蛋白质层析新填料应用与选择
蛋白纯化层析柱填装
蛋白纯化层析柱填装
首先，选择合适的层析柱是非常重要的。
根据需要分离的蛋白
的大小、电荷、亲和性等特性，选择不同类型的填料，比如离子交
换柱、凝胶过滤柱或亲和层析柱等。
填料的粒径和柱子的尺寸也需
要根据样品的特性和分离要求来选择。
其次，准备填充柱子的缓冲液和样品。
缓冲液的选择取决于蛋
白的稳定性和溶解性，确保填充柱子前样品已经被适当地溶解和净化。
在填充柱子之前，需要先平衡填充柱子，通常使用与样品相同
的缓冲液。
填充柱子时，需要小心操作，确保填充均匀，避免气泡的产生。
填充柱子的速度应该适中，以免填料受到损坏或形成不均匀的层析床。
填充结束后，需要进行压缩，以确保填充物的密实度和柱子的
稳定性。
最后，进行层析实验前，需要对填充好的柱子进行质量控制，
比如检查柱子的均匀性和密实度，以及检测柱子的渗透性和分辨力。
只有填充好的柱子通过了质量控制，才能进行后续的层析实验。
总的来说，蛋白纯化层析柱填装是一个复杂而关键的步骤，需要仔细选择填料和柱子，合理准备样品和缓冲液，并严格控制填充和质量，以确保最终获得高质量的纯化蛋白。
GST-FF层析填料说明书
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow原理谷胱甘肽S-转移酶是一种经常被使用的Tag，可以使含有谷胱甘肽S-转移酶的重组蛋白的纯化和检测更加容易，为了使产物的纯化更简单，GST融合蛋白的一步纯化是可用的。
纯化简要概述结合缓冲液：140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4 , 1.8mM KH2PO4, pH 7.3洗脱缓冲液：50mM Tris-HCl, 10mM 还原型谷胱甘肽, pH 8.01，用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。
2，上样。
3，用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合物质都被冲洗出柱子。
4，用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。
5，用5-10倍体积的结合缓冲液冲洗柱子。
使用注意1，样品上样期间和洗脱期间，保持较低的流速是非常重要的，因为GST和谷胱甘肽互相间的结合动力学作用是相对较低的。
其结合容量是依赖于蛋白质的特性，因此其产量是依赖于蛋白质的类型而变化的。
使用较低的流速或者将样品反复流过柱子几次，或许可以提高产量。
2，柱子的重复使用取决于样品的特性。
对同一样品重复使用时，需考虑避免交叉污染的问题。
在位清洗1，用2-3倍柱体积的，高端pH值为（0.1M Tris-HCl,0.5M NaCl,pH8.0）和低端pH值为（0.1M 醋酸钠,0.5M NaCl,pH4.5）的缓冲液交替冲洗柱子。
2，重复循环3次。
3，立即用3-5个柱体积的结合缓冲液再平衡柱子。
沉淀蛋白质的去除1，用2倍柱体积的6M的盐酸胍冲洗柱子。
2，立即用5倍柱体积的结合缓冲液冲洗柱子。
通过疏水性互相作用结合到柱子上的物质的去除1，用3-4倍柱体积的70%的乙醇冲洗柱子（或者2倍柱体积的非离子型去污剂如1%的曲拉通-100冲洗柱子）。
2，立即用5倍柱体积的结合缓冲液冲洗柱子。
当填料在室温状态下暴露在0.1M柠檬酸盐（pH4.0），0.1M NaOH，70%的乙醇或者6M盐酸胍2小时后，其结合能力没有显著地丢失。
离子交换填料选择
离子交换填料的选择、处理和保存(1)离子交换填料的选择离子交换填料的种类很多，离子交换层析要取得较好的效果首先要选择合适的离子交换填料。
首先是对离子交换填料电荷基团的选择，确定是选择阳离子交换填料还是选择阴离子交换填料。
这要取决于被分离的物质在其稳定的pH 下所带的电荷，如果带正电，则选择阳离子交换填料；如带负电，则选择阴离子交换填料。
例如待分离的蛋白等电点为4，稳定的pH 范围为6－9，由于这时蛋白带负电，故应选择阴离子交换填料进行分离。
强酸或强碱型离子交换填料适用的pH 范围广，常用于分离一些小分子物质或在极端pH 下的分离。
由于弱酸型或弱碱型离子交换填料不易使蛋白质失活，故一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换填料。
其次是对离子交换填料基质的选择。
前面已经介绍了，聚苯乙烯离子交换填料等疏水性较强的离子交换填料一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。
而纤维素、葡聚糖、琼脂糖等离子交换填料亲水性较强，适合于分离蛋白质等大分子物质。
一般纤维素离子交换填料价格较低，但分辨率和稳定性都较低，适于初步分离和大量制备。
葡聚糖离子交换填料的分辨率和价格适中，但受外界影响较大，体积可能随离子强度和pH 变化有较大改变，影响分辨率。
琼脂糖离子交换填料机械稳定性较好，分辨率也较高，但价格较贵。
另外离子交换填料颗粒大小也会影响分离的效果。
离子交换填料颗粒一般呈球形，颗粒的大小通常以目数(mesh)或者颗粒直径(mm)来表示，目数越大表示直径越小。
前面在介绍交换容量时提到了一些关于交换剂颗粒大小、孔隙的选择。
另外离子交换层析柱的分辨率和流速也都与所用的离子交换填料颗粒大小有关。
一般来说颗粒小，分辨率高，但平衡离子的平衡时间长，流速慢；颗粒大则相反。
所以大颗粒的离子交换填料适合于对分辨率要求不高的大规模制备性分离，而小颗粒的离子交换填料适于需要高分辨率的分析或分离。
这里特别要提到的是，离子交换纤维素目前种类很多，其中以DEAE-纤维素(二乙基氨基纤维素)和CM-纤维素(羧甲基纤维素)最常用，它们在生物大分子物质(蛋白质，酶，核酸等)的分离方面显示很大的优越性。
实验室层析填料应用指南
实验室层析填料应用指南实验室层析填料是一种用于气相色谱分析的重要工具，它能够有效地分离和识别混合物中的组分。
层析填料的选择对于实验室分析结果的准确性和精确性起着至关重要的作用。
本文将为您提供一份实验室层析填料的应用指南，旨在帮助您选择适合的填料并获得优质的分析结果。
首先，我们将从填料的化学特性方面来讨论选择填料的考虑因素。
填料的化学性质应与待分离混合物的性质相匹配。
一般来说，填料的极性应与混合物中最具极性的化合物相对应。
例如，对于极性混合物分析，常见的填料选择包括聚酰胺、硅胶、氨基硅胶等。
而对于非极性混合物分析，可以选择如为聚二甲基硅氧烷（PDMS）等非极性填料。
其次，填料的粒径也是很重要的考虑因素。
填料的粒径直接影响分离的分辨率和速度。
填料颗粒过大会导致分离效果差，颗粒过小则会导致分离速度慢。
因此，根据实验要求和需要，选择合适的填料粒径是很关键的。
一般来说，填料的粒径范围可以从3到10微米不等。
除了化学性质和粒径外，填料的稳定性也是值得考虑的因素。
填料应能在一定的温度和压力下稳定运行，不发生热解、蒸发或变形。
同时，填料应具有良好的机械强度和化学稳定性，以避免因填料破碎或溶解而影响分析结果。
此外，选择填料时还应考虑到其表面积和孔径大小。
填料的孔径越大，表面积越小，对大分子的分离效果较好；孔径越小，表面积越大，对小分子的分离效果较好。
因此，根据待分离混合物中化合物的大小和重量，选择合适数值的表面积和孔径大小的填料是非常重要的。
最后，考虑到实验室层析填料的成本问题也是很重要的。
填料的成本应与实验预算相匹配，并且填料的耐用性和再生性也是需要考虑的因素。
有些填料可以通过再生来延长使用寿命，这样可以节约成本并减少对环境的影响。
综上所述，选择适合的实验室层析填料是获得准确和精确分析结果的关键。
选择填料时需要考虑化学特性、粒径、稳定性、表面积和孔径大小以及成本等因素。
通过合理选择填料，可以提高实验室层析分离的效果，并获得可靠的分析结果。
亲和层析预装柱和填料选择指南
亲和层析预装柱和填料选择指南亲和层析是一种常用的生物分离技术，其基本原理是利用靶分子与具有特殊亲和性的固定相相互作用，实现目标分子的分离纯化。
该技术被广泛应用于蛋白质纯化、分析、制备以及药物研发中。
本文将为您介绍亲和层析预装柱和填料选择的指南。
首先，亲和层析的预装柱种类繁多，如Ni-NTA、GST、MBP、Protein A、Protein G、Protein L等。
选择合适的预装柱主要取决于目标蛋白的性质和亲和配体的选择。
以下是几种常见的亲和层析预装柱及其适用性。
1. Ni-NTA柱：适用于His标记蛋白的纯化。
该柱上的Ni2+离子与His标记相互作用，实现蛋白的选择性吸附。
Ni-NTA柱广泛应用于蛋白质纯化和表达系统中。
2. GST柱：适用于GST标记蛋白的纯化。
GST标记用于表达系统和蛋白质亲和纯化，其独特的亲和性可与谷胱甘肽S转移酶 (glutathione S-transferase，GST)结合。
3. MBP柱：适用于MBP标记蛋白的纯化。
麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein，MBP)可通过特异性辅助蛋白结合一些亲和配体，实现蛋白的纯化和表达。
4. Protein A/G/L柱：适用于免疫球蛋白 (IgG) 的富集。
Protein A/G/L分别与IgG的不同部位结合，用于IgG的富集和纯化，常用于抗体生产和医学诊断。
其次，填料选择也是亲和层析中一项重要的技术选择。
填料是用于填充柱体的固体介质，其性能直接影响到层析分离的效果。
以下是一些常见的填料种类及其特点：1.球形填料：球形填料具有均一的颗粒尺寸和良好的柱层分离性能。
常见的球形填料有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。
2.凝胶填料：凝胶填料通常用于分离较大分子，如蛋白质、核酸等。
常见的凝胶填料有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。
3.磁性填料：磁性填料具有较高的分离效率和灵敏度，常用于磁性亲和层析。
磁性填料结合预装柱可以实现高通量的自动化分离和纯化。
Protein G层析填料说明书
Protein G Sepharose Fast Flow原理蛋白质G ，来自G 链球菌组的细胞表面蛋白，是III Fc-受体型蛋白。
蛋白质G 通过非免疫机制结合抗体的Fc 区域。
蛋白质G 特异性的结合IgG 的Fc 区域，但是对于一些多克隆抗体IgGs 对人源的IgG 抗体能够有更强的结合。
在标准缓冲液条件下，蛋白质G 能够结合所有的人源性的亚类抗体和所有鼠源性的IgG 亚类抗体，包括鼠的IgG ，或者兔的IgGa 和IgGb 。
进行一个分离操作结合缓冲液：20mM 磷酸纳，pH7.0洗脱缓冲液：100mM 甘氨酸，pH2.7中和缓冲液：1M Tris-HCl ，pH9.01， 用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。
2， 用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。
3， 上样，流速为1-4ml/min （1ml 的柱子），或者5ml/min （5ml 的柱子）。
收集流穿片段。
4， 用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合物质都被冲洗出柱子（紫外检测器在280nm 波长检测）。
5， 用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。
洗脱液立即用中和缓冲液（0.06ml~0.2ml 1MTris-HCl ，pH9.0每毫升馏分）中和至中性。
6， 立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子 。
使用注意1， 样品需要离心（10000g/20min ）去除细胞和细胞碎片。
离心下来的上清经过一个0.45μm的滤膜过滤。
2， 来自多数物种的IgGs 和亚类，在接近生理pH 值和离子强度的条件下，可以结合到蛋白质G 上。
对于特别物种IgG 的最佳结合条件，应该查阅近期的文献。
3， 当pH 值为2.7或者低于2.7时，大多数种类的免疫球蛋白能从蛋白质G 上被洗脱下来。
4， 洗脱完成后，立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子非常重要。
在通常使用的水溶性缓冲液中都是稳定的。
储存用20%的乙醇在中性pH值的条件下冲洗介质和柱子，在4°~8°条件下储存。
层析填料选择
A = Macroprep High Q B = Fractogel EMD, TMAE 650 C = SuperQ 650 D = Q HyperD E = STREAMLINE Q XL F = Q Sepharose XL
19 / GE /
MacroCap SP
－－专为较大的生物分子设计的阳离子交换填料 •特别适合PEG修饰后的蛋 白的纯化
10 / GE /
Sepharose 系列填料
－快速大分子凝胶过滤首选 • Sepharose的结构：
β-D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合所形成的线 性多聚糖。 在形成过程中由单独的多糖链先形成双螺旋，然后聚 集成胶束，胶束之间形成微孔，其大小取决于胶束的 多少，即琼脂糖的浓度。 pH为4-9之间稳定。 琼脂糖凝胶对样品的吸附 作用很小，并且机械强度 和孔穴稳定性都很好。 Sepharose: Separation Pharmacia agrose
Mono P：专为层析聚焦设计的弱阴离子交换填料
21 / GE /
Capto基架系列离子交换填料
－－新一代快流速高载量填料
+
基架 • • • • 表面延伸剂
+
O
SO
3
配基:磺酸乙烷基
改良交联琼脂糖---刚性更强、传质速度更快 线状葡聚糖表面延伸剂---载量提高 颗粒大小：平均90um,75um,40um 配基：Q、S、DEAE、Adhere、MMC、ImPres
7
2 4 5 3 6
100,000 1,000,000 10,000,000
1. Superdex™ Peptide 2. Superdex 75 3. Superdex 200 4. Sephacryl™ S-100 HR 5. Sephacryl S-200 HR 6. Sephacryl S-300 HR 7. Sephacryl S-400 HR
d301大孔树脂 蛋白质 c18
d301大孔树脂蛋白质 c18下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢！本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注！Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!D301大孔树脂蛋白质C18为一种常用的层析填料，具有较大的孔径，适用于蛋白质的分离和纯化。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Conventional Surface
Protein
Porous particle
Grafted Layer of a Hydrophilic Polymer
高动态载量和更快的质量传递
Capto Q/SP ImpRes --快流速高分辨率 填料
40 μm粒径 Capto™ ImpRes
同样适用于使传统IMAC填料金属离子脱落的样品
Sample kindly provided by Drs.Wolfgang Knecht (CVGI iMed Bioscience) and Paul Wan (Discovery Sciences), AstraZeneca R&D, Mölndal, Sweden
蛋白质层析新填料应用与选择
Imagination at work.
做好分离纯化需要什么？
层析设备
控制软件
技术方案
填料
生物分子特性
Ion exchange chromatography (IEX) 离子交换层析
净电荷 生物学亲和性
Tag, PTM
Affinity chromatography (AC) 亲和层析
Capto Core 700 优点:
• 高纯度和高回收率 • 高载样量和更短的接触时间 • 操作灵活适合工艺放大 高生产能力的同时提高工艺 的经济性
Capto Core 700 vs Gel Filtration
LAIV virus purification
HCP and fragmented Virus in void DNA in total volume Virus in FT HCP and fragmented DNA in CIP
+ 分子质量小，免疫原性低 + 易于进入实体瘤 + 容易表达，可以使用酵母或者大肠杆菌
- 抗原结合活性相对较弱 - 半衰期短
Capto Core 700 凝胶过滤和吸附层析复合模式
天然琼脂糖基架外壳
-没有表面基团 -排阻大分子>700kDa
激活内核-带辛氨基 (多通道配体)
-目标物穿透
-进入孔内的小分子被捕捉 -通过CIP再生
Zstab
Zstab Zstab Zstab Zstab
N6 N3
Cys
SuRe Ligand for Mabselect SuRe Mr 26748
OH O O O OH
OH O O O O + HS–
Prot A
S – ligand
Single-point attached thioether bond
for reduction to below detection limit of < 3 organisms /mL
0.5 M NaOH effectively inactivates bacteria, mold and yeast
endotoxin (ng/mL)
Inactivation of endotoxin
Media
Sepharose™ 4 FF
Virus Recovery (HA*) [%]
100
Host Cell Protein Removal [%]
95
Amount of loaded feed material [CV]
Organism C. albicans A. niger P. aeruginosa S. aureus
1
Type yeast mold bacteria gram bacteria gram +
Time1 1h 1h 1h 1h
On average, 0.5 M NaOH results in 0.5 LRV higher inactivation versus 0.1 M NaOH
SDS-PAGE (reduced conditions 1. LMW-SDS Marker Kit 2. 0 mM EDTA 3. 2 mM EDTA 4. 10 mM EDTA
Sample kindly provided by Drs.Wolfgang Knecht (CVGI iMed Bioscience) and Paul Wan (Discovery Sciences), AstraZeneca R&D, Mölndal, Sweden
纯化CHO细胞培养基中分泌表达的蛋白 Ni Sepharose™ excel vs. Ni Sepharose 6 FF
Sample: 250 ml mPAI-1-(his)8 secreted into GIBCO™ CD CHO medium, pH 7.0 RESULTS Blue – Ni Sepharose excel packed in Tricorn ™ 5/50: Purity >98% Green - Ni Sepharose 6 FF packed in Tricorn 5/50: No recovery of target protein
Increase 小粒径，大改变
Superdex 200 Increase 更高的分辨率，更短的纯化时间
ed resolution
0.5 ml/min -> 48 min
Decreased runtime
0.5 ml/min -> 48 min
Superdex 200 10/300 GL:
R
O O CH2OH O O O O HO O O
6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0
Capto Family (Medium porosity)
R
Increasing flow rate
Capto高流速琼脂糖
表面修饰
减少非特异性吸附 控制内表面积 通过提高内表面积提高载量
表面衍生物
Final concentration and clarification IMAC with conventional Ni resin
Final concentration and clarification
Time savings IMAC with conventional up to 50% Ni resin
3 小时
0.5 M NaOH 有效灭活病毒，降低生物负荷及内 毒素
Increased viral inactivation
10.0 LRV 5.0 0.0 HIV BVDV CPV BHV POL 0.5 M SV-40 MLV ADV 0.1 M
Increased bioburden control
SDS-PAGE (reducing conditions) 1. LMW-SDS Marker Kit 2. Start material 3. Ni Sepharose excel, flowthrough 4. Ni Sepharose excel, wash 5. Ni Sepharose excel, eluate 6. Ni Sepharose 6 FF, flowthrough 7. Ni Sepharose 6 FF, wash 8. Ni Sepharose 6 FF, eluate
0.5 ml/min -> 48 min
1.5 ml/min -> 16 min
Superdex 200 Increase 10/300 GL:
磁感应蛋白MagR
Superose 6 Increase
专为大蛋白和蛋白复合体纯化设计
Protein A抗体亲和填料
MabSelect SuRe (2005) MabSelect (2001) MabSelect Xtra (2005) MabSelect SuRe LX (2012) rmProtA Sepharose FF
Ni Sepharose excel简化工作流程
Conventional workflow NEW workflow
Cell culturing
Time
Cell culturing
Removal of cells
Removal of cells
Diafiltration
Ni Sepharose™ excel/ His Mag Sepharose excel
Ni Sepharose™ excel在位清洗
• 即使在0.01HCl中孵育 1个星期镍离子都不会 脱落
•可进行 1 M NaOH在 位清洗
MabSelect SuRe™ LX 动态载量较 MabSelect SuRe提高45%
human IgG monoclonal antibodies
抗体和抗体片段 全抗 Fab ScFv Dabs
E E
N21 N23 N52 N43 N28 N11
cell wall binding domain
C C X X
IEGRNC
Native protein A Mr ~ 42 000
D D
A A
B B
rProtein A Mr 34 300
B domain Mutant (Asp replaced with alkali-stable amino acid )
时间更短，分辨率更高，用途更广
Superdex 200 Matrix Fractionation range Flow/pressure properties Average bead size pH stability Regular use Short term (CIP) Superdex 200 Increase Cross-linked agarose and dextran Molecular weights from 10 000 to 600 000 Regular 13 µm pH 3 – 12 pH 1-14 Rigid beads with high flow/pressure resistance 8.6 µm