基因载体的选择与构建
学案1：3.2.1 目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建
第2节第1课时目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建【课标要求】阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
【核心素养】1．科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。
2．科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
【新知探究】一、目的基因的筛选与获取1．目的基因(1)概念：用于改变______________或获得____________________等的基因。
(2)实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是________________。
2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的________和________的基因中进行筛选。
(2)实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的________，也对Bt基因的表达产物——________有了较为深入的了解。
(3)认识基因结构和功能的技术方法：________技术、________数据库、________工具。
3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是________________的缩写，它是一项根据________________的原理，在体外提供________________的各种组分与反应条件，对________________进行大量复制的技术。
(2)条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种________、四种________、________________。
(3)过程：①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA________________。
②复性：温度下降到50 ℃左右时，________通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中________________在耐高温的________的作用下加到引物的________′端合成子链。
载体构建的基本步骤
载体构建的基本步骤载体构建目的基因克隆引物设计pcr质粒（载体）提取质粒选择提取步骤质粒与目的基因双酶切选择内切酶摸索酶切条件（时间和温度）电泳检测及回收纯化步骤载体与目的基因连接转化感受态细胞制备转化步骤阳性单克隆筛选上述转化得到的菌液接种到筛选培养基中过夜培养挑菌并菌液pcr上述菌液pcr有结果的菌液送测，送测结果与预期相符则该载体构建成功。
一、原理依赖于限制性核酸内切酶，dna连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体dna进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
二、操作步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取两个装有液体培养基的3ml试管（视情况而定），向每根试管中加入40-100μL菌株，摇匀过夜。
2、提质粒（也就是载体）按照质量增强颗粒试剂盒中的说明操作（根据情况在洗脱的最后一步再清洗1-2次）。
3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂量（单位：UL）质粒所需内切酶10反应缓冲液2限制性内切酶1h2o7所需将加好的ep管置于37℃保温1-2h。
（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4.电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。
回收凝胶：使用琼脂糖和缓冲液逐个制备凝胶。
切割凝胶后，回收目标产物，并具有纯化目标产物的功能；试验凝胶：琼脂糖和缓冲液按1:2的比例制备。
以测试目标波段是否与预期一致。
切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的dna溶液纯化；产物纯化是将较纯的dna溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。
5.载体与靶基因的连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。
3.2.1获取目的基因与构建基因表达载体(教学设计)-高中生物人教版(2019)选择性必修3
新教材生物学人教版选择性必修3 生物技术与工程第3章第2节教学设计第3章基因工程第2节基因工程的基本操作程序第1课时获取目的基因与构建基因表达载体目录一、核心素养对接二、必备知识三、探究实践四、深化归纳五、应用创新第3章基因工程第2节基因工程的基本操作程序第1课时获取目的基因与构建基因表达载体一、核心素养对接1．结合实例，采用文字和图示方式说明基因工程的基本操作程序。
2．运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等。
3．结合模式图说出基因表达载体的组成，并理解构建目的。
二、必备知识（一）培育转基因抗虫棉的四个步骤1．目的基因的筛选与获取。
2．基因表达载体的构建。
3．将目的基因导入受体细胞。
4．目的基因的检测与鉴定。
（二）目的基因的筛选与获取(第一步)1．目的基因(1)概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2)实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因。
2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
(2)实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt 基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。
(3)认识基因结构和功能的技术方法：测序技术、序列数据库、序列比对工具。
3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)原理：DNA半保留复制。
(2)DNA复制所需的基本条件参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶(体外用高温代替) 打开DNA双链DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料DNA聚合酶催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸(3)过程基于PCR的过程，请回答下列问题：①过程Ⅰ为变性，该阶段的温度为90 ℃以上，目的是使双链DNA解聚为单链。
②过程Ⅱ为复性，该阶段的温度为50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③过程Ⅲ为延伸，该阶段的温度为72 ℃左右，该过程需要在耐高温的DNA聚合酶的作用下，利用4种脱氧核苷酸为原料，根据碱基互补配对原则从子链的3′端延伸合成新的DNA链。
人教版高中生物学选择性必修3生物技术与工程课后习题 第3章 筛选和获取目的基因与构建基因表达载体
第3章第2节第1课时筛选和获取目的基因与构建基因表达载体A级必备知识基础练1.利用PCR技术从某种生物的基因组DNA中获取目的基因。
有关这一过程,下列说法错误的是( )A.以含有目的基因的DNA片段作为模板B.目的基因的一段核苷酸序列已知,以便根据这一序列合成两种引物C.有足够的脱氧核苷酸作为原料D.加入足够数量的DNA连接酶进行指数式扩增2.对RNA病毒进行检测时可以采用实时荧光RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)的方法,RT-PCR的具体过程如图。
下列叙述错误的是( )A.过程①以mRNA为模板合成单链DNAB.过程②③拟对单链cDNA进行n次循环的扩增,理论上需要n个引物BC.游离的脱氧核苷酸只能从引物的3'端开始连接D.该技术用于对某些微量RNA病毒的检测,可提高检测的灵敏度3.PCR技术是在DNA聚合酶的作用下,在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物技术。
下列叙述正确的是( )A.双链DNA在高温下氢键和磷酸二酯键断裂形成2条DNA单链B.温度降低后,单链DNA和引物结合的部分碱基序列相同C.以2条DNA单链为模板,以4种NTP为原料,经耐高温酶在高温下合成2个新的DNAD.设置PCR仪的温度进行反应可重复循环多次,DNA呈指数式扩增4.关于基因表达载体构建的叙述,下列说法不正确的是( )①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA ③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止④所有基因表达载体的构建都是完全相同的A.②③B.①④C.①②D.③④5.在重组DNA技术中,将外源基因导入受体细胞,通常是利用质粒作为载体。
下列关于质粒的叙述,正确的是( )A.质粒是一种只存在于原核细胞中的结构简单的环状DNA分子B.目的基因直接导入受体细胞则难以在受体细胞中表达C.目的基因只有通过质粒整合到受体细胞的DNA中才能表达D.大多数天然质粒都不需要人工改造,可以直接作为载体使用6.在基因工程的操作过程中,获得重组质粒不需要( )①DNA连接酶②限制酶③RNA聚合酶④具有标记基因的质粒⑤目的基因⑥四种脱氧核苷酸A.③⑥B.②④C.①⑤D.①②④7.某研究所的研究人员将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌细胞内,来表达产生生长激素。
构建载体基本步骤
载体构建流程
1．基因的获得
酶切回收
2．回收
A．酶切回收：一般做50-100ul 体系，然后跑电泳回收，回收量一般为30ul。
B．PCR回收：一般做总体系为100-200ul的PCR量（用高保真酶：如PFU酶、KOD PLUS 酶），分成约50ul/管，然后上PCR仪。
跑电泳回收，约30ul。
酶切回收，做100ul体系，直接过回收柱回收DNA片段。
3．连接
连接体系总量一般为10-20ul。
12℃-16℃过夜。
4．转化
一般转化DH5α感受态，10-15ul 连接液转化到50ul感受态中。
冰浴1h 热休克42℃ 90 秒
冰浴5分钟加200ul LB液，37℃振摇1 h
铺相应抗性的平板。
置37℃孵箱，培养12h.
5．挑克隆
从平板上挑取数个克隆，于相应抗性的LB中，37℃培养12h.
6．抽提质粒
手工抽提质粒，一般溶于30ulTE或EB。
7．鉴定
A．酶切鉴定：一般用什么酶装上的，就用什么酶鉴定。
但原则是选用相对便
宜的酶。
选择原来载体上没有而基因上有的酶切位点与载体上另一酶切位
点共同鉴定。
一般鉴定选择2-4组酶，来确定构建的载体是否正确。
B．PCR鉴定：一般扩增目的条带。
也可扩增载体和目的条带连接处的片段。
重组载体构建的方法和步骤
重组载体构建的方法和步骤
1. 选择载体，首先需要选择合适的载体，常用的载体包括质粒、病毒、人工染色体等。
选择载体时需要考虑载体大小、复制方式、
宿主范围等因素。
2. 线性化载体，将所选载体进行线性化处理，通常采用限制性
内切酶对载体进行切割，生成线性化的载体。
3. 外源基因插入，将待插入的外源基因与线性化载体进行连接。
这一步通常需要利用DNA连接酶或者DNA重组酶来实现。
4. 载体转化，将重组后的载体导入到宿主细胞中。
这一步通常
采用转化、转染或者电穿孔等方法。
5. 筛选正常重组子代，经过载体转化后，需要进行筛选以获得
正常重组的子代细胞。
通常采用抗生素筛选或者标记基因筛选的方式。
6. 鉴定重组子代，对筛选得到的细胞进行PCR、酶切、测序等
方法进行鉴定，确保重组载体的构建成功。
总的来说，重组载体构建的方法和步骤包括选择载体、线性化载体、外源基因插入、载体转化、筛选正常重组子代和鉴定重组子代。
这些步骤需要严格操作，并且需要根据具体实验情况进行调整和优化。
希望这些信息能够对你有所帮助。
1.2-2基因表达载体的构建(共15张PPT)【优秀课件】
1.日本那些再现曲水宴的表演，有着 不少“中 国元素”，但是 由于现 代年轻 人对古 代中国 文化了 解甚少 ，并不 知道哪 些元素 来自中 国。 2.本着保证校车安全的原则，公安机 关将会 同教育 行政等 部门对 校车驾 驶人进 行逐一 审查， 坚决清 退不符 合安全 规定的 校车驾 驶人。 3.山寨文化是一种平民文化、草根文 化，自 然有其 存在的 意义和 价值， 但山寨 产品的 泛滥则 是中国 知识产 权意识 不足的 揭露与 讽刺。
谢谢观赏 4.神舟7号宇宙飞船载着三位航天英雄胜利返回地球，这艘宇宙飞船是我们国家自行研制的，每一个中国人不能不为之骄傲。 5.这家工厂虽然规模不大，但曾两次 荣获省 科学大 会奖， 三次被 授予省 优质产 品称号 ，产品 远销全 国各地 和东南 亚地区 。 6.杭州湾跨海大桥是一座由我国自行 建造、 自行设 计、自 行管理 、自行 投资的 特大型 交通基 础设施 ，是我 国跨海 大桥建 设史上 的一个 重要里 程碑。 7、为防止东南亚地区发生的禽流感 传入我 国，国 家质检 总局和 农业部 今天联 合发出 通知， 自即日 暂行禁 止进口 来自疫 区的禽 类及其 产品。
基因工程的基本操作程序P8
目的基因的获取 方法
目的基因的获取可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工 的方法合成。1.从基因中获取2.利用PCR
技术扩增目 的基因
3.化学方法直
接人工合成
第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）
1.基因表达载体构建的
使目的基因在受体细胞中 稳定存在 ，并且可以遗传给下一代 使目的基因能够___表_达____和 发挥作用 。
1.下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是（ C ）
《载体构建流程》课件
案例三：物联网设备中的载体应用
要点一
总结词
要点二
详细描述
物联网设备中的载体构建主要关注设备的物理设计、通信 协议和数据传输等方面。
在物联网设备中，载体构建涉及设备的外观设计、内部结 构、通信协议选择和数据传输方案等。一个优秀的物理设 计能够确保设备的稳定性和耐用性；合理的通信协议选择 能够提高设备间的通信效率和稳定性；而高效的数据传输 方案则能够确保设备收集的数据能够及时准确地传输到中 心服务器进行处理。
使用调试技术定位和解决 载体构建过程中的错误和 异常，确保载体的稳定性 和可靠性。
04
载体构建的实际应用案例
案例一：网站建设中的载体应用
总结词
网站建设是载体构建的重要应用领域，通过合理的架构设计和内容规划，能够提高网站的可用性和用户体验。
详细描述
在网站建设中，载体构建主要涉及网站的页面设计、布局、导航、内容组织等方面。通过合理的页面设计，可以 提升网站的视觉效果和吸引力；合理的布局和导航设计，可以提高用户浏览和查找信息的效率；而合理的内容规 划，则能够确保网站提供的信息具有价值，满足用户需求。
载体制作
编程实现
根据设计稿，使用编程语言和工 具实现载体功能。
素材准备
准备所需的图片、音频、视频等 素材，确保内容质量。
测试与调试
在制作过程中，对载体进行测试 和调试，确保功能正常。
载体测试
功能测试
对载体的各项功能进行测试，确保其正常工作。
兼容性测试
测试载体在不同操作系统、浏览器等环境下的兼 容性。
案例四：游戏开发中的载体应用
总结词
游戏开发中的载体构建主要关注游戏画面的表现力、操 作体验和游戏机制等方面。
详细描述