微生物限度检查法及其方法学验证
《中国药典》微生物限度检查法及其方法学验证
微生 物 限 度 检 查 法 是 检 查 非 规 定 灭 菌 制 剂 及 其 原 、 料 受 微 生 物 污染 程 度 的 方 法 ， 查 项 目包 括 细 菌 辅 检 数 、 菌 数 、 母 菌数 及 控 制菌 检查 。与 《 国药 典 》 霉 酵 中
２０ ０ ０年 版 （ 下 简 称 ２ ０ 以 ０ ０版 ） 比 ，０ ５版 微 生 物 限 度 相 ２０ 检 查 法 在 以 下 几 方 面 进 行 了增 修 订 。 １ 标准的制订原则 ：
２ 标 准的分类 ：
微 生物 试 验 的 结 果 易 受 试 验 条 件 的 影 响 ， 别 是 特
药 品 中 含 有 对 微 生 物 生 长 有 抑 制 作 用 组 分 时 表 现 较 为 突 出。 因 此 ， 进 行 微 生 物 限 度 检 查 时 ， 保 证 在 检 验 在 应 条 件 下 的样 品 浓 度 不 足 以抑 制 污 染 微 生 物 的 生 长 ， 以 保 证结 果 的 准 确 性 。所 以 任何 产 品 的 微 生 物 限 度 检 查 法 均需 验 证 ， 认 所 采 用 的 方 法 适 合 于 样 品 的 微 生 物 确 限 度 检 查 ， 可 使 用 。为 此 ，０５年 版 ＜ 国药 典》 录 方 ２０ 中 附
维普资讯
２ ０ 年 ６月 ０８
《 国 药 典 》 生 物 限 度 检 查 法 及 其 方 法 学 验 证 中 做
６ ５
《 国药 典》 生 物 限度 检 查 法及 其 方 法 学 验 证 中 微
肖庆 青
（ 西 省 医药 学 校 江西 南 昌 ３００ ） 江 ３２０
中 的微 生 物 限 度 Fra bibliotek 查 法 增 加 了方 法 验 证 试 验 的要 求 。
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋
白胨溶液30 ml溶解后，过滤。
7.活菌计数
活菌计数结果见表1。
10－4稀释
10－5稀释
10－7稀释
试验次数
1
2
1
21Βιβλιοθήκη 2金黄色葡萄球菌56
60
枯草芽孢杆菌
77
79
白色念珠菌
86
70
黑曲霉菌
80
76
铜绿假单胞菌
47
50
方法验证
直接接种法：取样品12支，分别接种8支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌液（30-100个/ml），置规定温度培养3-5天，逐日观察结果。
仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，全封闭无菌试验过滤培养器（批号20050105）北京牛牛基因有限公司。
01
方法：中国药典2005年版无菌检查的验证实验
02
操作方法 菌液制备： 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中, 生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中, 32.5±2.5℃培养18～24小时；
培养：硫乙醇酸盐流体培养基桶30-35℃培养；真菌培养基桶23-28℃培养。观察结果。
结果 细菌和真菌数计数结果分别见表1和表2。
表1 细菌数计数 表2 真菌数计数结果
*
菌 种
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
铜绿假单胞菌
生孢梭菌
计数(CFU)
22
26
36
39
62
66
58
54
45、 23
128、108
版药典微生物限度检查方法验证方案
版药典微生物限度检查方法验证方案验证微生物限度检查方法的方案一、实验目的：验证药典中的微生物限度检查方法的准确性、可靠性和可行性。
二、实验材料：1.药典中规定的微生物限度检查方法；2.待验证的药品样品；3.适用的培养基和培养条件；4.培养基的质量控制菌种。
三、实验步骤：1.制备适用的培养基：按照药典中规定的方法和成分制备适用的培养基，并进行批次记录。
2.准备质量控制菌种：3.制备菌液悬液：从购买的质量控制菌种中，挑取一株菌种进行连续传代培养至活性最佳的生长阶段。
然后制备菌液悬液，以备后续试验使用。
4.扩大悬液应用范围：从第3步得到的菌液悬液中，取适量接种于适用培养基上，培养出代表性的细菌菌液悬液。
然后，通过菌液的光学检测、显微镜检查和菌落计数，确定菌液的细菌浓度。
5.验证方法的准确性：将待验证的药品样品加入培养基，根据药典中的方法将培养基分成不少于3组。
每组培养基中分别加入一定量的菌液悬液，并在药典规定的温度和时间下培养。
同时，设置对照组，只加入菌液悬液和培养基。
6.菌落计数：取适量的培养基样品，分别进行菌落计数，并根据培养基的数量、培养基总菌落数、对照组的菌落数等数据，计算菌落形成单位。
7.验证方法的可靠性：将待验证的药品样品按照药典中的方法进行连续验证，至少重复3次。
然后，对比不同验证结果的一致性和稳定性，评估方法的可靠性。
8.验证方法的可行性：根据实际的样品情况和验证结果，评估方法在操作上和技术上的可行性。
如，是否存在样品的特殊要求，检测方法是否能满足检测要求等。
四、数据处理与分析：根据实验结果的菌落计数和验证的次数，进行数据处理和统计分析。
评估验证结果的一致性、可靠性和可行性。
五、结论：根据实验结果和数据分析，得出关于药典中微生物限度检查方法的准确性、可靠性和可行性的结论。
如果验证结果与药典一致，说明方法可靠并可以使用。
如果验证结果与药典不一致，需要进一步分析原因和进行修正或优化。
微生物限度方法学验证
微生物限度方法学验证
微生物限度方法学验证是一种用于确定化妆品和药品中微生物污染水平的方法。
这种验证方法用于确定产品是否符合微生物限度规定，并确保产品的安全性和质量。
微生物限度方法学验证的步骤包括：
1. 根据相关规定选择适当的微生物限度测试项目。
常见的微生物测试项目包括总生菌数、霉菌和酵母菌、大肠菌群等。
2. 准备适当的培养基和培养条件，以促使微生物在培养基上生长。
3. 从样品中获取适当的微生物培养物。
样品可以是产品中的一部分或整个产品。
4. 在适当的培养基上接种微生物培养物。
5. 在适当的环境条件下孵育培养基，以促进微生物生长。
6. 定期检查培养基的生长情况，包括观察菌落形态和计数菌落数量。
7. 将菌落转移到适当的检测方法中，如涂抹法、膜过滤法等。
8. 使用适当的培养基和培养条件，在适当的温度和pH条件下，观察和计算培养基上的微生物生长数量。
9. 比较结果与规定的微生物限度标准，确定产品是否符合要求。
微生物限度方法学验证可以帮助制药和化妆品行业确保产品的微生物质量，并确保产品在使用过程中不会对消费者的健康有害。
这种验证方法需要严格的实验室操作和合理的测试标准，以确保结果的准确性和可靠性。
微生物限度方法学验证PPT课件
养基上， 23～28℃培养5～7天，加3～5ml0.9％无菌氯 化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取 1ml菌液加0.9％ 无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-
4～ 10-6，使菌数约为50～100cfu/ml。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
菌液组：测定所加的试验菌数。 平皿法：取试验用的1ml菌液（约50～100cfu），分别注 入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，按平皿法测定其菌落数。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定 供试品本底菌数。（和试验组采用同法）
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌 计数所规定的方法及要求进行。对各试验菌的回收率 应逐一进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行 试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌计数验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯 草芽孢杆菌。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化，中和、 离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组， 以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时， 可用相应的稀释剂替代供试品，加入试验菌，使最终菌 浓度为每1ml 供试液含50～100cfu，按试验组的供试液 制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
样品稀释级的选择：最低稀释级，1g或1ml。
培养基：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁培养基、 营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
无菌、微生物限度检查及方法验证
01
02
03
直接接种法
将样品接种在培养基上， 观察是否有微生物生长。
薄膜过滤法
将样品通过薄膜过滤，收 集滤膜上的微生物，再进 行培养。
离心沉淀法
将样品离心，收集沉淀物 中的微生物，再进行培养 。
无菌检查的注意事项
确保环境洁净
无菌检查需要在洁净的环境中进行，以避免 外界微生物的污染。
避免样品中防腐剂的影响
方法验证
方法验证的定义与目的
定义
方法验证是对检测方法的可靠性、准确性和可重复性的评估过程，以确保该方 法能够满足预期的检测要求。
目的
方法验证的目的是确保所采用的无菌、微生物限度检查方法具有足够的灵敏度 、特异性、重现性和可操作性，以保证检测结果的准确性和可靠性。
方法验证的流程
准备验证计划
制定详细的验证计划，包括验 证实验的设计、实验步骤、数 据收集和分析等内容。
进出口检验
进出口药品需要进行严格的微生物限度检查，以确保药品符合进口 国或地区的质量标准，保障公众健康。
方法验证在药品质量控制中的应用
验证无菌、微生物限度检查方法的可靠性
通过方法验证可以确保无菌、微生物限度检查方法的准确性和可靠性，提高药品质量控制 水平。
评估检测方法的性能指标
方法验证过程中需要对检测方法的性能指标进行评估，如灵敏度、特异性、重现性等，以 确保检测结果的准确性和可靠性。
如果样品中含有防腐剂，可能会抑制微生物 的生长，因此需要进行相应的处理。
正确选择培养基
根据待测样品的特性，选择适合的培养基， 以确保微生物能够正常生长。
定期进行方法验证
无菌检查方法需要定期进行验证，以确保其 可靠性。
0义与目的
天宝归真液微生物限度检查试验及方法学验证资料
锰胥 龟起止 R期： 2010 6之010 08 l 微生物限度检查法 取天宝归真液3支( 规格：l Oml ) 。共取l Oml 供试品， 至90ml PH7．0 氯化钠一蛋111 胨缓冲液中，
组尉
表l 批号：10042514
细菌cf u／m1
霉菌r f u／ml
金黄 色 柏 大肠 壤 枯草芽 白色 念 黑曲
参考 文献
『11栾东晓， 邱丽：泰雅英．天宝归真液 的薄层色谱 鉴别f J l 黑龙江医药，1996- ．02- 15．
中困新技术新产品
一1一
微生物限度检查法进行了方法学验证，验证结果
组别
酋 液组 试 验组 试验维的茧 回收睾％ 稀释觏对照组 稀释 刺q照 组 的苗回收睾％
细 菌cf u／I
金黄色葡 萄 辟苗
68
大 肠壤 希蕾 53
62
48
9l
90
59
5I
86
96
桔 草芽 孢 杆蕾
72 75
1 04
66
92
霉亩c f u ／- 1
白 色念 球蕾
表6批号：10042534
培养基及试液
试验组
阴性 对照 组
MUG
+
靛摹 质
+
EMB甲板
，一 典型 44102菌落 形态 无菌 落生 长
人相应的阳性试验菌菌液l ml ．立即倾注玫瑰红 钠琼 脂培养 基． 置相应 温度培 养，每 株试 验菌平 行 制备二个平皿， 测定其荫数。
菌液组：取稀释好的相应菌液l ml 。方法同试 验组 。分别 加入 平皿中 ，加入 相应培 养基 ，置相 应 温度培养 ，测定所加的试验 菌数。
静
62
微生物限度检查法及其方法学验证综述
１ ９ ｚ Ｈ一 ） ８ ６ ８ （ Ｈ ， Ｊ ８ １ ， ５ 、 ． ９ （ Ｈ ， ｄ ． Ｈ ， ２ 、 ． Ｏ １ ｄ， 一 ． Ｈｚ Ｈ－ ） ８ ６ ７ １ ｄ ，
ｂ ｎｙ ｕｙ ｌ ｔｎ 。化 合 物 Ⅲ为 该 植 物 中首 次 分 离 得 到 。 ｅｚ１ ｔｏａ ｏ ｅ ）ｂ ｅ
化 合 物 Ⅳ 棕 黄 色 粉 末 。［ ］ －８ ８ Ｃ Ｏ ２ Ｃ ｌ） ａ Ｄ５１． （ ＝ ． ， ＨＣａ 。 ２ Ｆ Ｃ３ 应 呈 阳性 。Ｅ Ｉ ｅ１反 Ｓ－ ＭＳ（ｏ ｉｖ ） ｚ４ ９ Ｍ＋ Ｎ ］ 推 ｐ ｓ ｉ ｍ／ ：０ ［ ｔｅ ａ ，
（ ３ 、 １ ７ ４ （ － ） ８ １ ． （ － ）、 １ ０ ６ ｃ ６ ８ ７ ９ Ｃ－ ） Ｃ－ ） ８ ４ ． Ｃ ４ 、 １ ６ ６ Ｃ ５ ８ ２ ． （ ． ）、 ７ ． （ ７ 、
ｐｉｃｓＪ ． ｈ ｔｅ ｅ ｓｒ ，０ ３ ６ ：０— １． ｒ ｅ［＇ Ｐ ｙｏｈ ｍｉｔｙ２ ０ ，２ ８ ５８ １ ｎ ］
ｏ ｔａ ｙ ｒ ｄ ｂ ｎ ｏ ｙ １ ｏ ｔ ｎ ｇｎ ｎｓ ａ ｄ ｐ ｒ ｄ ｅ ｏ ｅ ｆＴｅ ｒ ｈ ｄ ｏ ｜ ｅ ｚ ｃ ｃｏ ｃ ｅ ｅ Ｌｉ ａ ｎ Ｓ ｉｏ ｉ ｎ ｎ ｓ ｂｙ Ｈ ｙ ｅ ｖ ｌ ｎ Ｉ ｄ ｎ Ｏｘ ｄ ｔｏ ｏ Ｐｈ ｎ ｉ Ｄｉ ｅ ｚ ｌ ｕ ｙ ｏ ａ — ｐ ｒ ａｅ ｔ ｏ ｉｅ ｉａ ｉｎ ｆ ｅ ｏｌ ｃ ｂ ｎ ｙｂ ｔ ｒ ｌｅ
７）８ ２． （ 一 、６． （ － 。 上 述 核 磁 数 据 与 异 美 商 陆 酚 、１８ ５Ｃ ８）８ ４ Ｏ Ｃ ９） （ｏｎ ｒａｏ ｉ ａｍｅｉ ｎ ｎＡ）进 行 对 比 ［］ 本 一 致 ， 鉴 定 为 ｉ ａ — ｓ ｃ １基 故 ｓ ｎ ｏ ｍｅｉ ｎ ｎＡ。 化合 物 Ｖ为 该 属 植 物 中 首 次 分 离 得 到 。 ｒ ａｏ ｃ
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查法验证方案文件编号：起草人：起草日期：_________ 审核人：审核日期：_________ 批准人：批准日期：_________********有限公司****有限公司文件编号：FA-YZ-微生物限度检查法验证方案1．概述药典微生物限度检查法中要求在建立药品的微生物限度检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于微生物限度检查。
所以对******微生物限度检查进行方法的验证。
2．目的为了保证检验质量，对所用的检验方法必须经过验证，才能确保检验结果的准确可靠。
3．适用范围本方案适用于****微生物方法学的确认与验证。
4．验证人员职责4.1．验证小组:组长：质量管理部经理成员：QC主管、微生物操作人员4.2．职责及分工：QC主管组织起草该验证方案，并组织实施该方案；微生物操作人员具体实施该方案；质量管理部经理协助和监控该方案的实施。
4.3．验证方案批准后，应进行培训。
由验证小组指定人员负责对小组成员及和验证有关的人员进行培训。
5．验证依据中国药典2015年版通则“1105”、“1106”6.****生物限度检验方法验证风险分析6.1 结果分析：通过以上采取的措施，风险均控制在可接受范围内。
7. 人员培训确认表8.验证方法6.1验证用样品： ****** 规格： 批号：****** 规格： 批号： ****** 规格： 批号：6.2． 验证用培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基 生产厂家： 批号： 配制批号： 沙氏葡萄糖琼脂培养基 生产厂家：批号： 配制批号： 营养琼脂培养基 生产厂家： 批号： 配制批号： 胰酪大豆胨液体培养基 生产厂家： 批号： 配制批号： 沙氏葡萄糖琼脂培养基 生产厂家： 批号 ： 配制批号：麦康凯液体培养基生产厂家：批号：配制批号：麦康凯琼脂培养基生产厂家：批号：配制批号：6.3验证用菌种:金黄色葡萄球菌（CMCC(B)26 003）、大肠埃希菌（CMCC(B)44 102）、枯草芽孢菌（CMCC(B)63 501）、白色念珠菌（CMCC(F)98 001）、黑曲霉菌（CMCC(F)98 003）6.4菌液制备：6.4.4取经30℃~35℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草芽孢杆菌营养肉汤液体培养物1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－5～10－7为不大于100cfu/ml 备用。
无菌微生物限度检查及方法验证.ppt
• 实验人员进入洁净室（无菌室）不得化妆、戴手表、戒指等首饰；不得 吃东西。应严格按更衣程序更衣。
• 记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微 生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将 报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌 室前，至少开启机房运转1小时以上。
菌种的传代和保藏
菌种的保藏方法
• 使菌种的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，从而在一定时间内 不发生变异并保持生命活力。
• 一般来说，低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的三个 重要因素
• 无论使用那种菌种保藏方法，都应进行验证，以确保在相应保存条 件下的菌种不会变异并且性能稳定。
• 菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代（GMP，药 典）
微生物实验室应制定菌种的保藏管理规程来规范菌种的来源、申购、保 管、转种传代、存储和领用等方面的要求，确保菌种的溯源性和稳定性； 防止试验用菌种因多次传代而失去典型生物学特征发生变异或死亡，保 证菌种长期正确、稳定，从而确保实验的灵敏度和重现性。
微生物实验室的质量管理
•菌种保存应有专人负责，加锁保存于冰箱中。 •实验室的标准菌株应来自CMCC（中国药品生物制品检定所医学菌种保 藏中心或ATCC（美国菌种保藏中心）等国际法定菌种保藏机构。有接 收、确认记录。 •菌种的转种等均应在超净工作台进行，以防污染。 •各种菌种应按规定时间接种，所有保藏的菌种均应贴有相应的标签，有 菌种清单。
• 培养箱、冰箱需在设备的每个腔室内放置经校准过的玻璃温度计，每天 检查设备腔室内的温度状况并且在日志上做好相应的记录。定期回顾每 个设备的温度记录数据，以考察设备的运行状态。
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微生物限度检查法及其方法学验证
摘要：本文从四个方面介绍2005版微生物限度检查法增修订内容，重点介绍细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的方法验证，提请申报单位注意在后续品种的研发和申报过程中对所采用的微生物限度检查法进行方法学验证，以增加试验方法的完整性、保证检验结果的可靠性。
关键词：微生物限度检查法方法学验证
【中图分类号】r-3【文献标识码】b【文章编号】1008-1879（2012）12-0395-01
微生物限度检查法是检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受微生物污染程度的方法，检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查，与2000版相比，2005版微生物限度检查法在以下几方面进行了增修订。
1标准的制订原则
2000版微生物限度法标准细菌数、酵母菌数和霉菌数按剂型制订，控制菌按给药途径制订。
由于同一剂型有不同的给药途径，且随着新剂型的不断出现，按剂型制订标准具有局限性。
2005版均按给药途径制订，解决了这一局限性，不会因剂型的改变而带来执行标准的混乱。
2标准的分类
分为三大类，即制剂通则项下规定；口服给药制剂；局部给药制剂，其中化学药部分（二部）包括：①制剂通则、品种各论中要求
无菌的制剂及标示无菌的制剂；②口服给药制剂、局部给药制剂：眼部给药制剂；耳、鼻及呼吸道吸入给药的制剂；阴道、尿道给药制剂；直肠给药制剂；其他局部给药制剂。
中药部分（一部）包括：①制剂通则、品种各论中要求无菌的制剂及标示无菌的制剂；②口服给药制剂：不含药材原粉的制剂；含药材原粉的制剂；含豆豉、神曲等发酵成分的制剂；③局部给药制剂：用于表皮或黏膜不完整的含药材原粉的局部给药制剂；用于表皮或黏膜完整的含药材原粉的局部给药制剂；眼部给药制剂；耳、鼻及呼吸道吸入给药的制剂；阴道、尿道给药制剂；直肠给药制剂；其他局部给药制剂。
3微生物限度检查方法的增修订
3.1明确了环境检测执行的标准和方法，洁净度要求及洁净度定期检查。
3.2检验量。
随机抽取不少于检验量（两个以上最小包装单位）的3倍；贵重、微量样品检验量可酌减；要求检查沙门菌的供试品其检验量应增加10g或10ml。
3.3供试液制备。
表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物生长和存活无影响；供试液从制备至加入检验用培养基不得过1小时；供试液体积为100ml；非水溶性供试品：增加“十四烷酸异丙酯法”；结肠溶制剂的供试品：用ph为7.6无菌磷酸盐缓冲液溶解；具抑菌活性的供试品：增加方法的可操作性。
3.4灭菌。
培养基及稀释剂采用验证合格的灭菌程序进行灭菌。
3.5稀释剂。
增加ph7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液、ph6.8无菌磷
酸盐缓冲液、ph7.6无菌磷酸盐缓冲液。
3.6细菌、霉菌及酵母菌计数。
3.7控制菌检查：新增大肠菌群检查法、梭菌检查法。
4微生物限度检查法的验证
微生物限度检查法验证的目的是确认所采用的方法是否适合于
供试品的微生物限度检查。
验证的内容包括准确性（回收率）、专属性。
验证的类型分为前验证（建立微生物限度检查法时的验证）和再验证（修订检验方法后、供试品组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时、定期的方法验证），根据检查方法的不同，又分为细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的验证。
4.1细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证。
验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率、验证菌株为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草杆菌，菌种要求不得超过5代，菌液制备为50-100cfu/ml，验证方法分试验组、菌液组、稀释剂对照组、供试品对照组。
4.2控制菌检查法的验证。
试验菌株按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。
大肠菌群检查用大肠埃希菌；梭菌检查用生孢梭菌，阴性对照菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、梭菌用大肠埃希菌；大肠埃希菌、沙门菌、大肠菌群用金黄色葡萄球菌。
菌种的要求：不得超过5代，菌液制备为10～100cfu，验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行.验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。
具体如下：
4.2.1试验组。
取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查，当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。
4.2.2阴性菌对照组。
设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性，方法同试验组检出。
4.2.3结果判断。
阴性菌对照组不得检出阴性对照菌，若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查，试验组未检出试验菌，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。
我们在审评工作中发现部分制剂本身具有抑菌或杀菌作用，如某些眼用软膏剂，某些含生物碱的中药复方制剂等，所制备的供试液本身具有影响微生物生长的作用，若不经方法学验证，难以保证所采用方法的适合该供试品的微生物限度检查，难以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
以上介绍2005版微生物限度检查法增修订内容，重点介绍细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的方法验证，提请申报单位注意在后续品种的研发和申报过程中对所采用的微生物限
度检查法进行方法学验证。