快速蛋白质液相层析
高效液相色谱法在蛋白质分离检测中的应用_唐玲玲
1 HP LC 基本原理
HPLC 由液体输送系统、进样系统、色谱柱和检 测系统 4 部分所组成。输液泵将流动相以稳定的流速 （或压力） 输送至分析体系，在进入色谱柱之前通过 进样器将样品导入，流动相将样品带入色谱柱，在色 谱柱中各组分依照分配系数、吸附力大小、带电性 质，乃至分子量大小的差异而被分离，并依次随流动 相流至检测器，将检测到的信号送至数据系统记录、 处理或保存。随着 HPLC 技术的日趋成熟，它已成为 分离和检测蛋白质的重要工具。
Samira Roufik 建立了用 HPSEC 分析多种乳清蛋 白组成的方法，可以作为食品中添加乳清蛋白配方的 依据[12]。由于 HPSEC 相对温和的色谱条件，不会导 致蛋白质和多肽的变性，故常用作一些乳源性生物活 性多肽的制备，如用乳白蛋白和酪蛋白制备血管紧张 素抑制肽[13]，在对 β- 乳球蛋白体外降解的组分进行 分离分析时，采用 HPSEC 能够较好地保持产物多肽 的物理化学性质[14]。 2.5 高效疏水色谱 （high performance hydrophobic iinteraction chromatography，HPHIC）
层析的原理
层析的原理层析是一种常见的分析方法，它基于物质在不同条件下的吸收、反射、透射或散射特性的差异，通过对样品进行多角度或多波长的照射和检测，得到关于样品内部结构和组成的信息。
层析技术广泛应用于化学、生物、医药、环境等领域，为我们提供了重要的分析手段。
层析的基本原理是根据样品中不同成分的物理性质差异，利用外加的能量或波长对样品进行照射，然后通过测量样品在不同条件下的吸收、反射、透射或散射等现象，从而推断出样品的组成和结构信息。
在层析分析中，常见的方法有气相层析、液相层析和固相层析等。
其中，气相层析是利用气体载体将样品中的成分分离出来，液相层析是利用液体载体将样品中的成分分离出来，固相层析是利用固体载体将样品中的成分分离出来。
这些方法都基于样品中不同成分的分配行为，通过调节各种条件如温度、压力、流速等，使得不同成分在载体中的分配系数不同，从而实现样品的分离和分析。
层析的分离原理主要包括亲和性、分配性和排斥性。
亲和性层析是根据样品中不同成分与固定相之间的相互作用力差异进行分离，例如离子交换层析、亲和层析等；分配性层析是根据不同成分在液相或气相中的分配系数差异进行分离，例如气相层析、液相层析等；排斥性层析是根据不同成分与固定相之间的亲疏水性差异进行分离，例如反相层析、亲水层析等。
层析的应用范围非常广泛。
在化学领域，层析技术可以用于分离和纯化化合物，如制药工业中的药物分离和提纯；在生物领域，层析技术可以用于分离和纯化生物大分子，如蛋白质、核酸等；在环境领域，层析技术可以用于水质、大气等样品中有机和无机物质的分离和检测。
层析技术的发展一直在不断推进。
随着分析仪器的进步和新的分析方法的出现，层析技术在分离和分析领域的应用将会更加广泛。
例如，高效液相层析（HPLC）和气相色谱层析（GC）的出现，使得分离速度和分辨率更高，灵敏度更好；超高效液相层析（UPLC）和超高效气相层析（GC）的出现，进一步提高了分离效率和分辨率；多维层析的发展，使得复杂样品的分离更加容易。
gpc原理
gpc原理GPC原理是指凝胶过滤、离心沉淀和电泳分离这三种方法在蛋白质分离中的应用。
GPC即Gel Permeation Chromatography，又称为Gel Filtration Chromatography，中文名为凝胶渗透色谱法。
GPC是一种基于分子大小分离的液相层析技术，主要用于分离高分子化合物，如蛋白质、核酸、多糖等。
凝胶过滤色谱法是GPC原理中的第一步。
凝胶过滤色谱法是利用凝胶孔隙的分子筛作用，将样品中的大分子分离出来。
样品在溶剂中通过凝胶柱时，大分子无法通过凝胶的孔隙，只能在柱中停留，而小分子可以通过凝胶的孔隙流出柱外。
因此，通过凝胶过滤可以将不同分子大小的化合物分离开来。
离心沉淀是GPC原理中的第二步。
离心沉淀是将样品在离心的作用下分离出不同密度的组分。
样品在离心机中高速旋转时，分子按照不同的密度沉淀到离心管的不同位置，从而实现分离。
离心沉淀常用于分离细胞、细胞器和蛋白质等生物大分子。
电泳分离是GPC原理中的第三步。
电泳分离是利用电场的作用将样品中的化合物分离出来。
样品在电场中运动时，不同分子的运动速度不同，从而实现分离。
电泳分离可用于分离DNA、RNA、蛋白质等。
GPC原理可以应用于许多领域，如生物化学、药物研发、环境监测等。
在生物化学中，GPC可以用于蛋白质的分离纯化和质量检测；在药物研发中，GPC可以用于药物的分子量测定和药物的纯化；在环境监测中，GPC可以用于分离和检测污染物。
GPC原理是一种基于分子大小分离的液相层析技术，可以用于分离高分子化合物，如蛋白质、核酸、多糖等。
凝胶过滤、离心沉淀和电泳分离是GPC原理中的三种分离方法，可以分别应用于不同的领域。
GPC原理在生物化学、药物研发、环境监测等领域具有广泛的应用前景。
生物制药技术中的过滤与纯化方法介绍
生物制药技术中的过滤与纯化方法介绍在生物制药技术中，过滤与纯化是非常重要的步骤，它们用于从复杂的混合物中分离出所需的生物制剂。
这些技术可以帮助提高产品的纯度和质量，并且在制药工艺中起到关键作用。
本文将介绍生物制药技术中常见的过滤与纯化方法。
一、过滤方法1. 微滤：微滤是一种利用孔径大小为0.1-10微米的微细滤膜或滤器来分离溶液中的微小颗粒和悬浮物的方法。
该方法可以去除细胞碎片、细菌和大多数病毒等微生物颗粒，使溶液更加清澈透明。
微滤常用于前处理步骤，如澄清发酵液和细胞培养基。
2. 超滤：超滤是一种利用孔径大小为0.001-0.1微米的滤膜或滤器来分离分子和溶质的方法。
该方法可以去除分子量较大的蛋白质和多糖等大分子物质，同时保留较小分子物质。
超滤常用于蛋白质纯化、多糖提取和分离等步骤。
3. 离心过滤：离心过滤是利用旋转离心机产生离心力，将混合物中的固体颗粒或大分子物质沉淀到离心管或离心滤芯中的过滤方法。
离心过滤可以高效地去除悬浊物和颗粒，并可以在非常短的时间内完成分离过程。
它常用于快速蛋白质纯化、病毒颗粒提取等步骤。
二、纯化方法1. 亲和层析：亲和层析是一种基于生物分子之间特异性结合的分离纯化方法。
它利用靶分子（如抗体或配体）与某种特定的配对分子（如抗原或亲和剂）之间的亲和力进行选择性识别和分离。
亲和层析通常具有高选择性和高纯化效果，但对于大规模生产来说操作成本较高。
2. 杂交层析：杂交层析是一种依据目标物分子的细菌或细胞表面融合蛋白与其针对性抗体或配体间的亲和性进行分离纯化的方法。
这种方法可以通过调整条件，如洗脱缓冲液pH或盐浓度，来实现目标物的选择性吸附和洗脱。
杂交层析适用于大规模生产，并具有较低的成本。
3. 高效液相层析（HPLC）：高效液相层析是一种基于溶液相亲和性进行分离的方法。
它利用高压输送系统和特定的填料，将混合物中的分离物质通过不同的物理或化学性质将其分离出来。
HPLC可用于溶质的快速分离和纯化，广泛应用于生物制药领域。
2021药学考研配套生物化学考研真题与解析
2021药学考研配套生物化学考研真题与解析一、大题问答题解析1．假定某蛋白相对分子质量为180KDa，其一级结构可能是直线式的也可能是闭环式的。
请分析是否有可能的简单的合理方法加以鉴别？[中山大学2009研] 答：可以用Sanger反应或Edman反应对蛋白质的N末端氨基酸进行测定。
Sanger反应中，FDNB可以与肽链N末端氨基酸的α-氨基反应生成黄色的DNP-氨基酸。
经Sanger反应若该蛋白的一级结构是直链式的，则可产生黄色的反应；若该蛋白是闭环式的，由于N末端没有α-氨基，则不能出现黄色的反应。
而Edman反应中，肽链N末端氨基酸的α-氨基可与苯异硫氰酸酯反应生成PTH-氨基酸，用三氟乙酸处理释放出PTH-氨基酸，再用有机溶剂萃取出来，通过色谱分析可以鉴定出PTH-氨基酸。
经Edman反应后，若能测出N末端氨基酸，则该蛋白为直链式；若测不出，则该蛋白为闭环式。
另外，理论上讲，如果知道序列，可以找一种合适的蛋白酶切断某一位点，再进行电泳，若该蛋白是闭环式，则电泳结果只产生一条带，且大小不变；若是直链式，则会产生两条带，分子量加起来正好180KDa。
缩写中文名称缩写应用HPLC 高效液相层折氨基酸、多肽和蛋白质等的分离纯化FPLC 快速蛋白质液相层析蛋白质、多肽及多核苷酸的分离纯化SDS-PAGE SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量ELISA 酶联免疫吸附测定测定抗原或抗体RT-PCR 逆转录-聚合酶链反应扩增cDNA2．试写出下列生化名词缩写的中文名称以及它们在生物化学中的应用。
（1）HPLC （2）FPLC （3）SDS-PAGE （4）ELISA （5）RT-PCR （6）HIC （7）IEF 。
[南京大学2008 研]答：如表1-1所示：表1-13．某一蛋白纯化后，凝胶过滤层析显示其分子量为300000。
若在6mol/L 盐酸胍存在条件下对该蛋白进行凝胶过滤层析，只获得一分子量为50000的蛋白峰。
关于胶原蛋白纯化几种方法的论述
关于胶原蛋白纯化几种方法的论述胶原蛋白是一种在组织修复和再生中起关键作用的蛋白质。
纯化胶原蛋白对于研究其结构、生物学功能以及制备相关生物材料是必不可少的。
在胶原蛋白的纯化过程中，可以采用多种方法，包括离心、电泳、柱层析和亲和纯化等。
首先，离心是最常用的初步分离方法之一、胶原蛋白的提取通常从组织样品中开始，通过机械方法破碎组织，然后对混合物进行高速离心，以分离胶原蛋白。
这种方法可以消除非溶解的细胞碎片和其他杂质，但无法将胶原蛋白与其他蛋白质分离。
其次，电泳是一种常用的纯化方法。
传统电泳分离方法依靠蛋白质分子在电场中的电荷和尺寸差异来进行分离。
胶原蛋白的特定pH值和分子量使得其迁移速度与其他蛋白质不同，因此可以通过电泳方法进行纯化。
然而，由于胶原蛋白的水溶性较低，它常常以多聚体形式存在，因此电泳分离时容易形成聚集体，导致分离效果不佳。
柱层析是一种常见的高效液相层析技术，也是胶原蛋白纯化中常用的方法之一、通过将样品在柱层析填料中与填料上的固定相相互作用，将胶原蛋白与其他蛋白质分离。
柱层析可以根据分子大小、电荷、亲和力等选择不同的层析填料，以实现目标蛋白质的有效分离。
对于胶原蛋白的纯化，常用的柱层析方式包括凝胶过滤层析、离子交换层析和亲和层析等。
其中凝胶过滤层析常用于分离胶原蛋白与其他蛋白质之间的大小差异，离子交换层析则利用胶原蛋白的电荷差异进行分离，而亲和层析则通过特定配体与胶原蛋白结合来实现分离。
综上所述，胶原蛋白的纯化方法包括离心、电泳、柱层析和亲和纯化等多种方法。
通过选择合适的纯化方法，可以有效地分离纯化目标胶原蛋白，并为后续的研究和应用提供高质量的样品。
然而，每种方法都有其优缺点，因此在选择纯化方法时需要综合考虑实验目的和样品特性。
在未来的研究中，还有待进一步发展更高效、更精确的胶原蛋白纯化方法。
蛋白质研究技术
N-末端测定
C-末端测定
还原法：C-末端氨基酸用硼氢化锂还原成相应的α-氨基醇
羧肽酶A
羧肽酶法：最有效、最常用
羧肽酶B 羧肽酶C 羧肽酶Y
过甲酸氧化法：将二硫键氧化成磺酸基
二硫键的断裂
巯基化合物还原法：将二硫键还原成巯基，然后用烷基化试 剂如碘乙酸保护巯基，防止其重新被氧化
酸水解：是主要方法，多用HCl，同时辅以碱水解；所 氨基酸组成的测定： 得氨基酸不消旋，但Trp全部被破坏，Ser，Thr，Tyr部 分破坏，Asn和Gln的酰氨基被水解，生成Asp和Glu； 胰蛋白酶：专一性强，断裂Lys或Arg的羧 基参与形成的肽键 糜蛋白酶：断裂Phe，Trp，Tyr，Leu 等疏水氨基酸的羧基端肽键
补充知识: 层析的基本原理 1、层析:即色层分析,亦称色谱。 固定相（静相） 2、层析系统的组成 流动相（动相） 3、分配定律：当一种溶质在两种给定的互不 相溶的溶剂中分配时，在一定的温度下达 到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一 常数，即分配系数Kd. Kd=Ca/Cb, a:动相， b：静相， C:浓度 有效分配系数： Keff=Ca.Va/Cb.Vb
Edman化学降解法：用Edman试剂PITC与游离氨基作用生 成PTH-氨基酸，并可用各种层析技术分离；用此法降解， 一次可连续测出60-70个氨基酸残基的序列；工作量大， 操作麻烦；现改用蛋白质测序仪。
肽段的氨基酸测序
酶解法：利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，有困难 质谱法：质谱仪 由核苷酸序列推定法：mRNA cDNA ，推出 cDNA 的核苷酸序列，然后推测出蛋白质的氨基酸序列
4.2 柱层析 4.2.1 凝胶过滤层析
4.2.2 离子交换层析
4.2.3 亲和层析
9种层析分离纯化方法详解
9种层析分离纯化方法详解层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。
所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。
当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。
与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。
反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。
分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。
按层析原理可将层析分为以下9种：1、亲和层析利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。
将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，性无关组分随流动相流出。
改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。
亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。
具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素等。
亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。
亲和层析纯化的分离原理特点：亲和层析具有高选择性、高纯度、快速、浓缩等特点，在重组蛋白的分离中多作为第一步的粗纯，实现对绝大部分杂质蛋白的去除。
2、离子交换层析采用具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆交换的性质来分离离子型化合物的方法。
主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。
不同蛋白质的等电点（pI，isoelectric point）特性，使在不同pH缓冲液条件下所带正/负净电荷不同，选择不同的离子交换柱实现分离。
层析技术的应用
一、层析技术的原理和分类（一）层析技术的原理层析法是目前广泛应用的一种分离技术。
本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。
现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。
层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。
所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。
当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。
与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。
反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。
分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。
（二）层析法分类见表16-5～7（三）层析法的特点与应用流动相液体气体液体液-液层析法气-液层析法固定相固体液-固层析法气-固层析法表16-5按两相所处状态分类层析法是根据物质的理化性质不同而建立的分离分析方法。
根据层析峰的位置及峰高或峰面积，可以定性及定量。
层析法与光学、电学或电化学仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度或质量，同时绘出层析图。
层析仪与电子计算机联用，可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间。
由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。
近年来，已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法。
在医药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面也得到了广泛的应用。
名称分离原理吸附层析法组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附剂，各能力不同分配层析法各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不同离子交换层析法固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂亲和力不同凝胶层析法固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同亲和层析法固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份分离表16-6按层析原理分类名称分离原理柱层析法固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离薄层层析法将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组份分离纸层析法用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离薄膜层析法将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的分离表16-7按操作形式不同分类二、层析法实验技术（一）凝胶层析法凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。
大学生物化学简答题总结(蛋白质)免费
大学生物化学简答题总结(蛋白质)免费第二章蛋白质蛋白质分类1、根据蛋白质分子的外形，可以将其分作3类。
①球状蛋白质：分子形状接近球形，水溶性较好，种类很多，可行使多种多样的生物学功能。
②纤维状蛋白质：分子外形呈棒状或纤维状，大多数不溶于水，是生物体重要的结构成分，或对生物体起保护作用，如胶原蛋白和角蛋白。
有些可溶于水，在一定的条件下聚集成固态，如血纤维蛋白原。
还有一些与运动机能有关，如肌球蛋白。
有些纤维状蛋白质是由球蛋白聚集形成的，一般归类于球蛋白，如微管蛋白和肌动蛋白。
③膜蛋白质：一般折叠成近球形，插入生物膜，也有一些通过非共价键或共价键结合在生物膜的表面。
生物膜的多数功能是通过膜蛋白实现的。
2、根据分子组成可将蛋白质分为两类。
（1）简单蛋白质：仅由肽链组成，不包含其它辅助成分的蛋白质称简单蛋白质（simple protein），按照溶解度的差别，可将简单蛋白质分为7类，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白（2）结合蛋白质：结合蛋白质（conjugated protein）由简单蛋白质和辅助成分组成，其辅助成分通常称为辅基。
根据辅基的不同，结合蛋白质可分为5类：核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、色蛋白和金属蛋白。
3、按功能将蛋白质分为10类。
（1）酶：酶是具催化活性的蛋白质，是蛋白质中种类最多的类群，新陈代谢的每一步反应都是由特定的酶催化完成的。
（2）调节蛋白：许多蛋白质具有调控功能，这些蛋白质称为调节蛋白。
其中一类为激素，如调节动物体内血糖浓度的胰岛素，刺激甲状腺的促甲状腺素，促进生长的生长素等。
另一类可参与基因表达的调控，它们能激活或抑制基因的转录或翻译。
（3）贮存蛋白质：有些蛋白的生物功能是贮存必要的养分，称贮存蛋白。
例如，卵清蛋白为鸟类胚胎发育提供氮源。
许多高等植物的种子含高达60%的贮存蛋白，为种子的发芽准备足够的氮素。
铁蛋白能贮存铁原子，用于含铁蛋白如血红蛋白的合成。
（4）转运蛋白质：主要有两类，一类存在于体液中，如血液中的血红蛋白转运氧气，血清蛋白转运脂肪酸。
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虽然 ÄKTA purifier 100的自动化程度极高，但该仪器极易受外界因素的影
响甚至损坏，使用该仪器必须严格按使用规范和操作手册进行。
1、开机。确认将 ÄKTA purifier 100主机与电脑电源连接在稳压电源输出端。
先开 ÄKTA，后开电脑。
2、关机。确认退出所有程序后，关闭电脑后关闭 ÄKTA purifier 100主机电
源。
3、所有流动相和样品均应用 0.22 微米孔径滤膜过滤，以防堵塞纯化柱。
4、所有管路均应保存在 20%乙醇中，防霉防菌。
15、系统泵循环洗涤管应置于 20%乙醇中，定期更换，以保护泵头。
基本操作
1、进样方法选择
自动运行 Run/Instant Run——运行预编好的方法 (Run) 或直接运行模板
(Instant Run)。手动运行 Manual——利用手动窗口 (Manual) ，手工执行系统命
令。自动加手动——在自动运行过程中可同时执行手动命令如有冲突，以后执行
的命令为准。
2、方法编辑
编辑方法(Method Wizard, Run Setup, Text Instruction)；编辑层析柱列表
(Column List)；编辑缓冲液配方 (BufferPrep Receipt)。
3、运行启动
自动运行；手动运行。
4、收集方式
收集器自动收集样品；手动收集样品；收集器自动峰收集。
5、结果处理
文件管理；积分；曲线操作
6、结束实验
实验结束后，必须运行系统泵管清洗后，才能关机。
操作实例——脱盐
1、洗泵。更换样品对应的 buffer，运行 pumpwash，25ml 约1.5min。
2、装柱。调流速至1ml/mi，alarmpresure为 0.3 mpa。将进水导管连接至柱
入水端，取下柱出水端堵头，当buffer 流出时，将柱出水端接入固定架。
3、平衡柱子。调流速至 3ml/mi。用平衡buffer 清洗 loop 进样环。
4、上样。用注射器取样、排气后推入loop 进样环。
2 3
5、调零。
6、数据保存设定。点击Record on，注意本次即将运行样品后的数据保存的
位置，并注意运行后及时将数据复制至安全位置，否则超过 10 个后，会被后续
运行样品数据覆盖。
7、设定样品收集方式。主要有收集器自动收集样品、手动收集样品、收集
器自动峰收集等，根据样品和个人喜好确定。
8、进样运行。点击 inject 运行，注意收集器是否运行。