原代角质形成细胞的分离培养方法
原代细胞培养
• （5）克隆法 • 采用细胞克隆法将细胞分成单个细胞，使之分
别生长成克隆，选择出所需要的克隆。
• （6）流式分选
细胞培养的一点经验教训
• 细胞的代数问题:
• 细胞来源问题: HUVEC: ECV304 “李逵”还是“李鬼”
• The cell in the cell line ECV-304 are not endothelial cell, but are derivated from the tumor cells of a patient with bladder c arcinoma. Some papers about it: 1．Dirks WG, Macleod RAF, Drexler HG. ECV-304(ENDOTHELI AL)is really T24(bladder carcinoma):cell line cross-contamina tion at source. In Vitro Cell Dev Biol 35:558~559 1999; 2. Drexler HG, Quentmerier H,Driks WG et al. Bladder carcino ma cell line ECV-304 is not a model system for endothelial c ells.In Vitro Cell Dev Biol 38:185-186,2002;
（2） 胶原酶（Collagenase）
• 胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，水解结缔 组织中胶原蛋白成分 ，而不损伤其它蛋白质和组 织。 。
• 适用组织：纤维性组织、上皮组织以及癌组织 • 对细胞间质有较好的消化作用。 • 有钙、镁离子存在仍有活性 • 消化作用缓和，无需机械振荡 • 价格较高，大量使用将增加实验成本 • 采用胶原酶与胰蛋白酶联合消化。 • 最终浓度0.1~0.3mg/mL.
B6—Co与B6小鼠眼睑角质形成细胞的原代无血清培养及比较研究
B6—Co与B6小鼠眼睑角质形成细胞的原代无血清培养及比较研究摘要：为进一步研究B6-Co小鼠眼睑发育缺陷机制，首次培养了小鼠眼睑角质形成细胞，并对B6-Co和B6小鼠眼睑角质形成细胞的迁移能力进行划痕实验分析，FITC-phalloidin染色比较B6-Co和B6小鼠肌动蛋白细胞骨架。
结果表明，B6-Co小鼠眼睑角质形成细胞迁移的数目和距离明显少于B6小鼠，细胞骨架异常，B6-Co小鼠眼睑闭合不全（EOB）是由小鼠眼睑角质形成细胞迁移缺陷造成的。
关键词：小鼠；眼睑闭合不全（EOB）；角质形成细胞；肌动蛋白细胞骨架；无血清培养pB6-Co小鼠（C57BL/6-Corneal opacity mouse，B6-Co）是邵义祥等[3]通过ENU诱变技术获得的一种具有角膜混浊表型的突变系小鼠，该系小鼠出生时患有眼睑闭合不全（eyelid open at birth，EOB），EOB的发生率为43.1%，后逐步发展为角膜混浊。
前期组织学研究初步证实B6-Co小鼠在眼睑发育的14～16 d 时，上下眼睑的角质形成细胞迁移障碍。
进一步研究B6-Co小鼠眼睑发育缺陷机制以为人类眼睑发育缺陷、角膜病的早期诊断和矫正治疗提供重要的细胞模型和试验研究手段及阐明眼睑发育生物学机制。
该研究通过对小鼠眼睑角质形成细胞的原代无血清培养，进而探索B6-Co小鼠眼睑角质形成细胞的迁移情况和细胞骨架形态。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试验动物B6-Co（C57BL/6-Corneal opacity mouse，B6-Co）小鼠和B6（C57BL/6，B6）小鼠由南通大学实验动物中心提供。
小鼠饲养在清洁级屏障动物房内，室内温度为（23±2）℃，湿度控制为（55±5）%，自由采食和饮水，室内照明采用12 h∶12 h明暗交替，定期更换笼具、垫料。
晚上9点将B6-Co （雄性）小鼠与B6（雌性）小鼠以1∶2的比例合笼交配，次日上午8点检栓并将雌雄小鼠分笼饲养，检测到栓的雌鼠记为孕0.5 d，并将其单独饲养。
原代细胞的培养与建系
原代细胞的培养与建系(一)细胞的来源多样，培养方法也各不相同，凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。
原代细胞经分散接种之手段称为传代。
凡能经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。
若能稳定生长传至10~20代以上的细胞可确立为细胞系。
若有条件能开展单细胞克隆、纯化，经大量扩增后所形成的生物学特性稳定的克隆化细胞群，称之为细胞株或克隆细胞。
此过程称为细胞的纯化或细胞克隆。
这些基本技术是从事细胞培养工作的基础，只有熟悉和掌握了基本技术，才可能更快捷地学习和掌握其他方法，本章重点叙述常用的基本技术。
第一节原代细胞的取材人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，是进行细胞培养的第一步，若取材不当，将会直接影响细胞的体外培养，现将取材的基本要求和注意事项叙述如下：一、取材的基本要求（1）取材要注意新鲜和保鲜新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。
若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h.对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。
（2）取材应严格无菌所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。
要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。
（3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。
（4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。
原代细胞培养操作步骤
原代细胞培养操作步骤原理：将动物机体的所有组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置适宜的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程之为称原代细胞培养。
操作步骤（一）胰酶消化法1、器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，放入75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和**浸入体内）然后用碘酒**腹部，取胎鼠带入超净台内（或者将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。
2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
6、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
7、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。
8、加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9、加入培养液l—2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。
上述消化分离的方法是基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。
细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。
（二）组织块直接培养法自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。
翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。
入37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法1. 引言嘿，大家好！今天咱们聊聊动物细胞的培养，听起来可能有点高大上，但其实就像种花一样，只是“花”是细胞，养护的方法也有讲究。
说白了，细胞也有自己的“家”，咱们得给它们创造个舒适的环境，让它们在里面嗨起来！接下来，我就带你走进这个充满神奇和乐趣的细胞世界。
2. 原代培养2.1 什么是原代培养？原代培养，简单来说，就是从活体动物身上直接提取细胞，然后把它们放在培养皿里，就像把新鲜的花插进水里一样。
你知道吗，这些细胞就像刚从大自然里来的小家伙，特别活泼，适应能力强。
不过，这可不是随便就能搞定的，得有点技术活。
2.2 原代培养的方法首先，咱得准备好一切工具，这可是基础中的基础，不能马虎。
咱们要用到无菌技术，确保培养环境干净得像新洗的碗，不然细胞们就会遭殃。
提取细胞时，通常会用胰酶把它们从组织中“松开”，就像剥开一个大榴莲，里边的果肉才好吃嘛。
然后，把这些细胞放到培养基里。
培养基就像细胞的“快餐”，里面有细胞需要的各种营养物质和生长因子。
要记得，细胞也要“吃好”，才能长得壮壮的，不然就不成气候了。
培养的环境也不能小看，温度、pH值、二氧化碳浓度都得保持稳定。
咱们得把细胞放在适合的温度下，就像给它们开个温暖的“家庭聚会”。
如果环境不合适，细胞就会抗议，甚至罢工！3. 传代培养3.1 什么是传代培养？说到传代培养，那就是把原代培养中的细胞继续繁殖，让它们“生儿育女”。
这就像一个大家庭，越来越壮大，热闹得不得了。
传代培养可以让我们获得更多细胞，方便后续的实验和研究。
3.2 传代培养的方法传代培养的关键在于及时分离细胞，咱不能让细胞们挤在一起，这样容易“打架”。
通常，当细胞长满培养皿后，就需要把它们分离开。
这个过程又得用到胰酶，跟原代培养一样，轻轻松松把它们从皿里“请”出来。
接下来，咱们需要把细胞分到新的培养皿里，再给它们加上新鲜的培养基，确保它们能继续健康成长。
注意，细胞们需要一点时间适应新环境，就像搬家后要习惯新居的味道一样。
人瘢痕角质形成细胞原代培养中胰酶配方及浓度的探讨
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中国美容 医学 ２ １ ０ ２年 ５月第 ２ １卷第 ５期 Ｃ ｉｅｅＪｕｎ ｌ ｆ ｅｔｅ ｃＭｅｉｉｅＭａ．０ ２Ｖ １ １Ｎ ． ｈｎ ｓ ｏｒａ ｏ ｓ ｔ ｄｃ ． ｙ２ １．ｏ． ．ｏ Ａ ｈｉ ｎ ２ ５
・
论著 ・
人瘢 痕角质形成细胞原代培养 中胰酶配方及浓度的探讨
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原代细胞提取
原代细胞提取将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
原代细胞培养的步骤一般是：取材→分离→培养和维持，今天我们重点介绍原代细胞的取材和分离方法。
原代细胞是通过一定的方法如酶法或机械法或生长法使细胞从人体和动物的母体器官、组织或液体中分离出来，并在受控环境条件下分离的细胞在体外或其他人体和动物体内生长。
原代细胞的提取方法详细步骤：1.整个操作要在洁净通风的超净台下进行，所有的器材要高压消毒。
2.根据BALB/c小鼠的体重，将小鼠置于盛有75%乙醇的烧杯内，这一步不仅可以消毒，也可以让小鼠体毛浸湿，后续剃去皮毛的时候不会沾到剪刀或组织上。
3.用镊子轻轻挑起小鼠的心脏，装有PBS的注射器插入心尖，同时在右心耳处剪开一个小口，缓慢推动注射器，随着心脏的跳动，将体内的血液冲洗出来。
4.取出小鼠的肺部组织，将肺组织切成小米粒样的大小，置于预冷的HBSS中反复冲洗几次。
5.将小米粒大小的肺组织置于培养瓶中（培养瓶前一天用1%明胶溶液包被培养面，4度过夜，小鼠处理前，将培养瓶放置培养箱中，使其温度恢复至37度），置于培养箱37度的环境下，消化4个小时。
6.消化4小时后，加入培养基（添加培养基，可以是正常培养时的2倍量），继续培养24小时（继续培养的时间可根据细胞贴壁情况适当调整）。
7.24小时后，取出肺组织，镜下观察细胞状态，换液。
8.原代细胞的提取和培养是很慢的过程，一般需等到24小时后，才能在镜下看到些许细胞群，一周到两周后才会看到鹅卵石样的排列情况。
9.原代细胞2-3天换液一次，因为内皮细胞生长形成单层时，会出现接触抑制现象。
所以，内皮细胞生长接近单层时就可以传代了，不要等到长得非常满。
原代细胞传代培养步骤
原代细胞传代培养步骤原代细胞传代培养是一种常见的细胞培养技术，用于从组织样本中分离和培养原代细胞。
在细胞生物学研究中，原代细胞传代培养可以提供大量的同一类型细胞，以进行后续实验和研究。
本文将详细介绍原代细胞传代培养的步骤。
1. 材料准备在进行原代细胞传代培养前，需要准备以下材料：•组织样本：可以是动物组织或人体组织。
根据实验需求选择合适的组织样本。
•培养基：选择适合目标细胞类型的培养基。
常用的培养基包括DMEM、RPMI 1640等。
•酶消化液：用于组织样本的酶消化，以分离单个原代细胞。
2. 组织样本处理将收集到的组织样本放入无菌PBS（磷酸盐缓冲液）中进行清洗，去除血液和其他污染物。
随后，将组织样本切割成小块，放入含有适当浓度的酶消化液中进行酶消化。
消化时间和酶的浓度取决于组织类型和个体差异，一般需要在37℃下进行1-2小时。
3. 细胞分离和筛选经过酶消化后，将组织样本转移到离心管中，并加入相同体积的培养基。
用离心机以适当的速度离心，将细胞沉淀在管底。
去除上清液，用培养基重新悬浮细胞沉淀。
使用显微镜观察细胞悬浮液中的细胞密度和形态。
根据实验需求，可以使用不同方法筛选目标细胞。
常见的方法包括：•贴壁法：将悬浮的细胞直接接种到含有培养基的培养皿中，目标细胞会附着在培养皿底部。
•富集法：利用特定抗体或染料结合目标细胞表面标记物，通过流式细胞仪等设备进行筛选。
•球形培养法：将悬浮的细胞转移到特殊的培养皿中，使细胞形成三维球状结构，目标细胞会在球体内富集。
4. 培养和传代筛选出目标细胞后，将其转移到新的培养皿中，并加入适量的培养基。
根据目标细胞类型的需求，可以添加不同的生长因子、补充物和抗生素等。
在初始培养过程中，需要密切观察细胞的生长情况。
一般情况下，原代细胞会经历一个潜伏期，在此期间细胞数量较少。
随着时间的推移，细胞开始快速增殖，并逐渐达到稳定增长状态。
当原代细胞达到80%～90%的密度时，需要进行传代以避免过度生长和凋亡。
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原代角质形成细胞的分离培养方法
原代细胞在相关细胞实验使用过程中越来越多，人们不再单单趋于使用细胞系进行实验研究，因为细胞系常常由于体外长期培养，而容易丢失原有的生物学特性，对药物处理的反应差距越来越大。
原代细胞刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反应体内生长特性，原代细胞的活力和生长状态都比较好，细胞的纯度和基因保留可达到90%以上，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等试验研究，使用原代细胞进行实验，
可以获得更准确的研究和数据。
为了更好的服务于广大科研工作者，赛百慷技术人员特提供了角质形成细胞分离的常用方法，技术因人而异仅供参考：
角质形成细胞是一种不断分化的复层鳞状上皮细胞，其分化的最终阶是形成角蛋白。
根据角质形成细胞的发展阶段和特点，从内向外可将其分为五层。
基底细胞层又称生发层，棘细胞层，颗粒层，透明层，角质层。
角质形成细胞的分化成熟表现为从基底层到向角质层的逐渐移行。
在单一移行过程中，角质形成;细胞的形状和功能也逐渐发生着变化，从单层柱状上皮的基底层到扁平的细胞核消失
的角质层。
新生的基底细胞进入棘细胞层，然后上移到颗粒层的最上层。
细胞组织来源于实验动物的正常皮肤组织，细胞生长状态为贴壁培养。
需要的实验试剂：
1.培养基1：iCell原代角质细胞培养体系
4.基础培养基：DMEM/F12
5.缓冲液：无菌不含Ca2+和Mg2+的1×PBS+1×P/S，pH=7.4
6.消化液1：1.2U/ml的dispase Ⅱ
7.消化液2：0.25%胰蛋白酶+0.02mM EDTA
8.消化液3：0.1%Ⅰ型胶原酶
9.75%医用酒精
10.胎牛血清（FBS）
实验器械：
1.培养皿
2.T-25细胞培养瓶
3.100目不锈钢网筛
4.200目不锈钢网筛
5.眼科剪
6.眼科镊
7.离心管（15ml、50ml）
实验步骤：
1.新鲜的包皮组织，装盛于含有无菌生理盐水或1×PBS的无菌容器中，于保温盒中，冰上放置离体6h内运输到实验室进行后续分离。
2.在无菌环境中取出包皮组织，用1×PBS清洗2-3次去除表面血液后，75%的酒精浸泡100s
3.酒精浸泡组织后快速将组织转入装有1×PBS的培养皿中震荡清洗数次以去除酒精，然后用眼科剪小心剪去皮下组织（脂肪，微血管等）
4.将去除了脂肪和微血管组织的再用1×PBS清洗几次后，剪成3mm*8mm左右的皮片，用消化液1 4度消化过夜（15-18h）。
5.第二天，用2个眼科镊子小心撕开过夜消化的皮肤组织，分离真皮和表皮；
6.分离的表皮用眼科剪剪碎后用消化液3 37度水浴消化1h。
7.消化完成后用移液器充分吹打100次左右，然后用含血清的培养基终止消化，过200目不锈钢网筛后取滤悬液，转入15ml离心管中，400g离心10分钟，离心完成后弃去上清，沉淀用3ml的1×PBS吹打重悬后，400g离心5min离心完成后弃去上清，沉淀用2ml的原代角质细胞培养基吹打重悬后，转入已经装有2ml培养基的T-25培养瓶中，将培养瓶置于37℃的二氧化碳培养箱中培养。
8.视细胞贴壁情况48-72h后换液去除未贴壁的细胞，之后继续培养，视细胞生长状况和培养基颜色每2-3d换液一次；待细胞贴壁率达到80-90%后，进行常规传代扩增操作（角质细胞对胰酶不太敏感，消化时间可能会增加到10-15分钟，有时需要配合使用无菌细胞刮铲进行传代）。
除了上述的细胞分离方法以外，赛百慷还有很多关于其他细胞的分离方法，想要学习的小伙伴可以来赛百慷进行现场学习，如果想要其他原代分离培养方法，可在购买相应的细胞过程中，赠送该细胞的分离方法及培养条件，想要了解更多，打电话或咨询相关工作人员。