3丁基苯酞对慢性脑缺血大鼠海马中p_CREB_CREBmRNA表达的影响08.11.24
丁基苯酞注射液对慢性脑缺血大鼠脑自由基代谢及海马聚腺苷二磷酸核糖聚合酶表达的影响
２０ ０ ８年 １ Ｏ月 ～ ０ ９年 ３月 ， ２０ 我们 通 过 双侧 颈 总动脉结 扎制作 大 鼠慢 性脑 缺血 模 型 ， 察 丁基 苯 观
注射 液 ， 剂量 ２ｍｇｋ ， ／ ｇ ２次／ ， ｄ 连续 给药 ４周 。模 型 组腹 腔注射等剂量 生理盐水 ， 假手术 组不 给药 。 １２ ３ Ｓ Ｄ、 Ａ测定 ． ． Ｏ ＭＤ 说 明书。 取 视 交叉 前脑 组 织 匀浆 ，
两 两 比较行 Ｌ Ｄｔ Ｓ ． 检验 。Ｐ≤０ ０ 为 差异 有 统计 学 ．５
脉， 并用 ０号丝线结 扎近 、 心端后 ， 中间剪 断 ， 远 从 切 口内注射 ３ ２万 Ｕ ｍ 青霉素 ０ ２ ｍ 预防感染 ， 合 ／ｌ ． ｌ 缝
皮 肤 ， 回笼 中正 常饲养 。 放
１２ ２ 分 组 ．． 雄性 Ｓ Ｄ大 鼠 ８ ０只 ， 随机 分 为假 手 术 组 、 型组 、 模 丁基 苯酞 注射 液小剂 量组和大剂量组
像分 析软件 计算 各组 Ｐ Ｒ Ａ Ｐ蛋 白累计 光密 度值
（Ｏ ） ＩＤ 。
Ｔ ｒ 等…的方法将实验大 鼠用 １ ｏｅ ｒ ％戊巴比妥钠 ４ ５
～
１３ 统计 学方 法 ．
意 义。
２ 结 果
采 用 ＳＳ １． ＰＳ３ ０统计 软件 ， 间 组
５ ／ ｇ麻 醉 成 功 后 ， 性 分 离 出 双 侧 颈 总 动 ０ ｍｇ ｋ 钝
各２ ０只 ， 组大 鼠行 双侧 颈 总动 脉永 久 结扎 术 ， 每 假 手 术组大 鼠除不结 扎 双侧 颈 总动 脉外 ， 处理 同模 余
型组和丁基 苯酞 注射液组 。丁基苯酞 注射液大剂量
塑墨 ！ 旦 ！！竺
模型 组
竺
堡鱼 ！旦
组 手术第 ４周 后腹 腔 注射 丁基 苯 酞 注射 液 ， 剂量 ６ ｍ ／ｇ小 剂量 组手 术 第 ４周后 腹 腔 注 射 丁基 苯 酞 ｇｋ ，
正丁基苯酞可使慢性脑缺血后神经元形态趋向正常
Fund: 湖北省 2011 创新计划项目（2011JH-2013CXTT06）；湖北省教育部重大科研项目（D20102101）；湖 北医科大学基金（2013GPY03） Acceptance date: 2014-02-24
Cite this article: Wanhong Zhao, Chao Luo, Jue Wang, Jian Gong, Bin Li, Yingxia Gong, Jun Wang, Hanqin Wang. 3-N-butylphthalide improves neuronal morphology after chronic cerebral ischemia[J]. Neural Regeneration Research, 2014, 9(7): 719-726.
Institute of Basic Medical Sciences, Hubei University of Medicine, Shiyan, Hubei Province, China
摘要 研究已证实，正丁基苯酞可有效对抗急性缺血性脑卒中，但其对慢性脑缺血导致的神经元损伤的作用尚不知晓。实验 结扎老年大鼠双侧颈动脉，以模拟慢性脑缺血老年患者，灌胃给予正丁基苯酞。结果发现，正丁基苯酞干预使慢性脑 缺血大鼠大脑皮质和海马神经元形态趋向正常；大脑皮质和海马乙酰胆碱转移酶活性也明显上升；丙二醛和淀粉样 β 蛋白 1-42 含量明显降低；认知功能明显改善。这些数据说明正丁基苯酞可减轻慢性脑缺血大脑氧化应激损伤，改善 胆碱能神经功能，抑制淀粉样 β 蛋白积聚，减轻大脑神经元损伤和认知功能损害。 关键词： 神经再生； 正丁基苯酞； 神经元； 认知缺损； 脑缺血； 大脑皮质； 海马； 氧化应激； 胆碱能神经元； 淀粉
丁基苯酞对慢性脑缺血大鼠海马区NO表达的影响
丁基苯酞对慢性脑缺血大鼠海马区NO表达的影响陈静;杜业亮;李增芬【期刊名称】《中国实用神经疾病杂志》【年(卷),期】2012(015)005【摘要】目的研究丁基苯肽对慢性脑缺血大鼠海马区一氧化氮(NO)表达的影响.方法 80只大鼠随机分为假手术组、模型组、预处理组、处理组.根据硝酸还原酶法和β-NADPH组织化学染色法,又将每个小组分为两个亚组.模型组、预处理组和处理组利用双侧颈总动脉永久结扎术制备动物模型,假手术组不结扎双侧颈总动脉.预处理组在造模前及造模后均给予丁基苯酞,处理组在造模后给予丁基苯酞,假手术组和模型组在造模后给予同等剂量的生理盐水,4组分别在造模后1个月处死大鼠取材.用硝酸还原酶特异性还原NO 产物的方法测定大鼠前脑缺血模型中海马NO释放量的异常变化.β-NADPH组织化学染色显示一氧化氮合酶(NOS)阳性神经元,光镜下观察.结果模型组、预处理组及处理组海马区NO、NOS阳性神经元数目与假手术组相比均有明显增加.与模型组相比,预处理组和处理组海马区NO、NOS阳性神经元数目减少.与处理组相比,预处理组海马区NO、NOS阳性神经元数目减少更明显.结论慢性脑缺血缺氧能使大鼠海马区NO含量明显增加,丁基苯肽(NBP)能减轻这种变化.【总页数】4页(P5-8)【作者】陈静;杜业亮;李增芬【作者单位】潍坊医学院,潍坊,261042;山东潍坊人民医院神经内科,潍坊,261021;山东潍坊人民医院神经内科,潍坊,261021【正文语种】中文【中图分类】R-332【相关文献】1.丁基苯酞对慢性脑缺血大鼠脑内G-CSF和TNF-α表达的影响 [J], 王书霞;滕军放;康康;曾芳2.丁基苯酞注射液对慢性脑缺血大鼠脑自由基代谢及海马聚腺苷二磷酸核糖聚合酶表达的影响 [J], 肖向建;齐亚超;张晓玲;李强;高钟生;郭宗成;李军涛3.丁基苯酞对慢性脑缺血大鼠脑内Nogo-A表达的影响 [J], 胡文涛;卢宏;吴斌;李福春4.丁基苯酞对慢性脑缺血大鼠海马Chat蛋白表达的影响 [J], 沈瑞乐;王兴萍;滕军放;卢宏5.丁基苯酞对慢性脑缺血大鼠海马中p-CREB、CREB mRNA表达的影响 [J], 康康;滕军放;王书霞;邓文静因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
丁苯酞对慢性脑缺血大鼠海马iNOS及MG表达的影响
D O I :10.12083/S Y S J .2018.11.288㊃论著㊀科研之窗㊃作者简介:冯涛,E m a i l :631740898@q q.c o m 丁苯酞对慢性脑缺血大鼠海马i N O S 及MG 表达的影响冯㊀涛1)㊀杨霄鹏2)1)南阳医学高等专科学校第一附属医院神经内科,河南南阳473058㊀2)郑州大学第二附属医院神经内科,河南郑州450014ʌ摘要ɔ㊀目的㊀观察丁苯酞对慢性脑缺血大鼠海马区诱导型一氧化氮合酶(i n d u c i b l en i t r i co x i d e s yn t h a s e ,i N O S )㊁小胶质细胞(m i c r o g l i a ,MG )表达的影响,探讨丁苯酞脑保护作用机制㊂方法㊀48只雄性S D 大鼠随机分为4组:正常大鼠组为A 组,假模型组为B 组,模型组为C 组,丁苯酞干预组为D 组㊂行双侧大鼠颈总动脉永久结扎的方法制作大鼠慢性脑缺血模型㊂丁苯酞干预组在慢性脑缺血模型成功后给予丁苯酞软胶囊0.2g ㊃k g -1治疗12周,采用Y 迷宫测定各组大鼠学习记忆能力,免疫组化染色测定i N O S 及O X 42(小胶质细胞的标志)表达,特异性尼氏染色方法测定海马C A 1区神经元㊂结果㊀A ㊁B 组大鼠学习记忆能力正常,海马区i N O S ㊁O X 42少量表达,神经元数目正常㊂C ㊁D 组大鼠学习记忆能力下降,海马区i N O S ㊁O X 42表达增多,神经元数目减少㊂与C 组相比,D 组大鼠学习记忆能力明显增加(P <0.01),海马区i N O S ㊁O X 42表达减少(P <0.01),神经元数目增加(P <0.01)㊂结论㊀丁苯酞可减少慢性脑缺血大鼠海马区i N O S ㊁O X 42表达,减少MG 的过度激活,减少海马区神经元坏死,提高大鼠的学习记忆能力,具有脑保护作用㊂ʌ关键词ɔ㊀丁苯酞;慢性脑缺血;诱导型一氧化氮合酶;小胶质细胞;脑保护;大鼠;血管性痴呆;记忆能力ʌ中图分类号ɔ㊀R -332㊀㊀ʌ文献标识码ɔ㊀A㊀㊀ʌ文章编号ɔ㊀1673-5110(2018)11-1171-06E f f e c t o f b u t y l p h t h a l i d e o n i N O S ,M Gi n r a t s f o l l o w i n g ch r o n i c c e r e b r a l i s c h e m i a F E N GT a o 1),Y A N G X i a o p e n g2)1)D e p a r t m e n t o f N e u r o l o g y ,t h eF i r s tA f f i l i a t e d H o s p i t a l o f N a n y a n g M e d i c a lC o l l e g e ,N a n y a n g 473058,C h i n a ;2)D e pa r t -m e n t o f N e u r o l o g y ,t h eS e c o n dA f f i l i a t e d H o s p i t a l o f Z h e n g z h o uU n i v e r s i t y ,Z h e n gz h o u 450014,C h i n a ʌA b s t r a c t ɔ㊀O b je c t i v e ㊀T oo b s e r v e t h e ef f e c t s o f b u t h e p t i d i n e o n t h e e x p r e s s i o n o f i n d u c i b l e n i t r i c o x i d e s y n t h a s e (i N O S )a n d m i c r og l i a (MG )i nth ehi p p o c a m p u so fr a t s w i t hc h r o n i cc e r e b r a l i s c h e m i aa n dt oe x pl o r et h e p r o t e c t i v e m e c h a n i s m o fb u -t y l p h t h a l i d e .M e t h o d s ㊀F o r t y -e i g h tm a l eS p r a g u e -D a w l e y r a t sw e r er a n d o m l y d i v i d e di n t o4g r o u p s :n o r m a l r a t g r o u p A g r o u p (n o r m a l r a t s ),s h a m m o d e l g r o u p B g r o u p (f a l s em o d e l g r o u p ),m o d e l g r o u p C g r o u p (m o d e l g r o u p ),b u t y l ph t h a l i d e i n t e r v e n t i o n g r o u p D g r o u p (b u t y r o p h t h a l i d e i n t e r v e n t i o n g r o u p ).Ar a tm o d e l o f c h r o n i c c e r e b r a l i s c h e m i aw a s e s t a b l i s h e db yp e r m a n e n t l i ga -t i o no fb i l a t e r a lc o mm o n c a r o t id a r te r i e s .T h e b u t y l p h t h a l i d e i n t e r v e n t i o n g r o u p w a s g i v e nb u t y l p h t h a l i d e s of t c a p s u l e 0.2g ㊃k g-1f o r 12w e e k s a f t e r t h e s u c c e s s o f t h e c h r o n i c c e r e b r a l i s c h e m i am o d e l .T h e l e a r n i ng a n dm e m o r y a b i l i t i e s o f r a t s i n e a ch g r o u p w e r e m e a s u r e db y Y -m a z e ,i N O S w a s m e a s u r e db y i mm u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n g ,e x p r e s s i o no fO X 42(a m a r k e ro f m i c r o gl i a ),a s p e c i f i cN i s s l s t a i n i n g m e t h o dw a su s e dt od e t e r m i n e t h eh i p p o c a m p a lC A 1n e u r o n s .R e s u l t s ㊀R a t s i n g r o u p Aa n d g r o u p Bh a d n o r m a l l e a r n i n g a n dm e m o r y a b i l i t y ,a n d s m a l l a m o u n t s o f i N O Sa n dO X 42w e r e e x p r e s s e d i nh i p p o c a m pu s .T h en u m b e r o f n e u -r o n sw a sn o r m a l .T h e l e a r n i n g a n dm e m o r y a b i l i t i e s o f r a t s i n g r o u p sDa n dCw e r e d e c r e a s e d ,t h e e x p r e s s i o n o f i N O S a n dO X 42i n h i p p o c a m p u s i n c r e a s e d ,a n d t h en u m b e r o f n e u r o n s d e c r e a s e d .C o m p a r e dw i t h g r o u p C ,t h e l e a r n i n g a n dm e m o r y a b i l i t y o f g r o u p D i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y (P <0.01),t h e e x p r e s s i o no f i N O Sa n d O X 42i nh i p p o c a m p u sd e c r e a s e d (P <0.01),a n dt h en u m b e ro f n e u r o n s i n c r e a s e d (P <0.01).C o n c l u s i o n ㊀B u t y l p h t h a l i d ec a nr e d u c e t h ee x p r e s s i o no f i N O S ,O X 42,o v e r -a c t i v a t i o no fMGa n d n e u r o n a l n e c r o s i s i nh i p p o c a m p u s ,i m p r o v e t h e l e a r n i n g a n dm e m o r y a b i l i t y an dh a s c e r t a i nb r a i n p r o t e c t i v e e f f e c t i n c h r o n i c c e r e -b r a l i s c h e m i a .ʌK e y wo r d s ɔ㊀B u t y l p h t h a l i d e ;C h r o n i c c e r e b r a l i s c h e m i a ;I n d u c i b l e n i t r i c o x i d e s y n t h a s e ;M i c r o g l i a ;B r a i nP r o t e c t i o n ;R a t ;V a s -c u l a r d e m e n t i a ;M e m o r y a b i l i t y㊀㊀随着老龄社会的到来,慢性脑缺血(c h r o n i c c e r e -b r a l i sc h e m i a ,C C I )伴发的A l z h e i m e r s 病(A l z h e i -m e r sd i se a s e ,A D )㊁血管性痴呆(v a s c u l a r d e m e n t i a,V D )等多种脑血管疾病受到社会的广泛关注,已成为社会问题㊂近些年来对慢性脑缺血导致的脑损伤机制及防治研究较少㊂在慢性脑缺血的病理过程中诱㊃1711㊃中国实用神经疾病杂志2018年6月第21卷第11期㊀C h i n e s e J o u r n a l o f P r a c t i c a lN e r v o u sD i s e a s e s J u n .2018,V o l .21N o .11导型一氧化氮合酶(i N O S)表达增多,加速钠离子内流,是脑损伤的重要机制[1]㊂小胶质细胞(MG)是颅内重要的免疫炎症细胞,参与慢性脑缺血病理损伤过程㊂本研究采用双侧大鼠颈总动脉永久结扎的方法制作大鼠慢性脑缺血模型,观察慢性脑缺血对大鼠学习记忆能力㊁海马区i N O S㊁O X42表达及神经元数目及给予丁苯酞干预后对上述指标的影响,探讨丁苯酞的脑保护机制㊂1㊀材料1.1㊀动物及分组㊀挑选雄性健康S D大鼠48只,清洁级,体质量(210ʃ20)g,郑州大学医学院实验动物中心供㊂实验S D大鼠在造慢性脑缺血模型前3d带回实验室㊂避免刺激,实验室温度保持21~26ħ,湿度适宜㊂自由进食水㊂随机将60只S D大鼠均分4组:正常大鼠组为A组㊁假模型组为B组㊁模型组为C组㊁丁苯酞干预组为D组,每组12只,造慢性脑缺血模型前12h禁食水㊂1.2㊀药物与试剂㊀i N O S抗体㊁O x42(MG的标志)抗体㊁S P9001试剂盒㊁D A B试剂盒购于北京中杉生物工程公司㊂多聚甲醛由天津市科密欧化学试剂有限公司提供㊂磷酸二氢钠由汕头市光华化学厂提供㊂Y型电迷宫(张家港市生物医学仪器厂)㊂采用德国L e c i a显微照像系统采集图像,应用日本奥林巴斯光学显微镜㊂丁苯酞软胶囊(恩必普,石药集团恩必普药业有限公司),规格:0.1g/丸,生产批号: H20050299㊂㊀2㊀方法2.1㊀制备模型㊀采用永久性结扎双侧颈总动脉建立慢性脑缺血大鼠模型[2]㊂采用10%水合氯醛(3 m L㊃k g-1)腹腔注射麻醉㊂造模前常规局部备皮㊁消毒,颈部正中切口,切开皮肤,切口约1.6c m,分离皮下组织,可见双侧颈总动脉伴行迷走神经,暴露双侧颈总动脉,将其与迷走神经钝性分离,将双侧颈总动脉近心端及远心端分别结扎后在结扎之间断离双侧颈总动脉,局部止血,缝合皮肤,如大鼠自然醒来说明慢性脑缺血模型成功,模型失败的大鼠等量补齐㊂假模型组大鼠除不结扎断离双侧颈总动脉外,同模型组㊂2.2㊀动物处理㊀正常大鼠组㊁假手术及模型组大鼠给予生理盐水2m L灌胃,1次/d㊂丁苯酞干预组在造模型成功后给予丁苯酞软胶囊0.2g㊃k g-1治疗12周㊂各组大鼠实验结束用10%水合氯醛350m g/ k g腹腔注射深度麻醉,从左心室加压300m L生理盐水快速灌洗㊁灌注,4%多聚甲醛溶液心内灌注固定60m i n后取脑,4%多聚甲醛液固定24h,脱水,浸蜡,石蜡包埋,制石蜡冠状切片(厚度4μm)㊂2.3㊀指标检测2.3.1㊀Y电迷宫测试:学习记忆能力测试方法采用Y电迷宫方法,将大鼠置入安静暗室内进行主动逃离学习记忆能力测试㊂Y电迷宫内有无电流刺激的安全区和有50~70V交流电的刺激区,无规则反复变换安全区和电刺激区,观察大鼠逃离电刺激区进入安全区的能力㊂以大鼠顺利到达安全区的电击次数为学习成绩,电击次数越少表明学习记忆能力强㊂2.3.2㊀免疫组织化学染色(S P法)步骤:采用二甲苯对石蜡冠状切片进行脱蜡2次,酒精脱蜡2次,蒸馏水清洗2次,柠檬酸修复液高温修复,低温维持,室温冷却㊂采用3%H2O2去离子水孵育,P B S液冲洗后滴加山羊血清封闭液,采用内源性生物素进行封闭㊂滴加一抗O X42抗体(1ʒ100稀释)4ħ过夜㊂室温复温,P B S液冲洗,滴生物素二抗工作液,P B S液冲洗后滴辣根酶液,孵育,P B S液冲洗后神经元呈蓝色剂,苏木素复染,水冲洗后混合液脱色,采用低到高浓度酒精脱水㊁封片㊂高倍镜(400ˑ)下对大鼠海马区i N O S㊁MG进行观测,阳性细胞呈现棕黄色染色改变,采集图像,分析阳性区平均积分光密度值㊂2.3.3㊀尼氏染色方法:石蜡冠状切片先脱蜡,采用1%甲苯胺蓝在室温10m i n后90%乙醇脱色30s,无水乙醇脱水,二甲苯透明,最后中性树胶封片,神经元呈蓝色为尼氏染色阳性细胞,高倍镜(400ˑ)下观测计数海马区神经元阳性细胞㊂2.4㊀统计学方法㊀采用S P S S16.0统计软件对数据进行分析,计量资料应用均数ʃ标准差(xʃs)表示㊂均数比较采用t检验,多组间均数比较选择单因素方差分析(A N O V A),以P<0.05为差异有统计学意义㊂3㊀结果3.1㊀大鼠Y电迷宫测试㊀A㊁B组大鼠精神正常,反应灵敏,电迷宫训练达标次数正常㊂C㊁D组大鼠表现为精神差,萎靡不振,反应迟钝,电迷宫训练达标次数明显多于A㊁B组(P<0.01)㊂D组大鼠电迷宫训练达标次数明显少于C组(P<0.01)㊂见表1㊂3.2㊀大鼠海马区i N O S、O X42的表达㊀A㊁B组大鼠海马区i N O S有表达不明显,C㊁D组大鼠海马区㊃2711㊃中国实用神经疾病杂志2018年6月第21卷第11期㊀C h i n e s e J o u r n a l o f P r a c t i c a lN e r v o u sD i s e a s e s J u n.2018,V o l.21N o.11i N O S 表达明显增多,多于A ㊁B 组(P <0.01)㊂D 组大鼠海马区i N O S 表达较C 组明显下降(P <0.01)㊂A ㊁B 组大鼠海马区O X 42有表达不明显,C ㊁D 组大鼠海马区O X 42表达增多,明显高于A ㊁B 组(P <0.01)㊂D 组大鼠海马区O X 42表达较C 组明显下降(P <0.01)㊂见表2㊂表1㊀4组大鼠Y 电迷宫测试㊀(x ʃs ,n =12)组别剂量(g ㊃k g -1)训练次数A 组-30.79ʃ3.21B 组-31.01ʃ2.07C 组-72.19ʃ3.541)D 组0.248.76ʃ2.371),2)㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀注:与A ㊁B 相比,1)P <0.01;与C 组相比,2)P <0.01表2㊀4组大鼠海马区i N O S ㊁O X 42表达㊀(x ʃs ,n =12)组别剂量(g ㊃k g -1)i N O S O X 42A 组-82.23ʃ4.5890.28ʃ3.07B 组-86.52ʃ3.6492.13ʃ1.26C 组-149.21ʃ2.571)152.03ʃ3.241)D 组0.2110.42ʃ3.461)2)121.39ʃ2.561)2)㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀注:与A ㊁B 相比,1)P <0.01;与C 组相比,2)P <0.013.3㊀大鼠海马区神经元计数㊀A ㊁B 组大鼠海马区经尼氏染色呈阳性神经元计数(70.89ʃ4.28个),如图1㊁2所示㊂C 组大鼠海马区经尼氏染色呈阳性神经元计数(19.17ʃ3.04个),如图3所示㊂D 组大鼠海马区经尼氏染色呈阳性神经元计数(38.12ʃ4.11个),如图4所示㊂C ㊁D 组大鼠海马区神经元计数明显低于A ㊁B 组(P <0.01),D 组大鼠海马区神经元计数较C 组明显增多(P <0.01)㊂见表4㊂表3㊀4组大鼠海马区神经元尼氏染色㊀(x ʃs ,n =12,个/400倍视野)组别剂量(g ㊃k g -1)神经元数目A 组-70.89ʃ4.28B 组-70.89ʃ4.28C 组-19.17ʃ3.041)D 组0.238.12ʃ4.111)2)㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀注:与A ㊁B 相比,1)P <0.01;与C 组相比,2)P <0.01图1㊀A 组大鼠海马区神经元尼氏染色(ˑ400)㊀图2㊀B 组大鼠海马区神经元尼氏染色(ˑ400)㊃3711㊃中国实用神经疾病杂志2018年6月第21卷第11期㊀C h i n e s e J o u r n a l o f P r a c t i c a lN e r v o u sD i s e a s e s J u n .2018,V o l .21N o .11图3㊀C组大鼠海马区神经元尼氏染色(ˑ400)㊀图4㊀D组大鼠海马区神经元尼氏染色(ˑ400)4㊀讨论慢性脑缺血是慢性脑白质变性和老年性痴呆的重要病理生理因素[3],抑郁是慢性脑缺血后常见并发症,国内报道发生率20%~40%[4],国外报道发生率40%~60%[5]㊂长期慢性脑缺血抑制神经元胞浆在细胞内定向流动,降低新陈代谢,导致颅内血液和淋巴循环障碍,蛋白合成率下降,抑制神经再生等[6],慢性脑缺血导致过度炎症免疫反应加剧氧自由基生成,兴奋性氨基酸毒性作用及细胞内钙离子超载等病理损伤等过程[7-8]㊂i N O S是存在人体巨噬细胞内一种重要的合酶[9],为非钙离子依赖性,一般生理状态不表达,在慢性脑缺血损伤时,i N O S逐渐表达,主要分布在神经细胞㊁炎性细胞㊁神经胶质细胞,颅内海马部位表达最明显[10]㊂一旦诱导合成,就持续大量产生一氧化氮(N O)㊂N O具有扩张脑血管㊁调节血压及脑血流等作用,大量产生的N O与阴离子结合形成过氧化亚硝酸盐(O N O O-)和羟自由基(O H-),导致大量钠离子和氯离子转移至细胞内,发生神经细胞水肿,抑制线粒体呼吸,损伤细胞膜,诱导缺血区神经元凋亡[10-11]㊂i N O S是慢性脑缺血产生过量N O的基础,是脑慢性缺血损伤的一个重要原因㊂文献[12]报道,激活的MG是i N O S的主要来源㊂MG广泛分布在颅内,兼有神经保护和神经毒性免疫细胞,是炎症免疫的标志[13-18]㊂慢性脑缺血时MG大量激活,引起血管内皮细胞通透性增高,加重缺血区缺血缺氧,导致更多的氧自由基㊁缩血管物质生成等,使缺血坏死区范围扩大[19-22]㊂所以,抑制慢性脑缺血过程中炎症反应,抑制MG过度激活,可以减少i N O S过度表达,保护神经元,减轻慢性脑缺血损伤程度,成为临床上治疗慢性脑缺血新的治疗方法[23-28]㊂颅内海马区血流丰富,对缺血缺氧耐受力差,是慢性脑缺血最敏感区,为MG主要分布区,为临床观察慢性脑缺血的最佳部位[29-35]㊂同型半胱氨酸已成为慢性脑缺血的独立危险因素,在慢性脑缺血早期血清同型半胱氨酸水平会明显升高,与MG水平呈负相关性,补充叶酸㊁维生素B6和维生素B12可安全降低同型半胱氨酸水平[17],可以抑制MG的过度激活㊂丁苯酞是在我国第一个拥有自主知识产权治疗缺血性脑血管病的药物,已广泛应用到缺血性脑卒中的治疗中,取得良好疗效㊂丁苯酞具有明显的抗缺血㊁减少脑缺血梗死面积㊁减轻脑水肿程度,同时具有开放脑缺血区域的微循环,加速侧支循环形成㊁保护线粒体及抗血小板聚集等作用[18-22,36-40]㊂同时,丁苯酞可以降低血清C y sC水平,减轻血管内皮损伤程度[23-24,41-45],抑制兴奋性氨基酸的大量生成,减少钙离子超载及凋亡基因的大量产生等相关[25-29,46-51]㊂本研究显示,丁苯酞能明显提高大鼠的学习记忆能力,抑制海马区i N O S㊁MG的过度表达,减少神经毒性因子分泌,抑制慢性脑缺氧大鼠海马区神经细胞的过度凋亡,具有明显的脑保护作用,为临床上应用丁苯酞提供理论依据㊂本研究还存在对动脉模型观察时间短,样本量偏少,不能完全反映慢性脑缺血过程中各项指标的演变过程;另外,海马区比较弥散,故取材定位缺血区与实际缺血可能有差距等不足之处㊂5㊀参考文献[1]㊀冯慧,程秋凤,贺燕,等.脑缺血耐受过程中N O作用机制的研究进展[J].中国实用神经疾病杂志,2012, 15(17):85-86.[2]㊀王耀,赵香玉,李新娅,等.M i l i t a r i n e改善慢性脑缺血大鼠认知功能障碍及白质损伤的研究[J].药学学报, 2016,51(5):738-742.[3]㊀S H E T H SA,S A N O S S I A N N,HA 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丁苯酞对大鼠脑缺血再灌注神经元形态和BaxmRNA表达变化的影响
丁苯酞对大鼠脑缺血再灌注神经元形态和BaxmRNA表达变
化的影响
陈晓春
【期刊名称】《南昌大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2009(049)002
【摘要】目的观察丁苯酞(dl-3n-butyl phtalide,NBP)对大鼠脑缺血再灌注损伤
的保护作用.方法应用颈动脉血管引流法建立大鼠脑缺血再灌注动物模型(假手术组、模型对照组、丁苯酞治疗组各12只大鼠),采用BaxmRNA原位杂交技术,观察丁苯酞对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经元形态和BaxmRNA表达的变化.结果丁苯酞治疗组与模型对照组比较,阳性细胞平均密度减小,平均灰度值增大,组间比较有明显差异(P<0.05).结论丁苯酞对大鼠脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用.
【总页数】3页(P10-12)
【作者】陈晓春
【作者单位】河北北方学院附属第一医院神经内科,河北,张家口,075000
【正文语种】中文
【中图分类】R-332;R349.5
【相关文献】
1.大鼠局灶性脑缺血再灌注后皮质神经元微血管构筑和血脑屏障的变化及丁苯酞的保护作用❋ [J], 郑小影;赵淑敏;任建华;陈萌;孔祥玉;纪海茹;刘胜;韩莉
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达的影响 [J], 周超宁;刘宁;谷有全;李延可;薛浩
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4.脑通灵对大鼠脑缺血再灌注神经元形态和 Caspase-9mRNA表达变化的影响[J], 陈晓春
5.丁苯酞对大鼠脑缺血再灌注神经元形态和Caspase-9mRNA表达的影响 [J], 陈晓春;侯文利;刘星亮
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丁基苯酞对正常及局部脑缺血大鼠纹状体脑血流影响
丁基苯酞对正常及局部脑缺血大鼠纹状体脑血流影响阎超华 张均田 冯亦璞(中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所,北京 100050)摘要 应用氢清除法连续测定大鼠一侧纹状体脑血流量(rCB F),并观察丁基苯酞(NB P)对其影响.结果表明,NB P40或80m g・kg21ig均能显著增加大脑中动脉阻断后纹状体的rCB F(与溶剂对照组相比P<0.01),作用持续3h.此外,5-20m g・kg21ig 时,也可增加正常大鼠纹状体脑血流,各剂量组NB P 对平均动脉压均无明显影响;尼莫地平(N i m)0.5 m g・kg21i p也能明显增加纹状体脑血流,同时轻度降低动脉平均压,其增加脑血流作用与NB P5m g ・kg21的作用相当.提示NB P不仅能增加正常大鼠纹状体的脑血流,还能增加大脑中动脉阻断后纹状体的血流量,其抗脑缺血作用可能与该作用有关.关键词 丁基苯酞;尼莫地平;脑血流;氢清除法;脑缺血,局部中国图书资料分类法分类号 R971 脑血流在维持正常的脑功能方面起重要作用.当急性脑缺血时,首先表现为脑血流量减少,以致氧和葡萄糖急剧下降,使脑的一系列正常的生理生化反应受阻,引起脑功能障碍,严重时导致脑梗塞或坏死.因此寻找能有效地改善脑血流的药物极为重要.丁基苯酞(d l232n2bu tylp h thalide,NB P)具有较强的抗脑缺血作用,能够明显缩小局部脑缺血大鼠的脑梗塞面积,改善神经功能缺失[1],保护迟发性神经元损伤[2],减轻脑水肿[3],改善脑能量代谢[4],为进一步探讨其抗脑缺血作用机理,本文拟用氢清除法连续测定正常和局部脑缺血大鼠一侧纹状体脑血流,并观察丁基苯酞及尼莫地平(n i2 m odi p ine,N i m)对其影响.1 材料和方法1.1 动物 雄性W istar大鼠,体重350-450g,由中国医学科学院实验动物中心提供.1.2 试剂 NB P为浅黄色油状液体,批号911211,含量 1996205209收稿 1997207202接受97.01%.N i m,含量98%.二者均由中国医学科学院药物研究所北京协和药厂提供.1.3 仪器SXP型手术显微镜,上海医用光学仪器厂生产;62T Z2V型高频电刀,北京医用电子仪器厂生产;上海江湾1型C立体定位仪,上海医用仪器厂生产;组织气体分析仪m icro sen so r1231,AD590温度探针,770针式氢电极,美国D iam ond General 公司生产;LM S22B型二道生理记录仪,成都仪器厂生产.1.4 近端大脑中动脉阻断术[5] W istar雄性大鼠,水合三氯乙醛(350m g・kg21,i p)麻醉,侧卧位固定于手术台上,按照T am u ra等方法暴露大脑中动脉(m iddle cereb ral artery,M CA).手术显微镜下小心剌破硬脑膜,分离M CA,用针将其轻轻挑起,将电刀置双极电凝位3-4档,电凝嗅束内2mm至大脑下静脉间的一段M CA,以小块肌肉轻敷颅窗,逐层缝合伤口.随后分离大鼠一侧股动脉,动脉插管并连于二道生理记录仪以监测实验期间动脉血压变化.1.5 氢清除法测定局部脑血流[6,7] 动物俯卧固定于恒温(37℃)金属板上,将AD590温度探针插入大鼠颈部皮下以监测颅温.参照L ou is等的鼠脑立体图谱系统B确定右侧纹状体位置,用立体定位仪将770针式氢电极插入该部位以前因为0点,前2.0mm,右3.5mm,深6.0mm 作为工作电极,340参考电极插入颈背皮下,两电极导线分别连至组织气体分析仪上,极化电压为+ 600mV,待电极稳定后,给动物吸入氢气5m in,同时记录氢清除曲线,依公式rCB F=Κ(0.693 t1 2) mL・m in21・g21计算局部脑血流量(Κ为氢气在血液和脑组织中的分配系数,t1 2为氢气浓度下降50%所需时间).1.6 实验分组及用药实验动物共分8组,每组5-6只.正常动物组;NB P1,5,10和20m g・kg21i p;N i m0.5m g・21;;4080・kg 21ig .1.7 统计学处理 数据均以xθ±s 表示,给药前后差异用配对t 检验来评价.2 结果2.1 平均动脉压及颅温 实验期间颅温恒定于37.2-38.3℃,NB P 各剂量组对大鼠平均动脉压(M AB P )无明显影响,维持在12.2±0.7-13.1±0.8kPa 之间,但N i m 有轻度降低血压作用,给药后10m in M AB P 降至9.0±1.0kPa ,与给药前13.5±0.8kPa 比,差异显著(P <0.01).2.2 丁基苯酞及尼莫地平对正常大鼠纹状体血流量的影响 由表1可见:正常大鼠1m g ・kg 21NB P i p 后纹状体脑血流无明显变化(P >0.05),但5,10,20m g ・kg 21NB P i p 后10m in ,纹状体血流量明显增加,与用药前相比,分别增加了36.6%,67.1%和15.2%;NB P 10m g ・kg 21时作用最强,20m g ・kg 21时作用反弱于10m g ・kg 21组;用药后20m in时纹状体血流量仍维持在较高水平,以后随时间延长,增加幅度逐渐降低,50m in 时基本接近给药前水平;N i m 0.5m g ・kg 21,i p 具有与NB P 相似的增加纹状体血流量的作用.2.3 丁基苯酞对局部脑缺血大鼠纹状体血流量的影响 大脑中动脉阻断(m iddle cereb ral artery occlu 2si on ,M CAO )术后10m in ,分别ig 40或80m g ・kg 21NB P ,动态记录M CAO 侧纹状体的CB F ,观察NB P 对M CAO 大鼠同侧纹状体血供的改善作用(图1).在40m g ・kg 21时,M CAO 后大鼠纹状体血流量明显增加,其作用至少能维持3h ,其平均血流量为0.21±0.01mL ・m in 21・g 21,与溶剂对照组相比有显著性差异(P <0.01);而在80m g ・kg 21时,NB P 增加纹状体血流量的作用更为明显,M CAO 后3h 内的平均血流量为0.28±0.02mL ・m in 21・g 21,约为溶剂对照组的2倍多,两组相比有极显著差异(P <0.001).F ig 1. Changes i n blood f low to str i a tu m ipsila tera l to the m iddle cerebra l artery occlusion (M CAO ).d l 232n 2butylph 2thalide (NBP )w as given ig 10m in after M CAO .(○)veh icle ,(●)NBP 40m g ・kg 21,(△)NBP 80m g ・kg 21.xθ±s ,n =6. 3P <0.05, 33P <0.01, 333P <0.001,compared w ith veh iclegroup.3 讨论 本文应用氢清除技术研究NB P 对大鼠纹状体血流量的影响,发现NB P 能在不影响平均动脉压的条件下明显增加纹状体血流量,改善脑供血(与用药前相比P <0.001),并在一定剂量范围内有量效关系(≤10m g ・kg 21时),而当剂量增至20m g ・kg 21时,其增加脑血流作用反而有所减弱,这一现象可能与NB P 为消旋体有关,初步的实验表明(待Tab 1. Ti m e course of the effects of d l -3-n -butylphtha lide (NBP )or n i m od ip i ne (N i m )(ip )on rCBF i n nor ma l ra tsD rug m g ・kg 21rCB F at 0m in mL ・m in ・g 21△rCB F mL ・m in ・g 21102030 40 50(m in )NB P 10.50±0.05 -0.040±0.002-0.040±0.0070.0100±0.00250.050±0.010 0.040±0.007 50.48±0.09 0.18±0.07333 0.12±0.0333 0.12±0.03330.050±0.017 0.040±0.015 100.50±0.09 0.32±0.08333 0.18±0.03330.080±0.014330.040±0.006 0.000±0.012 200.47±0.08 0.080±0.0253 0.070±0.02230.070±0.013330.030±0.006-0.0200±0.0022N i m 0.50.48±0.060.070±0.0083 0.110±0.011330.090±0.008330.100±0.01433 0.100±0.01233rCB F :regi onal cerebral bl ood fl ow .x θ±s ,n =5-6. 3P <0.05, 33P <0.01, 333P <0.001,compared w ith 0m in (paired t test ).发表资料),l2NB P和d2NB P对中枢神经系统产生的NO具有相反作用,而NO与脑血管的舒张状态有密切关系,据此推测l2NB P和d2NB P对脑循环有不同作用,二者合用时可能会产生一定的抵消作用,尤其是在较大剂量时这种抵消作用更为明显. 脑功能的正常有赖于足量的脑血流.当局部脑血流低于0.16-0.20mL・m in21・g21时,就会引起大脑皮层电活动的改变和神经细胞功能的短期丧失,而当局部脑血流低于0.06-0.10mL・m in21・g21时,则会引起神经细胞不可逆的损伤甚至脑梗塞[8-10].我们用大鼠M CAO模型观察N PB灌胃给药的治疗作用,发现M CAO后10m in给大鼠N PB 40或80m g・kg21ig均可显著增加M CAO侧纹状体的血流量(图1),并使缺血侧CB F维持于较高水平(>0.20mL・m in21・g21),从而免于发生大脑皮层电活动异常和神经功能障碍.根据我们前期的工作[1],缩小脑梗塞面积的剂量与本实验中增加局部脑血流的剂量接近,说明大脑保护作用可能与其增加局部脑血流有关.通过比较表1和图1发现,在正常大鼠,增加局部脑血流的作用持续时间较短(约为50m in);而在M CAO大鼠,其作用持续时间较长(约3h),这可能与两方面因素有关:正常大鼠的脑血管具有很强的自身调节能力,而M CAO大鼠缺血区脑血管的自身调节功能障碍;给药途径不同.NB P增加局部脑血流的确切机理尚不清楚,根据现有资料推测NB P可能通过下列途径发挥其改善脑循环作用:减轻缺血性脑水肿,缓解水肿的星形胶质细胞突起对脑循环的压迫[3];促进血管舒张因子NO释放,扩张脑血管,增加脑血流(待发表).另外,我们还比较观察了N i m对大鼠纹状体血流量的影响.发现:0.5m g・kg21i p尼莫地平能在增加大鼠纹状体血流量的同时引起平均动脉压轻度下降,这一结果与文献[11]报道相符.有文献报道N i m能加速局灶性脑缺血动物缺血区脑水肿的形成[12],并有一定的窃流现象[13],这些特点一定程度上限制了N i m应用.与N i m相比,NB P能够减轻脑水肿,不产生窃流现象,不影响平均动脉压,可望成为一种更有效的抗脑缺血药物.4 参考文献1 刘小光,冯亦璞.丁基苯酞对局部脑缺血大鼠行为和病理改变的保护作用.药学学报,1995,30(12):896-9032 林建峰,冯亦璞.丁基苯酞对局部脑缺血大鼠神经元迟发性损伤及细胞内钙的影响.药学学报,1996,31(3): 166-1703 D eng W B,Feng YP.Effect of d l-32n2bu tylph thalide on b rain edem a in rats sub jected to focal cereb ral is2 chem ia.Ch inese M ed S ci J.(in p ress)4 冯亦璞,胡 盾,张丽英.丁基苯酞对小鼠全脑缺血的保护作用.药学学报,1995,30(10):741-7445 T am u ra A,Graham D I,M cCu lloch J,T easdale G M.Focal cereb ral ischem ia in the rat.1.D escri p ti on of techn ique and early neu ropatho logical con sequences fo l2 low ing m iddle cereb ral artery occlu si on.J Cereb B loodF lo w M etab,1981,1(1):53-606 A uk land K,Bow er BF,Berliner RW.M easu rem en t of local b lood flow w ith hydrogen gas.C irc R es,1964,14(1):164-1877 Young W.H2clearance m easu rem en t of b lood flow:a review of techn ique and po larograph ic p rinci p les.S troke,1980,11(5):522-5648 Sharb rough FW,M essick JM J r,Sundt TM J r.Co rre2 lati on of con tinuou s electroencephalogram s w ith cere2b ral b lood flow m easu rem en ts bu ring caro tid endar2terectom y.S troke,1973,4(4):674-6839 B ran ston NM,Strong A J,Symon L.Ex tracellu lar po tassium activity,evoked po ten tial and tissue b lood flow.R elati on sh i p s du ring p rogressive ischem ia in ba2 boon cereb ral co rtex.J N eu rol S ci,1977,32(2):305 -32110 M oham ed AA,Go toh O,Graham D I,O sbo rne KA, M cCu lloch J,M endelow AD.Effect of p retreatm en t w ith the calcium an tagon ist n i m odi p ine on local cere2b ral b lood flow and h istopatho logy after m iddle cere2b ral artery occlu si on.A nn N eu rol,1985,18(6):705-71111 刘小光,冯亦璞.丁基苯酞对KC I和去甲肾上腺素引起的离体大鼠尾动脉环收缩的影响.中国药理学和毒理学杂志,1996,10(2):113-11512 M oham ed AA,M cCu lloch J,M endelow AD,T easdaleG M,H arper AM.Effect of the calcium an tagon ist n i2modi p ine on local cereb ral b lood flow:relati on sh i p to arterial b lood p ressu re.J Cereb B lood F lo w M etab, 1984,4(2):206-21113 H arris RJ,B ran ston NM,Symon L,Bayhanm AA, W atson A.T he effects of a calcium an tagon ist,n i2 modi p ine,upon physi o logical respon se of the cereb ralvascu latu re and its po ssib le influence upon focal cere2b ral ischaem ia.S troke,1982,13(6):759-766Effect of d l-3-n-butylphthalide on str i atu m cerebral blood f lowi n normal and m iddle cerebral artery occlusion ratsYAN Chao2H ua, ZHAN G Jun2T ian, FEN G Y i2Pu(Institu te of M a teria M ed ica,Ch inese A cad e m y of M ed ica l S ciences,P ek ing U n ion M ed ica l Colleg e,B eij ing 100050)ABSTRACT T he p u rpo se of th is study w as to ob serve the changes in regi onal cereb ral b lood flow (rCB F)after adm in istrati on of d l232n2bu tylp h2 thalide(NB P)in no rm al o r m iddle cereb ral artery occlu si on(M CAO)rats.M icroelectrode w as i m2 p lan ted in righ t striatum of ch lo ral hydrate2anes2 thetized rats and rCB F w as m on ito red by hydrogen clearance m ethod.T he resu lts indicated that NB P cou ld m arkedly enhance the regi onal b lood flow to striatum i p isilateral to M CAO.Bo th NB P40and 80m g・kg21(ig10m in after M CAO)2treated group show ed su stained increase in regi onal b lood flow to righ t striatum(P<0.01).In additi on,NB P sign if2 ican tly increased the regi onal b lood flow to stria2 tum in no rm al rats w hen5-20m g・kg21(i p)w as u sed,and it w as reached the m ax ium effect at the do sage of10m g・kg21,bu t it had a w eaker effect at the do sage of20m g・kg21.N o changes in m ean arterial b lood p ressu re(M AB P)w as found du ring the exp eri m en ts.W hen n i m odi p ine(0.5m g・kg21) w as i p adm in istered,there w as a si m ilar i m p rove2 m en t of rCB F w ith a sligh t decline in M AB P. T hese data suggests that NB P can increase rCB F w ithou t alterati on in M AB P,and its effects on cereb ral m icrovascu latu re are likely to con tribu te to its neu rop ro tective effects.KEY WORD S d l232n2bu tylp h thalide;n i m odi p2 ine;cereb ral b lood flow;hydrogen clearance m ethod;cereb ral ischem ia,focal。
《2024年丁苯酞预处理对脑缺血再灌注海马神经元的保护作用》范文
《丁苯酞预处理对脑缺血再灌注海马神经元的保护作用》篇一一、引言脑缺血是一种常见的神经系统疾病，其发病机制复杂，对海马神经元造成的损伤尤为严重。
再灌注治疗虽然能在一定程度上恢复缺血区的血液供应，但同时可能伴随的再灌注损伤也是不可忽视的问题。
近年来，丁苯酞作为一种具有广泛生物活性的药物，被认为在预防和治疗脑缺血中具有重要作用。
本文旨在探讨丁苯酞预处理对脑缺血再灌注海马神经元的保护作用及其潜在机制。
二、材料与方法1. 材料本实验所使用的材料包括丁苯酞、海马神经元细胞系、培养基等。
所有试剂均购自正规渠道，确保质量可靠。
2. 方法采用体外培养的海马神经元作为研究对象，将细胞分为实验组和对照组。
实验组在脑缺血模型建立前，先进行丁苯酞预处理。
然后，建立脑缺血再灌注模型，观察并记录各组细胞的形态变化及生存率。
同时，通过分子生物学技术检测相关指标的表达情况。
三、实验结果1. 细胞形态及生存率实验结果显示，经过丁苯酞预处理的实验组细胞在脑缺血再灌注后，其形态较对照组更为完整，细胞生存率明显高于对照组。
这表明丁苯酞预处理对海马神经元具有一定的保护作用。
2. 分子生物学指标检测通过分子生物学技术检测发现，实验组细胞在脑缺血再灌注后，相关凋亡基因的表达水平较低，而抗凋亡基因的表达水平较高。
这表明丁苯酞预处理可能通过调节凋亡基因的表达来保护海马神经元。
四、讨论丁苯酞作为一种具有广泛生物活性的药物，其预处理在脑缺血再灌注过程中对海马神经元具有一定的保护作用。
这可能与丁苯酞能够调节凋亡基因的表达，降低细胞凋亡有关。
此外，丁苯酞还可能通过其他途径发挥保护作用，如抗氧化、抗炎等。
然而，具体的作用机制还需进一步研究。
五、结论本研究表明，丁苯酞预处理对脑缺血再灌注海马神经元具有保护作用。
这为临床治疗脑缺血提供了新的思路和方法。
然而，仍需进一步研究丁苯酞的作用机制及最佳用药方案，以期为临床治疗提供更多依据。
同时，我们也应关注其他具有类似保护作用的药物或治疗方法的研究，以期为脑缺血的治疗提供更多选择。
丁基苯酞对慢性脑缺血大鼠海马中p-CREB、CREB mRNA表达的影响
丁基苯酞对慢性脑缺血大鼠海马中p-CREB、CREB mRNA表达的影响康康;滕军放;王书霞;邓文静【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2008(48)42【摘要】采用手术结扎大鼠双侧颈总动脉制作慢性脑缺血大鼠模型,将大鼠随机分成对照组(A组)、单纯缺血组(B组)、缺血低剂量治疗组(C组)、高剂量治疗组(D).采用免疫组化法检测各组大鼠海马中p-CREB的含量,RT-PCR方法检测海马组织中CREB mRNA的表达.结果 B组海马CREB mRNA、p-CREB蛋白的表达较A组显著减少;C、D组较B组显著增高,D组增高更为明显(P<0.05).认为丁基苯酞可能通过增加海马p-CREB、CREB mRNA的表达,对慢性脑缺血损伤起保护作用.【总页数】2页(P28-29)【作者】康康;滕军放;王书霞;邓文静【作者单位】信阳市中心医院,河南信阳,464000;郑州大学第一附属医院;信阳市中心医院,河南信阳,464000;信阳市中心医院,河南信阳,464000【正文语种】中文【中图分类】R743.3【相关文献】1.慢性应激对大鼠海马神经元PKA和P-CREB蛋白表达的影响及抗抑郁剂的拮抗作用 [J], 王哲;胡随瑜;雷德亮;宋炜熙2.丁基苯酞对慢性脑缺血大鼠海马区NO表达的影响 [J], 陈静;杜业亮;李增芬3.丁基苯酞对慢性脑缺血老龄大鼠海马中NMDA受体亚单位NR2B及突触素表达的影响 [J], 郭铁;沈瑞乐;吴艳芝;滕军放4.丁基苯酞对慢性脑缺血老龄大鼠海马胆碱乙酰基转移酶mRNA表达的影响 [J], 沈瑞乐;王兴萍;滕军放;卢宏;王凯娟5.丁基苯酞对慢性脑缺血大鼠海马Chat蛋白表达的影响 [J], 沈瑞乐;王兴萍;滕军放;卢宏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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3通讯作者丁基苯酞对慢性脑缺血大鼠海马中p 2CRE B 、CRE B mRNA 表达的影响康 康1,滕军放23,王书霞1,邓文静1(1信阳市中心医院,河南信阳464000;2郑州大学第一附属医院) [摘要] 采用手术结扎大鼠双侧颈总动脉制作慢性脑缺血大鼠模型,将大鼠随机分成对照组(A 组)、单纯缺血组(B 组)、缺血低剂量治疗组(C 组)、缺血高剂量治疗组(D )。
采用免疫组化法检测各组大鼠海马中p 2CRE B 的含量,RT 2PCR 方法检测海马组织中CRE B mRNA 的表达。
结果B 组海马CRE B mRNA 、p 2CRE B 蛋白的表达较A 组显著减少;C 、D 组较B 组显著增高,D 组增高更为明显(P <0.05)。
认为丁基苯酞可能通过增加海马p 2CRE B 、CRE B mRNA 的表达,对慢性脑缺血损伤起保护作用。
[关键词] 脑缺血,慢性;环腺苷酸反应元件结合蛋白;丁基苯酞;海马[中图分类号] R743.3 [文献标识码] B [文章编号] 10022266X (2008)4220028202 环腺苷酸反应元件结合蛋白(CRE B )是细胞内环腺苷酸(c AMP )变化的转录转导因子,具有调节基因转录和蛋白质的合成的作用。
磷酸化CRE B (p 2CRE B )是CRE B 的活性状态。
近年研究表明,p 2CREB 在缺血性脑损伤中对神经元有重要的保护作用[1]。
丁基苯酞(NBP )是从芹菜籽中提取的左旋体,经人工合成为消旋体,是治疗脑缺血的新药。
目前关于NBP 治疗急性脑缺血的研究较多,治疗慢性脑缺血的研究较少。
2006年7月～2007年7月,我们对慢性脑缺血大鼠海马中p 2CREB 和CREB mR 2NA 的表达情况进行检测,进一步观察NBP 对其表达的影响,探讨NBP 治疗慢性脑缺血的分子机制。
1 材料与方法1.1 动物与试剂 健康W istar 大鼠80只,雌雄不拘,12～14月龄,体质量450～550g,由郑州大学实验动物中心提供。
p 2CRE B 为兔抗大鼠多克隆抗体(北京博奥森公司),SP 免疫组化试剂盒、DAB 显色试剂盒(北京中杉试剂公司);柱式Triz ol 总RNA 抽提试剂盒(上海生物工程公司)。
1.2 方法1.2.1 慢性脑缺血模型的制作 采用永久性结扎双侧颈总动脉制作慢性脑缺血模型。
将大鼠随机分成假手术组(A 组)、单纯缺血组(B 组)、缺血低剂量治疗组(C 组)、缺血高剂量治疗组(D 组)各20只。
模型成功标准:大鼠在继续饲养过程中,行动活泼,正常吃食饮水,眼部无分泌物,毛色光洁,体质量增加。
排除实验期间死亡的大鼠。
造模2个月后,A 、B 组每日给予花生油2m l,C 、D 组每日分别给予60、120mg/kg NBP (用花生油稀释至2m l )灌胃,连续1个月。
1.2.2 标本采集 术后3个月,以10%水合氯醛腹腔麻醉,迅速开胸暴露心脏,用生理盐水经左心室快速冲洗,断头后取左侧脑,随后部分置入4%多聚甲醛(4℃)固定24h,常规脱水,透明,石蜡包埋,制作冠状面切片,用于免疫组化染色;部分放入超低温冰箱,用于RT 2PCR 检测。
1.2.3 检测方法 ①p 2CRE B 检测:采用免疫组化法,按试剂盒说明书操作,DAB 显色,苏木素轻度复染、脱水、透明、封片。
应用病理图文分析系统进行结果分析,计数海马CA1、CA3及DG 区p 2CRE B 阳性细胞数及检测灰度值。
②CREB mRNA 检测:采用RT 2PCR 方法,按试剂盒说明书提取海马总RNA,逆转录合成c DNA 。
根据文献报道的CREB 序列,设计合成扩增CREB c DNA 引物,扩增长度385bp 。
反应结束后,取PCR 反应液行琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析仪检测目标带的光密度OD 值。
1.2.4 统计学方法 应用SPSS13.0软件进行数据处理,结果以x ±s 表示,多组间比较采用单因素方差分析,用LS D 法进行两两比较。
P ≤0.05为有统计学差异。
2 结果2.1 免疫组化结果 A 组p 2CRE B 阳性反应物分布在海马结构的各区,以齿状回的颗粒细胞层着色最深,呈棕黄色,CA3区次之,CA1区着色最淡;p 282 山东医药2008年第48卷第42期 CREB 阳性表达主要位于胞核,但核仁淡染,胞质及突起未见着色。
B 组海马p 2CREB 阳性细胞数较A 组显著减少。
C 、D 组阳性细胞数较B 组增多,且D 组多于C 组(P <0.05,<0.01)。
各组大鼠海马不同区域p 2CREB 灰度值比较见表1。
表1 各组大鼠海马不同区域p 2CREB灰度值比较(x ±s )组别nCA1CA3齿状回A 组13126.31±10.17128.77±10.06138.08±9.33B 组11103.00±12.873111.00±7.893111.27±10.233C 组10113.00±10.96△119.80±9.26△122.40±12.08△D 组11122.55±5.80△▲125.45±11.05△▲131.91±9.25△▲ 注:与A 组比较,3P <0.05;与B 组比较,△P <0.05;与C 组比较,▲P <0.052.2 RT 2PCR 结果 各组大鼠脑海马区CREB mR 2NA 的光密度OD 值分别为:A 组0.72±0.08,B 组0.32±0.10,C 组0.48±0.11,D 组0.62±0.15。
B组较A 组显著降低,C 、D 组较B 组显著增加,且D组较C 组显著增加(P 均<0.05)。
见图1。
D C B A图1 CREB m RNA 在大鼠海马组织中的表达 注:A 为对照组,B 为缺血组,C 为低剂量治疗组,D 为高剂量治疗组3 讨论CRE B 位于胞核内,是DNA 结合转录因子家族中的一员,由341个氨基酸残基组成,分子量43k D 。
CREB 的分子结构分为两个区域,N 2端区域与调节转录的功能有关,C 2端区域是与启动子相结合的部位。
CREB 发挥转录激活作用依赖于其133位丝氨酸磷酸化成为p 2CRE B 。
多种激酶均可激活CREB ,使其磷酸化,发生结构改变,由无活性型转变为活性型,然后与相应的基因转录元件结合,调节多种基因的表达,参与脑缺血损伤的内源性保护机制。
CREB 在中枢神经系统应激损伤后,不仅调节着早期基因如c 2f os 、c 2jun 的表达,而且调节着神经营养因子(BDNF 、NGF 等)及诱导基因转录、抗凋亡及保护性蛋白的表达(如bcl 22、CGRP 等),通过表达上述蛋白在组织细胞修复、再生中起重要作用[2]。
缺血性脑损伤的病理机制非常复杂,有多个病理环节参与,是一个多基因和多靶点参与的过程。
吕佩源等[3]发现,脑组织缺血模型小鼠海马组织神经细胞内Ca 2+过高,过高的Ca 2+一方面抑制腺苷酸环化酶的活性,另一方面激活磷酸二酯酶(P DE ),导致细胞内c AMP 水平降低。
c AMP 含量下降使蛋白激酶A 激活减少,CRE B 的磷酸化受抑制,从而影响CREB 与c AMP 反应元件(CRE )结合,妨碍CRE 对下游基因的转录启动[4]。
NBP 是抗脑缺血新药物,具有良好的抗脑缺血活性,同时可通过抑制神经细胞内钙库释放、抑制NMDA 受体激活来降低Ca 2+,也可能包括对能量状态的改善作用[5],继而调整后续c AMP →PK A →CREB →CRE 一系列机制。
本研究发现,慢性脑缺血后大鼠海马CREB mRNA 表达水平下调,海马各区p 2CREB 蛋白表达下降,而给予NBP 后p 2CRE B 、CREB mRNA 表达均显著提高,且高剂量组高于低剂量组。
综上所述,NBP 可能通过降低海马神经细胞内Ca 2+浓度,从而增加神经元内的c AMP,致使CRE B磷酸化而被激活,调节多种基因的表达,进而发挥其在慢性脑缺血损伤时对神经元的保护作用。
[参考文献][1]Nakaji m a T,I w abuchi S,M iyazaki H,et al .Relati onshi p bet w eenthe activati on of cyclic AMP res ponsive element binding p r otein and ische m ic t olerance in the penumbra regi on of rat cerebral cortex[J ].Neur osci Lett Oct,2002,331(1):13216.[2]Finkbeiner S .Calcium regulati on of the brain 2derived neur otr ophicfact or gene[J ].CellMol L ife Sci,2000,57(3):3942401.[3]吕佩源,王伟斌,尹昱.双氢麦角毒碱对血管性痴呆小鼠海马神经细胞Ca 2+的影响[J ].基础医学与临床,2004,24(2):2222223.[4]Nagakura A,Takagi N,Takeo S .I m pair ment of cerebral cAMP 2me 2diated signal transducti on system and of s patialme mory functi on after m icr os phere e mbolis m in rats[J ].Neur oscience,2002,113(3):5192528.[5]熊杰,冯亦璞.丁基苯酞对低糖低氧引起的神经细胞内钙升高的作用[J ].药学学报,1999,34(12):8932897.(收稿日期:2008209221)92 山东医药2008年第48卷第42期 。