蛋白质层析技术
蛋白质纯化与层析技术
蛋白质纯化与层析技术蛋白质纯化是生物化学和生物技术领域中至关重要的过程，用于从混合物中分离和纯化目标蛋白质。
层析技术作为蛋白质纯化的关键步骤之一，它不仅可以选择性地将目标蛋白质从混合物中分离出来，还可以去除杂质，获得高纯度的蛋白质样品。
一、蛋白质纯化的基本原理蛋白质纯化的基本原理是根据不同的理化性质，如分子量、极性、电荷等特征，选择合适的纯化方法分离目标蛋白质。
常见的蛋白质纯化方法包括离心、超滤、电泳、沉淀和层析等。
离心法是通过调整离心速度和时间，根据不同蛋白质的分子量和密度差异，将目标蛋白质和非目标蛋白质分层离心，进而实现纯化。
超滤法则是利用滤膜对溶液进行筛选分离，减少蛋白质和其他分子之间的尺寸和质量差异，从而实现蛋白质的纯化。
电泳法是根据蛋白质在电场中不同的电荷和分子量特性，使其在凝胶上移动的速度不同，从而实现纯化和分离。
沉淀法则是通过添加适当的沉淀剂，使蛋白质凝聚成颗粒，经过离心后分离出来。
而层析法是根据蛋白质与层析介质之间的相互作用，通过选择性吸附和洗脱，将目标蛋白质从混合物中纯化出来。
二、层析技术的分类与原理层析技术是在纯化过程中广泛使用的方法，根据不同的工作原理和介质特性，可以将其分为几种不同的类型。
常见的层析技术包括吸附层析、凝胶层析、亲和层析和离子交换层析等。
吸附层析是通过目标蛋白质与特定层析介质之间的亲和力，使目标蛋白质被吸附在介质上，从而实现纯化。
凝胶层析则是利用介质中多孔性凝胶矩阵的分子筛效应，根据蛋白质的分子量和形状特征，通过不同的渗透效应将目标蛋白质分离出来。
亲和层析是利用目标蛋白质与特定配体（如抗体）之间的特异性结合，使目标蛋白质选择性地与介质上的配体结合，从而实现纯化。
离子交换层析则是基于蛋白质表面的电荷特性，通过电荷间的相互作用，使目标蛋白质与介质表面的离子互相吸附和洗脱，实现纯化。
三、层析技术的操作步骤和优化层析技术的操作步骤通常包括前处理、样品加载、洗脱和再生等步骤。
蛋白质层析技术
蛋白质互作分析
利用蛋白质层析技术分析蛋白质之间的相互作用，揭示生命活动 的分子机制。
蛋白质复合物分离
通过蛋白质层析技术分离蛋白质复合物，研究其结构和功能，有 助于深入了解细胞内复杂的生物过程。
药物靶点筛选
在药物研发过程中，蛋白质层析技术用于筛选药物作用的靶点， 为新药研发提供有力支持。
THANKS FOR WATCHING
荧光法需要使用荧光标记物，操作相 对复杂，成本较高。
免疫学检测法
免疫学检测法利用抗原-抗体反应的特异性，通过抗体对目标蛋 白质进行识别和检测。常用的免疫学检测法包括酶联免疫吸附 试验（ELISA）、免疫印迹和免疫沉淀等。
免疫学检测法具有高灵敏度、高特异性的优点，适用于蛋白 质的定性分析和定量分析。但该方法需要制备特异性抗体， 操作相对复杂，成本较高。
蛋白质层析技术的分类
根据固定相的不同
可分为凝胶电泳、滤纸电泳、薄层电 泳等。
根据分离机制
可分为等电点沉淀法、离子交换法、 亲和层析法等。
蛋白质层析技术的应用
01
蛋白质组学研究
用于分离和纯化蛋白质，为蛋白质 组学研究提供基础。
临床诊断
用于检测和分离疾病相关蛋白质， 辅助疾病诊断和治疗。
03
02
生物药物研发
疾病标志物检测
肿瘤标志物检测
蛋白质层析技术用于检测肿瘤标志物，辅助肿瘤的诊断和预后评 估。
感染性疾病标志物检测
通过蛋白质层析技术检测感染性疾病标志物，有助于快速诊断和指 导治疗。
代谢性疾病标志物检测
蛋白质层析技术在代谢性疾病标志物检测中也有广泛应用，如糖尿 病、肥胖症等疾病的标志物检测。
蛋白质相互作用研究
缺点
蛋白质层析法
蛋白质层析法是一种用于分离和纯化蛋白质的技术，它基于蛋白质在不同条件下在固定相和流动相中的分配系数不同来实现分离。
层析技术的基本原理是将混合物中的各组分根据其物理或化学性质（如分子大小、电荷、亲和性等）在不同相中的不同分布和迁移速率来实现分离。
以下是一些常见的蛋白质层析技术：
1. **凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography）**：
- 也称为分子筛层析，利用凝胶的多孔结构将分子按大小分离。
小分子可以进入凝胶内部的孔隙，而大分子则被排阻在外部，因此迁移速度不同。
2. **离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）**：
- 根据蛋白质的电荷性质（如阴离子或阳离子交换树脂）来分离蛋白质。
带正电的蛋白质可以与阴离子交换树脂结合，而带负电的蛋白质则与阳离子交换树脂结合。
3. **亲和层析（Affinity Chromatography）**：
- 利用蛋白质与特定配体（如金属离子、生物大分子等）的特定相互作用来分离蛋白质。
4. **反相层析（Reverse Phase Chromatography）**：
- 基于蛋白质在不同极性溶剂中的不同保留行为来实现分离。
通常使用非极性固定相（如C-18柱）和极性流动相。
5. **尺寸排阻层析（Size Exclusion Chromatography，SEC）**：
- 也称为凝胶渗透层析，分离蛋白质混合物中的不同分子量蛋白质。
6. **疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）**：
- 利用蛋白质与固定相之间的疏水作用来分离蛋白质。
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目
CONTENCT
录
• 层析技术简介 • 层析技术在蛋白质分离纯化中的应
用 • 层析技术原理 • 层析技术的应用实例 • 层析技术的优缺点及展望
01
层析技术简介
层析技术的定义
层析技术
是一种分离和纯化混合物中各组分的方法，基于各 组分在固定相和流动相之间的分配差异进行分离。
05
层析技术的优缺点及展望
层析技术的优点
分离效果好
层析技术能够根据分子间的吸附、分配等作用力 的差异，将混合物中的组分进行有效的分离，得 到高纯度的产物。
适用范围广
层析技术可以应用于不同性质的混合物分离，如 有机物、无机物、离子、蛋白质等，具有广泛的 适用范围。
分离过程可重复
层析技术是一种物理分离方法，不涉及化学反应 ，因此分离过程可以重复进行，适用于大规模分 离和制备。
凝胶过滤层析原理
原理概述
凝胶过滤层析是一种基于分子 大小差异的分离技术。通过不 同孔径的凝胶介质，不同大小 的分子会以不同的速度通过凝 胶，从而实现分离。
应用范围
凝胶过滤层析常用于蛋白质、 多糖等大分子物质的分离和纯 化。
技术特点
操作简便、分离效果好、分辨 率高。
离子交换层析原理
01 02
原理概述
1950年代
随着凝胶技术的发展，凝胶层 析、电泳等新型层析技术逐渐 兴起。
1970年代至今
层析技术不断改进和创新，应 用范围越来越广泛，成为生物 化学领域中重要的分离分析方 法。
层析技术的分类
根据固定相和流动相的物理状态
可分为液相层析和气相层析。液相层析又可分为液-固层析和液液层析，是生物分子分离纯化中最常用的技术。
浅谈层析法分离蛋白质
浅谈凝胶柱层析分离蛋白质根据对生物产物分离工程的学习及所做的相关实验，我对这方面的知识有了粗浅的认识。
根据所学知识我发现生物产物分离的方法多种多样，不同产物其分离方法不同，同种产物又有多种分离方法。
就所做的实验而言，我对层析法分离蛋白比较感兴趣。
以下是我对这种方法的了解：层析法是分离蛋白质通用的方法。
其原理都是通过蛋白质在流动相和固定相之间的性质不同而达到分离的效果。
层析法可分为纸层析法，凝胶过滤层析法，离子交换层析法等。
凝胶过滤层析法最为常用，在分离蛋白质时只需要把蛋白质混合液加到凝胶珠的上部，并加少许洗脱液来产生一定的液压是蛋白质能向下运动，在凝胶柱底部用试管接流下来的蛋白质液体，进行比色。
此种方法很简单，不需要贵重仪器，但分离的蛋白质不是很好，这些液体仍然是很多蛋白质的混合液，通过比色来确定目的蛋白含量的最高值。
这种方法只能对蛋白质进行一些粗筛。
近期做了一个实验应用到了凝胶层析即凝胶柱层析分离蛋白质，这个实验主要是运用凝胶层析分离蓝色葡聚糖2000kb和牛徐清蛋白的。
这个实验应注意：1、装柱时要注意凝胶的流速，不宜过快，同时要保证凝胶能充分的沉淀且分布的比较均匀; 2、凝胶溶胀所用的溶液应与洗脱用的溶液相同，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果; 3、样品的浓度和加样量的多少。
是影响分离效果的重要因素。
样品浓度应适当大，但大分子物质的浓度大时，溶液的黏度也随之变大，会影响分离效果，要兼顾浓度与黏度两方面。
加样量和加样体积越少分离效果越好，加样量一般为柱床体积的1%-2%，制备用量一般为柱床体积的20%-30%；4、凝胶用完后可再加入防腐剂低温保存；5、叠氮钠属于有毒性物质，在使用过程中需注意安全。
凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。
分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。
利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。
蛋白质层析原理
蛋白质层析原理
蛋白质层析是一种常用的分离和纯化蛋白质的技术。
其原理基于蛋白质在不同条件下与固定相之间的相互作用差异。
层析柱内填充有具有特定性质的固定相，通常为聚合物凝胶或亲和性树脂。
当样品溶液通过层析柱时，蛋白质会根据其相互作用类型和特性与固定相发生不同程度的相互作用，从而实现分离和纯化。
根据蛋白质与固定相的相互作用类型不同，蛋白质层析可分为几种常见的类型，包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和性层析和逆向相层析。
离子交换层析利用蛋白质对固定相上带电离子交换作用的差异进行分离。
凝胶过滤层析则是根据蛋白质的大小选择性通过凝胶网孔的大小进行分离。
亲和性层析则利用蛋白质与特定配体之间的特异性结合作用进行分离。
逆向相层析则是根据蛋白质与固定相之间的亲水或疏水性质差异进行分离。
层析过程中，样品溶液先经过等离子体预处理以去除杂质物质，然后通过进样器加入层析柱。
通过改变流动相（即溶剂体系）、温度和pH等条件，可以调节蛋白质与固定相之间的相互作用，从而实现目标蛋白质的分离和纯化。
蛋白质可以通过梯度洗脱或者洗涤缓慢地从固定相中洗脱出来，不同分子量或特性的蛋白质被分离开来。
蛋白质层析是一种灵活、高效的蛋白质纯化技术，可以根据蛋白质的特性和需求选择不同的层析类型和条件，获得高纯度的蛋白质样品。
同时，与其他蛋白质纯化方法相比，层析技术对
蛋白质产量和质量的影响相对较小，因此广泛应用于生物医学、生物工程和生物化学等领域中的蛋白质研究和工业生产中。
根据分子大小分离蛋白质的层析技术
根据分子大小分离蛋白质的层析技术蛋白质是生命体内重要的组成部分，在生命的各个过程中都发挥着至关重要的作用。
分离和纯化蛋白质，是开展蛋白质相关研究的前提和关键。
分子大小是影响蛋白质结构和功能的一个重要因素，因此，根据分子大小分离蛋白质的层析技术应用广泛。
胶体电泳是一种通过电场驱动带电粒子（涂层蛋白）在胶状介质中运动的技术。
随着电泳时间的推移，蛋白质会在胶体电泳中沿电场方向移动，并在不同位置出现带状。
这些带状代表了不同大小、电荷和形态的蛋白质，从而实现了蛋白质的分离和纯化。
凝胶过滤层析技术是基于蛋白质分子大小的一种分离技术。
它使用别称为Sephadex的高分子树脂作为填料，将蛋白质溶液通过柱子或柱状材料，使大分子蛋白质无法进入树脂孔隙，而小分子蛋白质则可以进入树脂孔隙内，从而实现了分离。
分子量越大的蛋白质会沿着柱子的表面流动，分子量较小的蛋白质会进入树脂颗粒内部，因此可以在凝胶孔隙中分子大小的差异进行分离。
离子交换层析技术是一种通过电荷相互作用分离蛋白质的技术。
该技术使用带正电或负电的固定颗粒，不同电荷的蛋白质会与固定颗粒进行相互作用。
通常情况下，具有相同荷负性的蛋白质将更紧密地结合于离子交换树脂中，并较难从中被洗脱出来。
使用不同盐浓度的溶液，可以通过离子交换层析进一步洗脱蛋白质。
亲和层析是一种利用蛋白质之间的特殊作用力进行分离的技术。
它是一种选择性纯化技术，通过特殊的柱子层析填料，将表面特异性结合的蛋白质吸附在固定颗粒的表面。
在分离过程中，具有特定亲和性的分子可以与填料表面固定的某些物质特异地结合。
与这些物质不结合的分子则在纯化过程中被排除。
亲和层析的优点是可以选择性纯化目标蛋白质。
总之，根据分子大小分离蛋白质的层析技术是一种重要的蛋白质分离和纯化技术。
通过不同的层析技术，可以针对不同的蛋白质特性实现利用分子大小、电荷和特殊作用力进行分离。
这些技术在学术研究、医学诊断和新药开发等领域都有广泛的应用。
层析法分离蛋白质的原理
层析法分离蛋白质的原理你知道吗？蛋白质那可是生命的重要组成部分呢！而层析法就是分离蛋白质的一把好手。
咱先来说说层析法到底是咋回事。
想象一下，蛋白质就像是一群性格各异的小伙伴，它们都想找到自己的专属领地。
层析法呢，就像是一个神奇的大舞台，给这些小伙伴们提供了展示自己的机会。
在层析过程中，有一根柱子，这柱子就像是一个神秘的通道。
蛋白质们从通道的一端进入，开始了它们的冒险之旅。
不同的蛋白质有着不同的特点，就像不同的人有不同的性格一样。
有些蛋白质跑得快，有些跑得慢；有些喜欢往高处走，有些则喜欢在低处徘徊。
那为啥蛋白质们会有不同的表现呢？这就得说说层析法的原理啦。
就好比在一场赛跑中，有的选手身轻如燕，跑得飞快；有的选手则比较笨重，跑得慢些。
蛋白质也一样，它们的大小、形状、电荷等特性决定了它们在层析柱中的运动速度和方向。
比如说，凝胶过滤层析就像是一个筛子。
大的蛋白质过不去那些小孔，只能在外面溜达，所以跑得快；小的蛋白质则能钻进小孔里，东逛逛西逛逛，就跑得慢啦。
这不就像我们走路一样吗？走大路肯定比走小路快呀！离子交换层析呢，则是根据蛋白质的电荷来分离它们。
带正电荷的蛋白质会被吸附在带负电荷的柱子上，带负电荷的蛋白质则会被吸附在带正电荷的柱子上。
这就好像磁铁的两极，同性相斥，异性相吸。
你想想，要是两个脾气不对付的人，肯定不愿意待在一起吧？蛋白质也是这样呢。
还有亲和层析，这就更有意思啦。
它就像是一个专门为蛋白质准备的相亲大会。
柱子上有一些特定的配体，只有那些和配体“看对眼”的蛋白质才会被吸附住。
其他的蛋白质呢，就只能继续往前走啦。
这就像我们找对象一样，得有感觉才行呀！总之，层析法分离蛋白质的原理就是利用蛋白质的不同特性，让它们在不同的条件下表现出不同的行为，从而实现分离。
是不是很神奇呢？下次你再看到蛋白质的时候，会不会想起这个神奇的层析法呢？说不定你还能想象出蛋白质们在层析柱里的冒险故事呢！。
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从动态载量看上样条件
• BSA在阴离子交换介质上的动态载量： • 吸附量对洗脱剂的非线性：动态载量对洗脱剂
强度远比对其洗脱体积敏感
2022/3/23
吸附蛋白的大小与动态载量
• 层析介质表面吸附功能基团的密度大大超过实 际用来吸附蛋白的量
• 小分子对层析介质表面吸附功能基团的密度更 加敏感
2. 蛋白样品的富集和浓缩 3. 脱气
➢ 纯化过程中样品处理
1. 脱盐和缓冲液交换 2. 去污剂的去除 3. 离子污染物的去除 4. 其它的处理和浓缩
2022/3/23
分离纯化机制
Charged Groups
(asp, glu, lys, arg, his) Ion Exchange and Chromatofocusing
• 无机化合物: 硅胶, 羟基磷灰石, 氧化锆
2022/3/23
聚合物基体(matrix)孔的结构
• 孔径分布:分配层析要求分布宽,均匀,相 应于低交联度
• 高交联度导致孔径分布偏向高,介质本身 微观不均匀性变大,适合大孔径高硬度吸 附层析
2022/3/23
孔的结构可分为三种类型
• 标志产品: SepharoseHP，Toyopearl； MacroPrep，UNOSphere，SOURCE； UNOQ，POROS
2022/3/23
影响分辨率的因素
➢ 柱效依赖于层析介质对样品的选 择性和分离带宽.
➢ 在多孔颗粒介质的柱子中带宽或 柱效表示为： H =2d+B/V+Cmd2V + Csd2V
▪ d=层析介质离子直径 ▪ =填充不规则因子 ▪ H = Plate height塔板高度或柱效 ▪ A = Eddy diffusion涡流扩散 ▪ B = Longitudinal molecular diffusion径向
Hydroxyapatite
Electrostatic Coordination complexesRepulsionGeometric charge distribution-
Size and Shape
Gel Filtration
2022/3/23
Binding Site
Biospecific Affinity Chromatography
蛋白质层析技术
2022/3/23
蛋白质层析介质
蛋白质层析技术
蛋白分离纯化平台
及单抗的分离纯 化
2022/3/23
蛋白质层析的原理和要点
2022/3/23
层析的概念
流动相
固定相 洗脱峰
2022/3/23
1 2 3
C流出组份 1 2 3
层析一般地是一种物理方法
• 层析的热力学分析：分配; 吸附等温线；吸 附---脱附（解吸附，洗脱）；线性和非线 性过程
Hydrophobic Region
(phe, trp, ile, leu, val, gly, ala, tyr)
Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC)
Thiol Groups
(cys) Covalent Chromatography
蛋白质层析介质基体 须具备的特性
• 右图:Sephacryl S-500 • 右上:白线段 10um • 右下:白线段0.5um
2022/3/23
化学组成:亲水多孔高聚物等
• 天然高分子多糖:纤维素,交联葡聚糖,琼 脂糖及共聚物----孔径分布宽,较软
• 合成高聚物:聚丙烯酰氨类,聚丙烯酸脂类 ,聚乙二醇聚丙烯酸脂共聚物,亲水性处理 的聚苯烯类
➢ 层析仪
o 蛋白分析和纯化实现的设备
2022/3/23
蛋白液相层析的一般程序
➢样品处理 ➢选择分离机制建立初步纯化流程 ➢流程优化 ➢放大 ➢Polishing(精细纯化)
2022/3/23
样品制备
➢ 一般性处理
1. 去处颗粒物——5 µm、2 µm、0.45 µm 分级过滤，0.2 µm除菌
• 层析的动力学分析：塔板理论（板高方程 ）
• 层析是最强有力的分离手段
2022/3/23
液相层析
➢ 生化分离技术，基因工程技术和免疫
学技术并称为生物技术
（Biotechnology） ➢ 液相层析是生物大分子分离纯化的最
重要手段
2022/3/23
蛋白液相层析的应用
➢ 已知和未知蛋白质的纯化
o 结构、动力学、药物作用靶点研究对 高纯蛋白的需要
扩散(可忽略) ▪ Cm = non-equilibrium mass transfer in the
mobile phase流动相非平衡物质转移 ▪ Cs = non-equilibrium mass transfer in the
生物兼容性：亲水性，大孔径.不会使生物 大分子失活，没 有生物化学毒性：过强吸 附，泄漏，氧化还原性
化学稳定性：在生物大分子存在的化学条件 下是稳定的. pH,络合物,巯基化合物…
必要的机械性能: 流体中的耐压性
2022/3/23
结构:典型层析介质的放大观察
• 下图:2%agarose gel 白 线段: 500nm
2022/3/23
基体孔结构决定传质特点
• 孔结构决定扩散速率：孔的开放性越大，扩散 越快，对层析的流速越不敏感；反之亦反
ห้องสมุดไป่ตู้2022/3/23
动态载量（Dynamic Capacity ）
• 动态载量是制备层析的 重要概念：层析过程是 偏离平衡态的，流速越 大，偏离越远，反之亦 反
• 动态载量是制备层析介 质的重要性能指标，更 快更高是人类活动的重 要目标
2022/3/23
层析介质颗粒度与动态载量
• 小颗粒传质更迅速，动 态载量更高
• IgG1在不同颗粒度的 Bio-Rad陶瓷性羟基磷灰 石上的动态载量比较
• Buffer-0.05M MES,pH6.5;
• Flow rate: 600cm/hr
2022/3/23
吸附动力学与动态载量
• 长程作用（库仑力）比短程作用（疏水相互作 用）受流速影响小些；粘度与动态栽量负相关
o 免疫学研究及酶免检测抗体抗原的制 备
o 基因工程药物生产
➢ 基因治疗对大量质粒的需要
2022/3/23
蛋白液相层析的构成
➢ 分析型层析柱和制备型层析柱
o 分析层析：上样量在吸附等温线的前至中段的线性范 围中，可以快速定量分析样品，建立纯化方法
o 制备层析：上样量在吸附等温线的中至后段的非线性 范围中，不同组分间的相互作用不可忽略，大量纯化 样品获得蛋白产物