多糖结构解析

部分酸水解
控制水解条件得到几个单糖连在一起的寡聚糖。水解得到的较 低分子量的寡聚糖可用凝胶过滤、离子交换和分配层析等方法分离。 其中最常用的为硅胶挤压层析和碳柱层析以及后来发展起来的高压液
碱降解反应
碱降解通常发生在单糖的羟基或羧基连接的酯上。多糖还原端 的单糖逐个被剥落的碱降解反应常称为“剥皮反应”。分析多糖碱降 解所得到的醛酸就可推断出原来单糖的键型。酶降解反应发生在分子 的非还原端。
（1）制备负碳离子：无水二甲亚砜30ml于100ml试 剂瓶中，通入氮气几分钟后，加入1.5gNaH，渐渐 加温，然后恒温在65-70℃4-6小时。最终颜色为
（2）多糖甲基化
精确称取纯多糖200mg，加35ml无水二甲亚砜 ，通氮下搅拌至完全溶解后，加入18-20ml制备 的负碳离子液，通氮下搅拌4-6小时，然后加入 8ml碘甲烷，通氮条件下搅拌1-2小时后，停止通 氮，继续搅拌过夜。
方法：将糖样品用浓度为0.2mol/L的NaOH溶解，在 60℃水浴反应1hr.。以0.2mol/L的NaOH溶液为参比，在 230-270nm范围内扫描。
三、结构研究的化学方法
完全酸水解
阐明结构的第一步就是鉴别多糖的单糖组成。多糖酸水解是常 用的方法。多糖水解的难易与其组分中单糖的性质、单糖环的形状和 糖苷键的构型等有关；含有糖醛酸或氨基糖的多糖不易水解，α 型较β 型易水解，吡喃型戊聚糖较吡喃型己聚糖易水解，呋喃糖苷键一般较 吡喃糖苷键易水解。水解后中和水解液，然后用层析方法分析，常用 的层析方法有纸层析、纤维粉薄层层析和气相层析。近几年这种酸水 解方法分析已经达到完全自动化。
-乙醇
OCH3 OCH3 OCH3
m/e145
4、多糖中的乙酰基定位
原理：利用甲基乙烯醚将多糖结构上的游离羟基保 护起来，脱去乙酰基，使结合的羟基游离。对游 离羟基进行甲基化，去除保护基团并完全水解。 单糖上甲基化的位置即是原始多糖中的乙酰位置 。
操作：保护自由羟基：
多糖样品（93mg），悬浮于二甲亚砜（12ml） 加入P-甲苯磺酸（20mg），15℃混匀。
H2C
OC 3H
O H
m /e87
OC 3H
OC 3H
m /e101
-甲 醛
OC 3H
CH2 m /e71
由161、205进一步裂解为71.87.101.129.145。 OCH3
实际所得碎片为: 45.71.87.101.117.129.145.161.205
OCH3
O COCH3
OCH3
m/e205
解度及层析行为，灼烧实验，化学定性反应等。 3 结合文献调研。
(2)测定分子式,计算不饱和度 1、元素定量分析 2、分子量测定 3、同位素峰法
(3)确定分子式中含有的官能团（基本骨架等的结构分 析）
1、官能团的定性及定量 2、测定并解析化合物的有关光谱 （UV,IR,MS,HNMR,CNMR等） (4) 推断并确定分子的平面结构 1、 结合文献调研 2 、结合光谱解析及官能团定性定量分析结果。 (5)推断并确定分子的主体结构 1、测定CD或ORD谱
1、过（高）碘酸氧化
原理：可选择性断裂糖分子中连二羟基或连三羟基，生成 相应的多糖醛、甲醛或甲酸。
结果：
1 2或1 4键：每个糖基仅消耗一个分子的高碘 酸，无甲酸释放。
1 3位键：不被高碘酸氧化
1 6位键：消耗两个分子高碘酸，同时释放一个分 子甲酸。
然后用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定甲酸释放量。
一、组成成分分析
1、酸水解 1-3N硫酸，100℃，水解6-8小时。用碳酸钡 中和，G4漏斗过滤，蒸发皿蒸干。
气相色谱分析 纸层析（PG）：
展开剂： 正丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶5； 正丁醇∶吡啶∶水=6∶4∶3
显色剂：常用硝酸银显色剂 A：16%硝酸银水溶液∶丙酮=1∶9（V/V） B：1%NaOH乙醇溶液（W/V）
多糖（Polysaccharide）是天然大分子物 质，是天然化合物中最大族之一。多糖结构的分 析较蛋白质结构分析复杂，一方面是因为组成多 糖的单糖品种繁多（目前已知的单糖有200多种 ）；另一方面即使只有一种单糖组成的多糖其连 接方式的不同以及可能有分枝（蛋白质没有分枝 ），所以多糖的结构种类就很多，不容易分析。
注：糖液加入负碳离子后，液渐变为橙黄色；加碘 甲烷后液由混浊变清彻。
（3）透析 产物加蒸馏水稀释一倍，蒸馏水透析2-3天（换水）
（4）真空干燥（或冻干），得部分甲基化多糖，需进一步 甲基化
（5）进一步甲基化： 重复1-4的Hakomori methods 氧化银法
（6）产物：甲基化产物用氯仿溶解，萃取，收集氯仿层， 干燥得甲基化糖。
将冷至-10℃的甲基乙烯醚（5ml）滴加于上述
液中，让在15℃条件下反应4hr。
自
来水透析
40℃下减压浓缩至干，（以上步骤重复三次） 上Sephadex LH-20柱，丙酮洗脱，10ml/管收集， 合并10-17管。
脱乙酰基
上述糖衍生物溶于15ml甲醇，搅拌条件下 加入15ml 0.2mol/L 甲醇钠的甲醇液。
1→、1→6键型
O H
+ H
H
O 2IO 4 -
O H H
C H 3 O
C H 2 O H
N a B H 4
O
H O
0
H O H
H C C + O H O HO OHC OC H 2 O HH O H 2 C
C2 O H H
H +
C2 O H H CHOH
O H 2 O C2 O H H C2 O H H
正离子。
H
205 CH3 O
161
H
H 45
O
C O C H3
O CH3
117
H
161
O CH3 O CH3 OCH3
205
断裂方式如下:
主要碎片(m/e)为：45.117.161.205
OC 3H
CO3 CH OC 3H
m /e161
-甲 醇 H2C
-乙 醇
OC 3H
-乙 烯 酮
O CO3 CH
m /e129
（7）水解、还原和乙酰化 ①水解。完全甲基化的多糖真空干燥后，加85%甲酸1ml，
充N2 封管，100℃水解4小时，然后加甲醇蒸除甲酸，至 pH为67，真空干燥，再加入2 mol/L 三氟乙酸2ml， 100℃水解6小时，然后用无水乙醇赶除三氟乙酸至中性 ，再用蒸馏水赶除乙醇。 ②还原。加入NaBH4 60mg还原24小时，室温磁力搅拌； 然后加入半匙阳离子交换树脂，磁力搅拌2小时，定量滤 纸过滤，向滤液中加入甲醇蒸除硼酸，真空干燥; ③乙酰化。加乙酐、无水吡啶各0.5ml，封管，100℃乙酰 化2小时，然后移入蒸发皿，再反复加无水乙醇赶除乙酐 ，然后真空干燥;
C H 23; H
O
H
O HH
O
0
H O H
IO -4
O N a B H 4
O H + CHO C 2 H O H
O OO HH C O C
O H C O H 2 O 2 H CH O H 2 O H C 2 O O HH H C 2 C O H
以1→3位键合(1→3,6、1→2，3、1→2，4、1→3，4、1→2，3，4类似)
（3）降解：上述反应物加入1ml乙二醇、对蒸馏水透析 24小时。减压浓缩至小体积，加硼氢化钠还原。
用2 N 硫酸水解（100℃，6hr），碳酸钡中和
3、甲基化（单糖残基的连接方式）
是用甲基化试剂将糖分子中的游离羟基甲基 化成甲醚，然后水解，检识这些甲基糖产物，就 可能推测组成多糖分子中单糖间连接的位置（羟 基所在的位置，即为原来单糖残基的连接点）。 （氢化钠、碘甲烷）
O H
H
O
H
O H H
IO -4
O
0
H O H
N a B H 4
O H
H +
H H
O H
H 2OH O O H H O H
H O H
2、Smith降解：是将氧化产物还原后进行酸水解。
1 2位和1 6位键结合的经Smith降解后都有甘油产生。 （但1 2位结合的不产生甲酸，可供以区别）。
1
4键合的，最后得到的是乙二醇和丁四醇（赤藓醇）
混合液在75℃回流4hr，浓缩后上Sephadex LH-20柱，甲醇洗脱，10ml/管收集，合并14-24管 ，浓缩干燥。
红外光谱结果显示无乙酰基团（1260与 1730cm-1无吸收峰）
甲基化
去乙酰基多糖衍生物溶于5ml N，N-二甲基甲 酰胺，在搅拌下相继加入2ml碘甲烷和0.4g氧化 银。室温暗处搅拌反应20小时。过滤，残渣用氯 仿洗，合并滤液，浓缩至干，重复甲基化6次。最 后的滤液加20ml水和4ml10%氰化钠，氯仿萃取 5次（水洗）。干燥后上柱，氯仿-甲醇洗脱， 3ml/管收集，合并9-15管，浓缩至干。
多糖结构测定的意义
从天然物质中分离得到的单体多糖化合物即 使具有很强的活性与具有较大的安全性，但如果 结构不清楚，则无法进一步开展其药理学与毒理 学研究，也就不可能进行人工合成或结构修饰改 造工作，更谈不上进行高质量的新药开发研究， 其学术及应用价值将会大大降低。
结构研究的主要程序
(1)初步推断化合物类型 1注意观察样品在提取、分离过程中的行为。 2测定有关理化性质，如不同pH，不同溶剂中的溶
H
O CH3
O
n
H3C
O
CH3
H
O
H
O
CH3
O
O
H
O CH3
O CH3 O
H O
O CH3
CH3
OH
H
O