苯甲醛作用生成红色的玫瑰吲哚。 方法：纯培养物接种蛋白胨水后35℃培养24-48h沿 管壁徐徐加入Kovac氏试剂或欧氏试剂0.5ml观察。 结果：两层液体交界处出现红色为阳性，无色为阴 性。
2、凝固酶试验
目的：常用于鉴别葡萄球菌。 原理：金黄色葡萄球菌可产生凝固酶，使血浆中的纤维 蛋白原转变为纤维蛋白附着于细菌表面产生凝固。分为 与细胞壁结合的凝固酶（玻片法）与菌体生成后释放在 培养基中的游离凝固酶（试管法）。 玻片法：在玻片上加生理盐水与血浆个一滴，观察凝集 情况 试管法：三只含1：4血浆0.5ml的试管各接种待检菌、 阳性菌株和肉汤阴性菌株，待检菌出现凝固且阴性对照 不凝固为阳性。
三、碳源和氮源利用试验
2、丙二酸盐利用试验 目的：用于肠杆菌科细菌的鉴定。 原理：某些细菌将丙二酸盐作为唯一的碳源时，丙 二酸盐被分解成为碳酸钠，使培养基变碱性。 结果：培养基变蓝色为阳性，颜色无变化为阴性。
三、碳源和氮源利用试验
2、丙二酸盐利用试验
三、碳源和氮源利用试验
3、醋酸盐利用试验 目的：用于肠杆菌科细菌的鉴定。 原理：细菌利用铵盐作为唯一氮源同时利用醋酸盐 作为唯一碳源时，分解醋酸钠产生二氧化碳和水与 钠离子结合生成碳酸钠使培养基呈碱性，指示剂由 绿变蓝。 结果：斜面上有菌落生长且培养基变蓝色为阳性。
微生物学实验报告
微生物学实验报告（格式标准）(生命科学专业)*****目录索引实验一油镜的使用和细菌的简单染色法 3实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5实验三常用培养基的配制7实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8实验五、微生物大小的测定与显微计数10实验六环境中微生物的检测和分离纯化11实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12实验八（综合实验）化能异养微生物的分离与纯化13课程名称：微生物学实验班级：化生系生命科学本科实验日期：指导教师：黎勇实验一油镜的使用和细菌的简单染色法〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术；观察细菌的基本形态；学习观察细菌的运动性的基本方法。
〔基本原理〕1. N·A=n·sinα2. D=λ/2N.A3. 目镜可提高放大倍数，但有效放大率取决于镜口率。
已经分辨的物体不放大看不清，未分辨物放得再大也看不清。
4. 用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时，可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。
〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸；细菌、放线菌等固定装片；培养18小时左右的B.subtilis. S.arueus 菌斜面培养物；无菌水、生理盐水。
〔方法步骤〕：（一）油镜的使用镜检装片在中倍（或高倍镜）下找到目的物，并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置，虹彩光圈开到最大，镜头转开成八字形在玻片的镜检部位（光斑处）滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台（缩短镜头与装片距离，镜头浸入油中，至油圈不扩大为止镜头几与装片接触）粗调器徐徐下降载物台（密切注视视野，当捕捉到物像时，立即用细调器校正）仔细观察并绘图取出装片，清洗油镜：擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留（用手指辅助，迅速拭擦一、二次）用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯（2-3次）。
（二）细菌的简单染色法：涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察（三）细菌运动性的观察取洁净盖玻片，四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察〔结果分析〕1、画一圆圈表示视野，选取所观察的微生物绘图，注意特殊结构、形状和排列。
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实验十一IMViC与硫化氢试验
指导教师：李海花
周六第三组
学号：060122010041 姓名：宋天佳专业：2010级水产养殖
学号：030212010025 姓名：皇昊专业：2010级化学1班
学号：060122010055 姓名：续鹏辉专业：2010级水产养殖
一、实验目的
了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。
二、实验原理
IMViC是I－吲哚（indol test）、M－甲基红（methyl red test）、V－伏-普（Voges-Prolauer test）和C－柠檬酸盐（citrate test）4个实验的缩写。
这4个实验主要用来快速鉴别产气杆菌与大肠杆菌，多用于水的细菌检查。
大肠杆菌虽非致病菌，但在饮用水时若超过一定指标，则表示水质受粪便污染。
产气杆菌也广泛存在于自然界中，因此检查水是要将两者分开。
硫化氢（H2S）实验也是检查肠道细菌的生化实验。
（一）吲哚试验（indol test）
吲哚试验是用来检测吲哚试验的产生，有些细菌分解培养基中的色氨酸生成吲哚（靛基质），经与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色。
色氨酸＋H2O色氨酸酶吲哚＋NH3＋丙酮酸
吲哚+ 对二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚（红色）
只有部分细菌能产生色氨酸酶，从而具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚实验可以作为一个生化检测指标。
大肠杆菌产色氨酸酶实验结果为阳性（红色），产气肠杆菌不产色氨酸酶实验结果为阴性（无色）。
（二）M-甲基红试验（methyl red test）
用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。
细菌代谢糖产生酸使培养基变酸（pH下降），使甲基红指示剂变色：橘黄色（pH6.3）红色（pH4.2）尽管，所有肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但大肠杆菌和产气肠杆菌有区别：两者在培养早期产生有机酸，但大肠杆菌在培养后仍能维持酸性pH4，而产气肠杆菌则将有
机酸转化为非酸性产物，使pH上升至6左右。
因此，大肠杆菌为阳性（红色），产气肠杆菌阴性（黄色）。
（三）伏-普实验（V oges-Prolauer test）
测定细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物（如丙酮酸）的能力。
丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。
二乙酰与蛋白胨中的精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，及伏-普反应阳性，不产生红色化合物者为反应阴性。
碱性条件、加入少量含胍基的化合物可使反应更明显。
大肠杆菌不产丙酮酸实验结果为阴性（无色），产气肠杆菌产丙酮酸实验结果为阳性（红色）。
葡萄糖丙酮酸-CO2缩合乙酰乳酸-CO2脱羧乙酰甲基甲醇+OH--2H 胍基+二乙酰红色化合物
（四）柠檬酸盐试验（citrate test）
用来检测柠檬酸盐是否被利用，有些细菌以柠檬酸钠为碳源，培养基中的柠檬酸和磷酸铵被分解后，产生碱性化合物，使pH升高，当加入1％溴麝香草酚蓝指示剂时，培养基就会有绿色转变为深蓝色，溴麝香草酚蓝指示范围：pH＜6黄色，pH 6～7绿色，pH ＞7 蓝色。
大肠杆菌不能利用柠檬酸盐实验结果为阴性（绿色），产气肠杆菌能利用柠檬酸盐实验结果为阳性（蓝色）。
（五）硫化氢实验
用来检测硫化氢的产生，也是用于肠道细菌检查的常用生化实验。
含硫有机物（如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸）能被部分细菌分解产生H2S，H2S和培养基中的铅盐或铁盐反应，形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀。
大肠杆菌不能分解含硫有机物实验结果为阴性（无沉淀），产气肠杆菌能分解含硫有机物实验结果为阳性（黑色沉淀）。
三、实验器材
1、菌种：大肠杆菌、产气肠杆菌斜面各一支。
2、培养基：蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、柠檬酸盐培养基、硝酸盐还原培养
基、醋酸铅培养基
3、溶液和试剂：甲基红指示剂，40％KOH，5％-萘酚溶液，乙醚，吲哚试剂
4、仪器或其他用具：试管架，接种环等
四、操作步骤
一）实验准备
1.葡萄糖蛋白胨水培养基配制：蛋白胨3g，葡萄糖3g，磷酸氢二钾1.2g，水600ml，溶
解，调节Ph7.，0-7.2，分装于70支试管中，112℃灭菌30min。
2.柠檬酸盐培养基配制：NH4H2PO40.2g，K2HPO4 0.2g，NaCl1g，MgSO4 40mg，柠檬酸钠
0.4g，琼脂4g，调节pH6.8，1%溴香草酚蓝乙醇液2ml，水200ml，溶解，分装于20
支试管中，121℃灭菌20min。
（pH不宜偏高，以淡绿色为宜）
3. 硝酸盐还原培养基配制：蛋白胨1.25g，氯化钠0.625g，硝酸钾0.25g，水125ml，溶
解，调节pH7.4左右，分装于16支试管中，121℃灭菌20min。
4.硫化氢试验养基配制：蛋白胨5g，氯化钠1.25g，柠檬酸铁铵125mg，硫代硫酸钠125mg，
琼脂5g，水250ml。
先将琼脂、蛋白胨融化，冷至60 ℃时加入其他成分，调pH7.2左右，分装于35支试管中，112℃灭菌20min。
二）接种与培养
1.穿刺法分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支醋酸铅培养基（H2S），37℃培养48h。
2.分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支蛋白胨水培养基（I）、2支葡萄糖蛋白胨水培养
基（M＆V），37℃培养2d。
3.划S曲线法分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支柠檬酸盐斜面培养基（C），37℃培养
2d。
三）结果观察
1.H2S实验：观察是否有黑色硫化铅沉淀产生。
2.吲哚实验：2d后的培养物内加3～4滴乙醚，摇动数次，静至1～3min，待乙醚上升后，
沿管壁徐徐滴加2滴吲哚试剂，在乙醚和培养物之间产生红色环状物者为阳性反应。
3.甲基红实验：2d后的培养物内加2滴甲基红试剂，培养物变为红色者为阳性，黄色者
为阴性（注意甲基红不要过量，以免出现假阳性）。
4.伏－普实验：2d后的培养物内加5～10滴40％KOH，然后加入等量的5％-萘酚溶液，
用力振荡，红色为阳性。
5.柠檬酸盐实验：观察2d后的培养物上有无细菌产生及其颜色，蓝色为阳性，绿色为阴
性。
五、实验结果
将实验结果填入下表。
“＋”表示阳性反应，“—”表示阴性反应。
六、讨论
1. 吲哚试验、甲基红试验、伏－普试验、柠檬酸盐试验的实验结果与理论结果一致。
H2S
试验的实验结果与理论结果不一致，两支醋酸铅培养基中都产生黑色沉淀，均为阳性反应，可能的原因：接种操作时，先穿刺接种产气肠杆菌，之后，接种针未充分加热灭菌，再穿刺接种大肠杆菌时混入部分大肠杆菌；接种针在接种产气肠杆菌时，接种针上不粘上了产气肠杆菌，未被加热灭菌，再接种大肠杆菌时，将产气肠杆菌混入，使大肠杆菌产生假阳性反应。
2. 吲哚试验，实验现象不明显，可能的原因：培养基中的色氨酸含量不够高；吲哚试剂加
入的量不够，一部分粘在试管壁上损失掉，之后补加时乙醚已挥发；滴加吲哚试剂时动作不够轻缓，破坏了红色化合物的生成。
3. 为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，而产气肠杆菌为阴性？这个试验与伏—普试验最初
底物和最终产物有何异同？
大肠杆菌、产气肠杆菌都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解代谢途径不同。
大肠杆菌，可产生乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红，即甲基红反应阳性。
产气肠杆菌则使丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即伏-普阳性反应。
4. 说明在硫化氢试验中醋酸铅的作用,可以用哪种化合物代替醋酸铅？
醋酸铅培养基（试纸）可检验硫化氢的产生，反应为：Pb(Ac)2+H2S=PbS↓+2HAc产生黑色的硫化铅。
所以培养基（纸带）变黑为阳性，不变为阴性。
从硫离子的角度讲，硝酸银、硫酸铜可产生同样现象。
5. 为什么在细菌吲哚试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂,而不用丙酮酸？
吲哚比较容易检测，特异性也高，不容易受干扰。
丙酮酸则相对难以检测，特异性很低，很多反应都能产生丙酮酸，如葡萄糖酵解的终产物也是丙酮酸。