平板菌落计数

平板菌落计数

一、实验器材

1土壤样品

2培养基

淀粉琼脂培养基（高氏一号培养基），牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基或马铃薯培养基3溶液试剂

可溶性淀粉、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、马铃薯、链霉素、孟加拉红水溶液

NaCl、KNO3、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、KH2PO4、

高氏1号培养基配方：

可溶性淀粉20g

NaCl 0.5g

KNO31g

K2HPO4·3H2O 0.5g

MgSO4·7H2O 0.5g

FeSO4·7H2O 0.01g

琼脂20g

水1000ml

pH 7.2-7.4

配制时，先少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。再称取其他各成分依次逐一溶化。

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配制

牛肉膏3g

蛋白胨10g

氯化钠5g

琼脂20g

水1000mL

pH 7.0-7.2

马丁氏培养基配方如下：

KH2PO41g

MgSO4·7H2O 0.5g

蛋白胨5g

葡萄糖10g

琼脂15-20g

1/3000孟加拉红水溶液100ml

水800ml

pH自然

由于链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基溶化后待温度降至45℃左右时才能加入。可先将配成0.03%的链霉素溶液，临用前在培养基中加0.03%链霉素液100ml，使每毫升培养基中含链霉素30μg。

马铃薯培养基配方

马铃薯（去皮）200g

葡萄糖（或蔗糖）20g

琼脂15~25g

水1000ml

自然pH

去皮马铃薯200g，切成小块，放入烧杯中煮沸30min，注意用玻棒搅拌以防糊底。然后用双层纱布过滤，取滤液加糖（酵母菌用葡萄糖，霉菌用蔗糖），加热煮沸后加入琼脂，继续加热融化并补水至1000mL。

二、操作步骤

1.稀释涂布平板法

( 1 ) 倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基加热溶化待冷至55～60℃时，高氏I号琼脂培养基中加入10%酚数滴，马丁氏培养中加入链霉素溶液(终浓度为30μg/ml)，混合均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。

倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。

( 2 ) 制备土壤稀释液：称取土样l0g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将细胞分散。用一支lml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取lml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6

不同稀释度的土壤溶液，注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管。

( 3 ) 涂布：将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种稀度，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6，三管土壤稀释液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。从土壤中分离微生物的操作过程，用无菌玻璃涂棒，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5~l0min，使菌液浸入培养基。

( 4 ) 培养：将高氏I号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28℃温室中培养3~5d，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2~3d。

( 5 ) 挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基斜面上，分别置28℃和37℃温室培养。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

2 平板菌落计数（活菌计数）

( 1 ) 编号：取无菌平皿9套,分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6各3套。另取6支盛有4．5ml无菌水的试管,排列于试管架上,依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

( 2 ) 稀释：用1ml无菌吸管精确地吸取0．5ml大肠杆菌悬液放入10-1的试管中,注意吸管尖端不要碰到液面,以免吹出时,管内液体外溢。然后仍用此吸管将管内悬液来回吸吹三次,吸时伸入管底,吹时离开水面,使其混合均匀。另取一支吸管自10-1试管吸0．5ml放入10-2试管中,吸吹三次,……其余依次类推。整个稀释过程如图Ⅷ-3。

( 3 ) 取样：用3支1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液0．2ml,对号放入编好号的无菌培养皿中。

( 4 ) 倒平板：于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中,倒入溶化后冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基约10—15ml,置水平位置,迅速旋动混匀,待凝固后,倒置于37℃温室中培养。

( 5 ) 计数：培养24小时后,取出培养皿,算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数,并按下列公式进行计算：

每毫升中总活菌数=同一稀释度三次重复的菌落平均数×稀释倍数×5

一般选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释度计算每毫升的菌数最为合适。同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很悬殊。由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中总活菌数也不能相差悬殊,如相差较大,表示试验不精确。

平板菌落计数法,所选择倒平板的稀释度是很重要的,一般以三个稀释度中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。

平板菌蓓计数法的操作除上述的以外,还可用涂布平板的方法进行。二者操作基本相同,所不同的是涂布平板法是先将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板,待凝固后编号,并于37℃温室中烘烤30分钟左右,使其干燥,然后用无菌吸管吸取0．2ml菌液对号接种于不同稀释度编号的培养皿中的培养基上,再用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀,平放于实验台上20—30分钟,使菌液渗透入培养基内,然后再倒置于37℃的温室中培养。

来自参考文献有机物料腐熟剂对堆肥发酵过程中微生物菌群的影响

1.4分离方法

1.4.1系列稀释称取样品10g(精确到0.01g)，加入带玻璃珠的100 mL无菌水中，静置20 min，在旋转式摇床上200 r/min充分振荡30 min，即成母液菌悬液(基础液)。用无菌移液管分别吸取5.0 mL上述母液菌悬液，加入45 mL无菌水，按10n进行系列稀释，依次得到10-1，10-2，10-3，10-4，10-5,10-6稀释倍数的菌悬液。

1.4.2加样及培养每个样品取3个连续适宜的稀释度，分别吸取不同稀释度菌悬液0.1 mL，加至预先制备好的固体培养基平板上，用涂布棒在培养基表而将菌液来回推散涂抹均匀。每一稀释度重复3次，于适宜的条件下培养。

1.4.3菌落计数真菌和放线菌培养温度为28-30℃，细菌培养温度为37 ℃。细菌、真菌、酵母菌培养时间为2d，放线菌培养时间为4 d。