2010年版药典微生物限度检查法
中国药典 2010 年版一部附录
中国药典2010 年版一部附录附录Ⅰ A 丸剂丸剂系指饮片细粉或提取物加适宜的黏合剂或其他辅料制成的球形或类球形制剂，分为蜜丸、水蜜丸、水丸、糊丸、蜡丸和浓缩丸等类型。
蜜丸系指饮片细粉以蜂蜜为黏合剂制成的丸剂。
其中每丸重量在0.5g（含0.5g）以上的称大蜜丸，每丸重量在0.5g 以下的称小蜜丸。
水蜜丸系指饮片细粉以蜂蜜和水为黏合剂制成的丸剂。
水丸系指饮片细粉以水（或根据制法用黄酒、醋、稀药汁、糖液等）为黏合剂制成的丸剂。
糊丸系指饮片细粉以米粉、米糊或面糊等为黏合剂制成的丸剂。
蜡丸系指饮片细粉以蜂蜡为黏合剂制成的丸剂。
浓缩丸系指饮片或部分饮片提取浓缩后，与适宜的辅料或其余饮片细粉，以水、蜂蜜或蜂蜜和水为勤合剂制成的丸剂。
根据所用黏合剂的不同，分为浓缩水丸、浓缩蜜丸和浓缩水蜜丸。
丸剂在生产与贮藏期间应符合下列有关规定。
一、除另有规定外，供制丸剂用的药粉应为细粉或最细粉。
二、蜜丸所用蜂蜜须经炼制后使用，按炼蜜程度分为嫩蜜、中蜜和老蜜，制备蜜丸时可根据品种、气像等具体情况选用。
除另有规定外，用塑制法制备蜜丸时，炼蜜应雄热加入药粉中，混合均匀；处方中有树脂类、胶类及含挥发性成分的药味时，炼蜜应在60℃左右加入；用泛制法制备水蜜丸时，炼蜜应用沸水稀释后使用。
三、浓缩丸所用提取物应按制法规定，采用一定的方法提取浓缩制成。
四、除另有规定外，水蜜丸、水丸、浓缩水蜜丸和浓缩水丸均应在80℃以下干燥；含挥发性成分或淀粉较多的丸剂（包括糊丸）应在60℃以下干燥；不宜加热干燥的应采用其他适宜的方法干燥。
五、制备蜡丸所用的蜂蜡应符合本版药典该饮片项下的规定。
制备时，将蜂蜡加热熔化，待冷却至60℃左右按比例加入药粉，棍合均匀，趁热按塑制法制丸，并注意保温。
六、凡需包衣和打光的丸剂，应使用各品种制法项下规定的包衣材料进行包衣和打光。
七、丸剂外观应圆整均匀、色泽一致。
蜜丸应细腻滋润，软硬适中。
蜡丸表面应光滑无裂纹，丸内不得有蜡点和颗粒。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。
3.规范性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ J 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。
4.验证实施：4.4.1 试验前的准备:4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天内使用。
4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。
4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。
4.4.2 试验菌的制备和稀释：4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液：4.4.2.1.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中，在30～35℃培养18～24小时；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，在23～28℃培养24～48小时；取黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天。
微生物限度检查法操作规程
1.目的建立微生物限度检查法操作规程。
2.适用范围本规程适用于原辅料、包装材料、制剂（非规定灭菌）、药妆、空气洁净℃等各类微生物限度检查。
3.编制依据《中国药品检验标准操作规范》2010年版《中华人民共和药典》2010年版二部药品微生物学检验手册4.责任4.1 QC质检员对本规程的实施负责。
4.2 QC主管对本规程的有效执行承担监督检查责任。
5.正文5.1微生物限度检查系指非规定灭菌制微生物污染限度的一种检查方法，包括活菌数及控制菌的检查。
5.2药品生产洁净室（区）的空气洁净℃划分为四个级别，不同级别间微生物最大允许数、尘粒最大允许数不同。
5.3微生物限度检查室和操作人员的一般原则5.3.1检查的全部过程均应严格遵循无菌操作，防止再污染。
5.3.2进入微生物限度检查室的操作人员，面部暴露部位不得化妆；患传染病及体表有伤口人员禁止入内。
5.3.3操作人员进微生物限度检查室前应在缓冲间用规定的消毒液进行手部消毒，更衣，戴帽，戴口罩及换鞋，进入微生物限度检查室后，再用75%酒精消毒手部。
5.3.4使用净化工作台前，应先用规定的消毒液（3月轮换一次）擦工作台与各操作开关，然后开紫外灯及空气过滤器30分钟后，方可使用。
物品通过传递窗进入。
5.4培养基及供试液的制备5.4.1培养基的制备方法5.4.1.1细菌培养基：称取营养琼脂培养基34g，加1L纯化水溶解，115℃灭菌，40分钟后，备用。
5.4.1.2霉菌培养基：称取虎红琼脂培养基30g，加1L纯化水溶解，115℃灭菌，40分钟后，备用。
5.4.1.3控制菌的培养（详见中华人民共和国药典2010版二部）。
5.4.2器皿的准备：直径90ml的平皿，10ml、1ml的刻℃吸管，200ml的三角烧瓶及胶塞等，均应包扎好后，再经121℃高压蒸气灭菌30分钟。
5.4.3供试液的制备方法：5.4.3.1液体供试品：取供试品10ml，加入90ml的稀释剂中，混匀，作为供试液；5.4.3.2固体、半固体或粘稠液供试品：称取供试品10g，置pH7.0蛋白胨-氯化钠无菌缓冲溶液100ml中，混匀后，作为供试液。
中国药品检验标准操作规范2010年版22凝胶剂
凝胶剂凝胶剂（《中国药典》2010年版二部附录I U）系指药物与能形成凝胶的辅料制成均一、混悬或乳状液型的稠厚液体或半固体制剂。
除另有规定外，凝胶剂限局部用于皮肤及体腔。
凝胶剂应均匀、细腻，在常温时保持胶状，不干涸或液化；除品种项下规定的检验项目外，还应检查“装量”、“无菌”或“微生物限度”；混悬型凝胶剂还应检查“粒度”。
“装量”检查法1 简述1.1 凝胶剂系多剂量包装的制剂，除另有规定外，装量按最低装量检查法检查。
1.2 本项检查目的在于控制标示装量为500g（ml）或500g（ml）以下凝胶剂的最低装量。
2 仪器与用具2.1 天平感量0.1g（适用装量大于50g）或0.01g（适用装量小于或等于50g）。
2.2 注射器（包括注射针头）规格50ml以下，预经标化（容量包括注射针头）。
2.3 量筒（量入型）50~500ml，预经标化。
3 操作方法3.1 重量法（适用于标示装量以重量计者）3.1.1 取供试品5个（标示装量为50g以上者3个），除去外盖和标签，容器外壁用适宜的方法清洁并干燥，分别精密称定重量。
3.1.2 除去内容物，容器内壁用适宜的溶剂洗净并干燥，再分别精密称定空容器的重量，求出每个容器内容物的装量与平均装量（均取三位有效数字）。
3.2 容量法（适用于标示装量以容量计者）3.2.1 取标示装量为50ml或50ml以下的供试品5个，摇匀，小心开启容器，将内容物分别用相应体积的干燥注射器抽尽，排除空气；或取标示装量为50ml以上的供试品3个，摇匀，小心开启容器，将内容物分别倾入相应体积的干燥量筒中，并将容器倒置15min，尽量倾净。
3.2.2 读取每个容器内容物的装量，并求其平均装量（均取三位有效数字）。
3.3 复试在上述结果中，按5.3项下附表的规定，如其平均装量符合规定，但仅有一个容器内容物的装量不符合规定，应另取供试品，照3.1或3.2项下方法进行复试。
4 注意事项采用容量法检查时，所用注射器或量筒必须洁净、干燥，并经定期校正；其最大刻度值应与供试品的标示装量相一致，或不超过标示装量的2倍。
《中国药典》微生物检查法
中国药典2010年版框架(卫)
• 无菌检查法 • 微生物限度检查法 • 灭菌法
• 抑菌效力检查法指导原则 • 药品微生物检验替代方法验证指导原则 • 微生物限度检查法应用指导原则 • 药品微生物实验室规范指导原则
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2010年版微生物限度检查法修订
2010年版《中国药典》微生物限度检查法 附录XIII C（一部） 附录XI J （二部）
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2010年版微生物限度检查法修订
2、附录107页，检验量 除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；
（中药）膜剂为（50）100cm2；贵重药品、微 量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门 菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml（其中 10g或10ml用于阳性对照试验 ）。
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2010年版微生物限度检查法修订
可选用的中和剂或灭活方法 亚硫酸氢纳 稀释剂 稀释剂、甘氨酸、硫代硫酸盐 卵磷脂、聚山梨醇酯 亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐 卵磷脂 聚山梨醇酯 硫代硫酸盐 镁或钙离子 对氨基苯甲酸 ß-内酰胺酶
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2010年版微生物限度检查法修订
8、附录109页，增加： • 若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用，那么验证试验中微生物
4、附录108页，新增：贴膏剂供试品 取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃 或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料（如 无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。 然后将其置于适宜体积并含有灭活剂（如聚山梨酯80或 卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少30分钟，或以其他 方法制备成供试液。
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2010年版微生物限度检查法修订
11、附录109页，修订：菌数报告规则 • 细菌、酵母菌宜选取（细菌、酵母菌平均菌落数在30～
微生物限度检查标准操作规程
微生物限度检查标准操作规程⏹ 1. 目的：建立微生物限度检查的基本操作，为微生物检查人员提供正确的操作规程。
⏹ 2. 依据：《中华人民共和国药典》2010年版二部。
中华人民共和国卫生部《药品卫生检验方法》⏹ 3. 范围：本标准适用于QC化验室的微生物限度检查。
⏹ 4. 职责：QC微生物检验员对本标准的实施负责。
⏹ 5. 程序：⏹ 5.1. 定义：微生物限度检查法：微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
⏹ 5.2. 实验用具：⏹电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75%酒精棉球、紫外灯（365nm波长）。
⏹ 5.3. 培养基：⏹ 5.3.1. 营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、麦康凯琼脂培养基、枸橼酸盐培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基、蛋白胨水培养基、4-甲基伞形酮葡萄糖苷酸（MUG）培养基。
⏹ 5.3.2. 培养基的管理、配置应符合检定菌、培养基管理规程、培养基配置规程。
⏹ 5.4. 试液：甲基红试液、а-奈酚乙醇试液、40%氢氧化钾溶液、靛基质试液。
⏹ 5.5. 稀释剂：0.9%无菌氯化钠溶液、PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。
⏹ 5.6. 供试品溶液的制备：取供试品（供试品如为固体，置研钵中研磨成细粉）放入试管中，加入适量的稀释剂制成1：10浓度的供试品溶液。
⏹ 5.7. 对照用菌液：控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验，对照菌株为大肠杆菌[CMCC（B）44102]。
⏹ 5.8. 检查法：⏹除另有规定外，细菌的培养温度为30-35℃，霉菌的培养温度为23-28℃，控制菌的培养温度为35-37℃。
⏹ 5.8.1. 细菌、霉菌计数：⏹ 5.8.1.1. 平皿法⏹采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2～3个稀释级的供试液。
⏹取供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。
中国药典2010年版附录
化学药品质量控制按剂型分ⅠA片剂ⅠB注射剂ⅠC酊剂ⅠD栓剂ⅠE胶囊剂ⅠF软膏剂乳膏剂糊剂ⅠG眼用制剂ⅠH丸剂ⅠJ植入剂（增订）ⅠK糖浆剂ⅠL气雾剂粉雾剂喷雾剂ⅠM膜剂ⅠN颗粒剂ⅠO口服溶液剂口服混悬剂口服乳剂ⅠP散剂ⅠQ耳用制剂ⅠR鼻用制剂ⅠS洗剂冲洗剂灌肠剂ⅠT搽剂涂剂涂膜剂ⅠU凝胶剂ⅠV贴剂片剂系指药物与适宜的辅料混匀压制而成的圆片状或异形片状的固体制剂。
片剂以口服普通片为主，另有含片、舌下片、口腔贴片、咀嚼片、分散片、可溶片、泡腾片、阴道片、阴道泡腾片、缓释片、控释片与肠溶片等。
含片系指含于口腔中，药物缓慢溶解产生持久局部作用的片剂。
含片中的药物应是易溶性的，主要起局部消炎、杀菌、收敛、止痛或局部麻醉作用。
含片应进行释放度检查。
舌下片系指置于舌下能迅速溶化，药物经舌下黏膜吸收发挥全身作用的片剂。
舌下片中的药物与辅料应是易溶性的，主要适用于急症的治疗。
口腔贴片系指粘贴于口腔，经黏膜吸收后起局部或全身作用的片剂。
口腔贴片应进行溶出度或释放度检查。
咀嚼片系指于口腔中咀嚼或吮服使片剂溶化后吞服，在胃肠道中发挥作用或经胃肠道吸收发挥全身作用的片剂。
咀嚼片口感、外观均应良好，一般应选择甘露醇、山梨醇、蔗糖等水溶性辅料作填充剂和黏合剂。
咀嚼片的硬度应适宜。
分散片系指在水中能迅速崩解并均匀分散的片剂。
分散片中的药物应是难溶性的。
分散片可加水分散后口服，也可将分散片含于口中吮服或吞服。
分散片应进行溶出度检查。
可溶片系指临用前能溶解于水的非包衣片或薄膜包衣片剂。
可溶片应溶解于水中，溶液可呈轻微乳光。
可供外用、含漱等用。
泡腾片系指含有碳酸氢钠和有机酸，遇水可产生气体而呈泡腾状的片剂。
泡腾片中的药物应是易溶性的，加水产生气泡后应能溶解。
有机酸一般用枸橼酸、酒石酸、富马酸等。
阴道片与阴道泡腾片系指置于阴道内应用的片剂。
阴道片和阴道泡腾片的形状应易置于阴道内，可借助器具将阴道片送入阴道。
阴道片为普通片，在阴道内应易融化、崩解并释放药物，主要起局部消炎杀菌作用，也可给予性激素类药物。
淀粉微生物检查法记录
培养箱型号：HH·B11设定温度：
培养基配制批号：
培养时间：月日时～月日时
霉菌和酵母菌数（23~28℃培养5天）
培养箱型号：DG-1设定温度：
培养基配制批号：
培养时间：月日时～月日时
皿号
原液
10-1
10-2
10-3
阴性对照
原液
10-1
10-2
10-3
阴性对照
1
2
平均
结果
培养基名称
培养基
配制批号
培养箱
型号
设定
温度
培养时间
结果
备注
供试品
阳性
对照
阴性
对照
BL
HH·B11
MUG
HH·B11
靛基质
EMB或MacC
结果：（应不得检出）
活螨检查
取供试品直接检视，结果：□检出□未检出（应不得检出）
结论
□符合规定□需复试□不符合规定
检验人
复核人
(应不得过1000cfu/g)
(应不得过100cfu/g)
大肠埃希菌检查
方法：取1：10供试ml置5ml MUG培养基中，在30~35℃培养5-24小时后，按标准规定检查。（阳性对照管加入1ml含菌数为10—100cfu大肠埃希菌；阴性对照只加稀释液）。
微生物限度检查记录
编号：
检品名称
淀粉
批号
规格
检品编号
温度
相对湿度
检验日期
检验依据
《中国药典》2010年版二部附录《微生物限度检查法》
供试液制备：取样品10g，置100（90）mlpH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液中，混匀即得1：10的供试液。再按十倍稀释法进一步稀释成1：100、1：1000等适宜浓度的供试液，按标准规定检查（阴性对照只加稀释液1ml）。
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附录Ⅺ J 微生物限度检查法微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。
除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃。
检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。
检验量检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。
要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中10g用于阳性对照试验)。
检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。
供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。
1.液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1∶10的供试液。
油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
2.固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1∶10的供试液。
必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
3.需用特殊供试液制备方法的供试品(1)非水溶性供试品方法1取供试品5g(或5ml)，加至含溶化的(温度不超过45℃)5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1∶20的供试液。
方法2取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯(制法见附录ⅩⅢB 无菌检查法中供试品的无菌检查项下)和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。
然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1∶10的供试液。
(2)膜剂供试品取供试品100cm2，剪碎，加100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(必要时可增加稀释液)，浸泡，振摇，作为1∶10的供试液。
(3)肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品10g，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂)至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1∶10的供试液。
(4)气雾剂、喷雾剂供试品取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。
用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80)中，混匀，取相当于10g或10ml 的供试品，再稀释成1∶10的供试液。
(5)贴剂供试品取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。
用适宜的无菌多孔材料(如无菌纱布)覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。
然后将其置于适宜体积并含有表面活性剂(如聚山梨酯80或卵磷脂)的稀释剂中，用力振荡至少30分钟，制成供试液。
贴剂也可以其他适宜的方法制备成供试液。
(6)具抑菌活性的供试品当供试品有抑菌活性时，采用下列方法进行处理，以消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。
常用的方法如下。
①培养基稀释法取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。
测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml，每1ml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。
每1ml供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1ml的菌落数，计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。
②离心沉淀法取一定量的供试液，500转/分离心3分钟，取全部上清液混合，用于细菌检查。
③薄膜过滤法见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。
④中和法凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。
中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。
细菌、霉菌及酵母菌计数计数培养基的适用性检查细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。
菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代)。
试验用菌种应采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC(B) 44 102〕金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)〔CMCC(B) 63 501〕白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕黑曲霉(Aspergillus niger)〔CMCC(F) 98 003〕菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时。
上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7天，加入3～5ml 含0.05％(v/v)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％(v/v)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
适用性检查取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数；取白色念珠菌50～100cfu，注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数。
同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
结果判定被检培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值大于70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。
判该培养基的适用性检查符合规定。
计数方法的验证当建立产品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。
若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。
对各试验菌的回收率应逐一进行验证。
菌种及菌液制备同计数培养基的适用性检查验证方法验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
(1)试验组平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。
薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。
(2)菌液组测定所加的试验菌数。
(3)供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
(4)稀释剂对照组若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。
试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含50～100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
结果判断在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率(稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70%。
若试验组的菌回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法(表1)等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用，那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被试验菌污染。
但是，供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。
因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。
若验证试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验。
计数方法验证时，采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么选择回收情况最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检验。
验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。
供试品检查计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。
检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。
按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液制备。
用稀释液稀释成1∶10、1∶102、1∶103等稀释级的供试液。