大肠杆菌的转化、扩增及一些基础的实验前准备
实验一 大肠杆菌转化实验
实验一大肠杆菌转化实验实验原理质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。
一、实验材料准备1. 器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5 ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。
2. 试剂培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。
3. 材料处理无菌ddH2O，1.5 ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。
二、操作步骤1. 事先将恒温水浴的温度调到42℃。
2. 从-70℃超低温冰柜中取出一管（100 μl）感受态菌，立即插入冰上，冰浴5~10 min。
3. 待感受态菌融解后，加入5 μl 连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100 ng），轻轻震荡后放置冰上30 min。
4. 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1 min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5 min。
5. 在超净工作台中向上述各管中分别加入500 μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1 h。
6. 将培养好的离心管中的菌12000g离心1min，去上清（大概剩余100μl后用枪打均匀）。
在超净工作台中取上述转化混合液100μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用灭过菌的玻璃涂布棒涂布均匀。
7. 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40 μl 2% X-gal，8 μl 20% IPTG，用灭过菌的玻璃涂布棒涂布均匀。
8. 在涂好的培养皿上做上标记，并用封口膜封好。
实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的1.了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作要点;2.质粒DNA转化大肠杆菌细胞的原理和方法.二、实验原理外源DNA只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增，而大肠杆菌转化实验的技术关键就是制备感受态细胞，即应用一些特殊方法（如点击法，CaCl2处理）处理后，使细菌细胞膜通透性发生暂时的改变，处于能允许外源DNA分子进入的状态，即为感受态细胞。
CaCl2转化法的基本原理是细菌在低温，低渗（0℃0.1mol/LCaCl2）的溶液中，菌体细胞膨胀成球形，局部失去细胞壁或细胞壁溶解，外来的DNA可形成抗DNase的羟基--钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短暂热冲击处理，促使DNA复合物进入细胞，从而实现外源基因的转化。
三、实验材料（一）样品1.连接了目的基因的重组体分子2.细菌——大肠杆菌DH5α菌株：R （限制酶缺陷型），M（甲基化修饰缺陷型），Amp。
（二）试剂1.LB固体和液体培养基（营养培养基）和含Amp的LB固体培养基（选择培养基）；2.氯化钙溶液（1）0.01mol/Lcacl2溶液：称取0.56g无水cacl2（分析纯），溶于50ml水中，定容至100ml，高压灭菌后备用。
（2）保存液（含15%甘油的0.01mol/Lcacl2）：称取0.56g无水cacl2（分析纯），溶于50ml 水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌后备用。
3.氨苄青霉素（Amp）母液配成100mg/ml水溶液，-20℃保存备用。
（三）仪器及器材①超净工作台；②恒温摇床；③离心机；④V-1100分光光度计；⑤水浴锅；⑥微量移液器。
四、实验步骤（一）操作步骤1.感受态细胞的制备和保存感受态细胞的制备试验步骤步骤操作（1）细菌小量培养从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落，接种于3-5mlLB液体培养基中，37℃180r/min震荡培养过夜（2）扩大培养取细菌悬液1ml，以1:100的比例接种于100mlLB液体培养基中，37℃震荡培养1-2h至A600=0.5左右（3）收集菌体将培养液转入离心管中，冰上放置10min，然后4℃5000r/min离心10min，弃上清（4）cacl2处理菌体加入1/10体积（10ml）0-4℃预冷的无菌cacl2（0.01mol/L）溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置10min后，4℃5000r/min离心10min，弃上清（5）感受态细胞的手机与分装加入2000ul预冷的无菌cacl2e(0.01mol/L)重新悬浮细胞，分装成100ul备用（6）长期保存加入1600ul预冷的无菌cacl2(0.01mol/L)和400ul无菌的70%甘油轻轻悬浮细胞或直接加保存液200ml，冰上放置几分钟后，分装成100ul小份，液氮速冻10min后，-70℃保存备用2.转化DNA转化实验步骤步骤操作（1）冰浴取100ul感受态细胞悬液，在冰浴中加入10ul连接产物（或质粒DNA）（含量不超过50mg，体积不超过10ul），轻轻混匀，冰上静置30min（2）热击转化产物在42℃水浴中热击90s（勿摇动，勿超时），之后迅速置于冰上冷却2min（3）复苏向管中加入1mlLB液体培养基，37℃，100-180r/min震荡培养45min至菌液肉眼观察到轻微浑浊（4）涂板，培养取上述菌液100ul涂板，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12-16h（二）注意事项1.细胞的生长状态和密度。
大肠杆菌电转和文库扩增
科隆生物医学有限公司·保密大肠杆菌基因电转化(1)(制剂范围可以放大或缩小）感应态菌制备培养液和制剂：-无任何抗生素及含有氨苄青霉素/ carbnicillin或其他适当抗生素的LB平板-2×LB或YT培养基500毫升-SOC培养基-冰冷的高压灭菌去离子水：1000毫升-冰冷的高压灭菌10 ％甘油（500毫升）-预冷却的50ml离心管，离心管和电转移杯。
方法：1．从一个新鲜的琼脂平板上接种单个大肠杆菌单菌落到含有5ml的2 ×YT培养基的烧瓶中。
孵育培养5小时或过夜，于37℃和250rpm旋转振荡器培养。
2 。
用5ml过夜的细菌培养物接种到在2升烧瓶中500毫升预热的2 ×YT培养基中。
于37℃搅拌下（250转的旋转振荡器）。
一个小时以后，每20分钟测定OD600值。
3 。
当培养物的OD 600达到0.2.5-0.3 ，迅速将烧瓶转移到冰水浴中15-30分钟。
偶尔转动培养瓶以确保冷均匀。
4 。
转移培养物至50ml冰冷的离心瓶。
在4500rpm和在2 ℃下离心10分钟，收获细胞倒出上清液和重悬细胞沉淀在50毫升冰冷的纯水并在2 ℃下孵育3分钟。
5 。
通过在2 ℃下离心10分钟收获细胞（4500rpm）, 倒出上清液和重悬细胞沉淀在50毫升冰冷的纯水中并孵育3分钟。
6 。
通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），倒出上清液和重悬细胞沉淀在25毫升冰冷的10％甘油中。
7 。
通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），倒出上清液和重悬沉淀在10毫升冰冷的10 ％甘油。
8 。
通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），小心地倒出上清液，并使用巴斯德吸管残余水滴。
合并和重悬沉淀于1毫升冰冷的10 ％甘油。
9 。
测量1:100稀释的细胞悬浮液的OD600值：用冰冷的10％甘油稀释细胞悬液，然后测定。
浓度应是2× 1011到3× 1010个细胞/ ml 〜OD = 800 -120 （1.0 OD 600 =约2.5× 108细胞/ ml）。
大肠杆菌感受态制备及转化
大肠杆菌感受态制备及转化大肠杆菌（Escherichia coli）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，常见于土壤、水体、人和动物的肠道等地方。
由于其易于培养和操作，成为生物学研究中常用的实验材料。
本文将介绍大肠杆菌的感受态制备及转化的过程。
感受态制备是指将大肠杆菌细胞从冻存状态恢复到活跃状态的过程。
为了保证感受态制备的成功，首先需要准备培养基和细菌菌种。
常用的培养基有LB培养基和SOC培养基，其中LB培养基适用于大肠杆菌的一般培养，SOC培养基则适用于感受态制备和转化实验。
培养基的配制需按照实验要求进行，注意消毒措施，避免污染。
感受态制备的过程一般包括以下几个步骤。
首先，将冻存的大肠杆菌菌种转移到预先加热的LB培养基中，进行孵育培养。
培养温度和时间根据实验需要进行调整，通常为37摄氏度下培养12-16小时。
其次，将培养物进行稀释，使其浓度适合后续实验操作。
最后，将稀释后的细菌液进行离心，去除上清液，沉淀后的菌体即为感受态大肠杆菌。
感受态大肠杆菌的转化是指将外源DNA导入到大肠杆菌细胞中的过程。
转化的前提是大肠杆菌细胞处于感受态，即细胞膜对外源DNA具有较高的通透性。
转化的关键是选择合适的质粒载体和转化方法。
常用的质粒载体有pUC19、pGEM-T等，这些载体具有含有抗生素抗性基因的特点，可以通过抗生素的选择来筛选转化成功的细菌。
质粒载体通常通过限制酶切与外源DNA进行连接，形成重组质粒。
将重组质粒与感受态大肠杆菌进行转化后，通过培养在含有抗生素的培养基上筛选，即可得到含有目标基因的转化菌落。
转化的方法有热激法、电穿孔法和化学法等。
热激法是将感受态大肠杆菌与重组质粒混合后，在高温条件下进行短暂的热冲击，使细菌细胞膜通透性增加，促进外源DNA的摄入。
电穿孔法是利用电场作用使细菌细胞膜产生孔隙，使外源DNA通过孔隙进入细胞。
化学法则是利用化学试剂改变细菌细胞膜的性质，增加其对外源DNA的吸收能力。
转化后的菌落需要进行筛选，常用的方法是通过抗生素选择。
大肠杆菌实验
大肠杆菌感受态细胞制备与质粒DNA的转化一、实验目的1）掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。
2）学习和掌握质粒DNA的转化和筛选方法及操作步骤。
二、实验原理本实验以E.coli DH 5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pBS质粒共保温实现转化。
由于所用pBS质粒带有长那霉素抗性基因。
因此可以通过长那霉素抗性来筛选转化子。
如果受体细胞没有转入pBS，则在含长那霉素的培养基上不能生长。
能在长那霉素培养基上生长的受体细胞肯定已经导入了pBS。
转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳酶切等进一步鉴定。
三、仪器及试剂仪器：恒温摇床、CO2细胞培养箱、台式高速冷冻离心机、超净工作台、低温冰箱、恒温水浴锅、制冰机、分光光度计、移液枪、Eppendrof管。
试剂：LB培养基(在950mL水中加入10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl、用1mol/L NaOH调制pH=7.2.加入至1L，121℃高压灭菌20min)长那霉素储存液：100mg/mL含长那霉素的LB固体培养基：(1L LB液体培养基中加入20g琼脂粉，将配好的LB固体培养基高压灭菌后，冷却至60℃左右，加入长那霉素储存液，使其终浓度为50μg/mL。
摇匀后铺板，每皿倒15mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净)1mol/L CaCl2储存液质粒DNA10ng/Μl四、实验步骤1 感受态细胞的制备1）从LB平板上挑选新活化的E.coli DH 5α单菌株，接种于3~5mL LB液体培养基中，37℃下震荡过夜培养，12h左右，直至对数生长后期。
2）将该菌悬浮液以1:50的比例接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h至OD600为0.5左右。
3）将5mL培养液转入4个1.5mL离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下，5000rpm离心5min。
4）弃去上清液，用预冷的1mL 0.1 mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15~20min后，40℃下5000rpm离心5min。
大肠杆菌的转化、
大肠杆菌的感受态制备溶液的准备：①TB（transformation buffer）500ml制备方法： PIPES 1.5gCaCl2·2H2O 1.1gKCl 9.3g加水调制475ml后用1mol/L的KOH调PH至6.7（约用6-7ml）然后加入MnCl2·4H2O5.45g,将总量调到500ml，用0.22um的滤膜过滤，4℃保存。
②SOB培养基Trptone(peptone) 20gYeast Extrat 5g5M NaCl 2ml2KLl 1.25ml加水到990ml,atuo clone 然后加10ml 2M Mg2+ sol 储存。
2M Mg2+ sol的制备方法：MgSO4·7H2O 12.324gMgCl2·6H2O 10.165g加水到50ml混匀。
每100mlSOB溶液中加入1ml的2M 葡萄糖溶液就可以制备成SOC溶液在4℃保存。
感受态的制备：①涂板，在培养基上粗画线，培养大肠杆菌DH5α37℃过夜②挑取5-7个菌落③将挑取的菌落加入到250ml的SOB （应将菌放在2L的三角瓶中保证菌有足够的空气）④17℃到18℃震荡50小时直到其OD值在0.4-0.8之间，一般0.6最适合。
OD值越小菌较年轻效果较好。
⑤到了预定的OD值后置于冰上10分钟。
⑥用50ml的Falon tube 分装⑦4℃3000prm离心10分钟倒去上清⑧加1/3的冰冷TB buffer 约17ml⑨让菌呈悬浮状态混匀使其复苏⑩置于冰上10分钟⑪4℃3000rpm离心10分钟后去上清⑫加4mlTB（0℃）使菌复苏后⑬加0.3mlDMSO（相当于7%）然后置于冰上10分钟⑭分装到0.3ml的tube中-80℃保存。
wp_240768786基因在大肠杆菌中的过表达实验的实验内容
wp_240768786基因在大肠杆菌中的过表达实验的实验内容基因在大肠杆菌中的过表达实验是一种常用的实验方法，通过引入外源表达载体，将感兴趣的基因在大肠杆菌中过量表达，从而研究该基因在生物体中的功能、调控机制和相互作用等方面的问题。
本文将介绍基因在大肠杆菌中过表达实验的实验内容。
一、实验前的准备工作1.选择合适的表达载体：通常采用静态表达载体，如pUC19，pBluescript等，或动态表达载体，如pET系列，pGEX系列等。
2.克隆目标基因：使用PCR或其他克隆方法从原始样本中扩增出目标基因，并通过酶切与载体连接。
3.转化大肠杆菌：利用热激转化、电穿孔转化等方法将重组载体转化到大肠杆菌中。
二、基因克隆与构建表达载体1.通过PCR扩增基因：设计引物，利用PCR技术从模板DNA中扩增目标基因。
2.准备载体：选择适当的表达载体，并通过限制性内切酶酶切开，以便与PCR扩增的基因片段连接。
3.构建重组载体：将PCR扩增的目标基因片段与线性化的载体连接，利用连接酶如T4 DNA连接酶处理，并通过热激转化等方法将重组载体转化到大肠杆菌中。
三、大肠杆菌中的基因过表达1.筛选阳性克隆：将转化后的大肠杆菌克隆在含有适当抗生素的培养基上培养，选择阳性克隆并进行验证。
2.静态表达或动态表达：根据需要选择适当的表达载体和表达系统。
四、鉴定表达产物1.确定表达水平：通过聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质质谱、Western blot、酶联免疫吸附实验（ELISA）等方法，检测表达基因的存在和表达水平。
2.验证表达产物功能：通过下游分析，如活性酶测定、免疫组化、免疫印迹等方法，评估过表达产物的功能和活性。
五、研究过表达基因的功能和调控机制1.功能研究：通过过表达基因后的表型观察，如细胞生长、代谢物产量、酶活性增加等，评估基因表达对细胞生理过程的影响。
2.亚细胞定位：通过融合表达产物与荧光标记或标示剂相结合等方法，观察基因表达产物在细胞中的定位，从而推测其功能和组织定位。
大肠杆菌感受态制备与转化实验
从平板上挑取 1 个单菌落，接种于 大肠杆菌单菌落、 平板、恒温摇 过 夜 或
10ml LB 液体培养基中，在 37℃的 摇床中振摇过夜培养
LB 液体培养基
床、接种环 12-16h
说明：（1） 一般高校实验室保存有大肠杆菌菌种，此步骤可省略。 （2）目的为大肠杆菌的分离。鉴定方法：培养后，见划线末端出现不连续的单个菌落时，表明 菌已被分离。分离后的平板可放至冰箱 4℃短期保存，供一周内使用。若需长期保存，可将甘油与 菌体的混合物放于离心管中在-20℃冷冻保存。 （3）目的为单菌落细菌的扩增。此步培养基的量可自定，适宜摇菌即可。由于学生经验不足可 能导致过夜培养效果不佳，教师应提前检查菌种培养情况以保证实验成功率，教师也可自己准备。
每 100μL 一份保存
移液枪
移液枪、离心 管
10min
说明：（1）此步骤液体培养基的量可根据具体人数而自定。公式：1.5mL（人均）×人数；对数 生长期是制备感受态细胞和进行成功转化的关键，此步即为本实验的关键。
（2）冰浴目的即让菌在最佳时期在停止生长，若实验时间有限，在能保证 OD600≤0.4~0.5， 细胞数务必＜108/mL 的前提下，此步骤可免；注意：实验所有操作都需在冰上或低温条件下进行， 否则细胞转化率会降低。
60min
86
用移液枪吸取细菌的悬浮液，放到制好的平板上，用涂 移液枪、固体
（6） 布棒将细菌悬浮液涂布均匀，盖上平板，放置 10min 吸 培养基、涂布 10min
干菌液
棒
用与上两步相同的方法将未加入质粒的感受态大肠杆
（7） 菌涂布在另一块平板上，并标记两块平板
上两步总和
（8） 待溶液吸干后倒置培养基板，在 37℃下过夜培养
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A．大肠杆菌的转化（热击法）
1. 从-80℃超低温冰柜中取出一管感受态大肠菌（BL21），立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10 min。
从冰箱中拿出含目标基因片
段的质粒一管，也插入冰中，冰浴5~10 min，待融化。
2. 往上述大肠菌中加入5 μl(一般大肠菌50ul,质粒5ul)连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100 ng），轻轻震荡后放置冰上20 min。
同
时，将恒温水浴的温度调到42℃。
顺便把质粒管放回原处。
(移液器枪头可能要用贴有白色标的那种).(有时大肠菌为10UL，质粒1~2UL。
比例在10:1左右)
3. 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1 min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置5~10 min。
这样质粒就被导入了。
4. 在超净工作台中向上述引入质粒的大肠杆菌管中加入500 μl LB培养液（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床弹簧架上37℃震荡0.5h。
5. 同时将含合适抗菌素（AMP）的固体LB平板培养皿，放入烘箱37℃下烘0.5h。
这样可以防止大肠菌因为较大温差而死亡。
6. 在超净工作台中取上述转化混合液（即导入质粒的大肠菌）150 μl，滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过（防止杂
菌）的玻璃涂布棒涂布均匀，注意涂布棒不可烧后直接涂，要降温。
将多余的转化混合液倒入废液缸，管子投入指定地点。
7. 倒置培养基，在培养皿上做上标记，放置在37℃恒温培养箱中培养箱过夜（约12-15小时）。
9. 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，整理。
B．大肠杆菌扩增用的“营养肉汤培养液”的配制
酵母提取物，蛋白胨，氯化钠，NaOH溶液等按照实验室写的来，加1L超净水。
配好的培养基灭菌时需要在摇瓶上加透气的塞子，然后120度20分钟灭菌。
写上标签。
有些需要灭菌的器材都可以在此时灭菌。
C1．大肠杆菌扩增（在2*TY培养基上）
1.实验前先对双手消毒。
实验时也要注意对器材在火上烧一下如镊子，移液器，试管口，试管盖，使用前后的竹签。
2.用70%酒精消过毒的移液器将5 mL的LB培养液放入干净的试管中，同样将5u L的Amp加入其中。
加的时候注意稍稍倾斜。
3.用干净的竹签点取A中培养皿中的菌落（五个左右，有时会用单菌落），蘸一下上述5mL LB培养液。
4.加上试管盖，贴上标签。
在37℃摇床弹簧架上培养约3 h。
OD达0.6~0.8.
5.往B中所述的营养肉汤培养液(1L)中加入1 mL的AMP，之后往营养肉汤培养液中加入本步实验得到的5mL 含转化大肠菌的LB培养液。
6.放入摇床约3小时，测OD600，OD600达到0.6即可进行下一步。
6.将摇瓶没入冰中5min，之后加入0.5mM(最终浓度) IPTG（诱导外源基因表达）(1ml)
7.18度于摇床上16小时。
C2.大肠杆菌扩增（在M9培养基上）
1.前一天按配方配好M9培养液，高温灭菌后冷却后，放入冰箱中；
2.这里的操作和C1中的前四步相同（也可参考O）；C1中的第四部要使OD达到0.8。
3.取100-200ul的上述菌液，加入到已经预热了的100ml的M9培养基中（加100ulAMP），过夜（16小时左右）；
4.将事先预热了的900mlM9培养基中加入1mlAMP，再加入上述的100mlM9培养基，37度培养。
当OD达到0.6-0.7时，进行下一步（约3.5小时）。
5.将上述1LM9培养基至于冰中，加入1ml IPTG(最终浓度0.5 mM,最初的是0.5M)，过夜（16-20小时左右即可）。
D．集菌
将C中的扩增也分多次在离心机上离心，注意让菌集在同一侧（集菌测向上）。
离心时间5min，转速10000，温度4度。
离心完后用纸巾（不要加酒精，会杀死细菌的）尽可能不要碰到沉淀且吸完水分。
写上标签，放入-80度的冰箱中。
1。