基于PCR技术的miRNA定量检测方法陈新曾长英卢诚王文泉

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基于PCR技术的miRNA定量检测方法陈新曾长英卢诚王文泉

１结合ＰＣＲ与探针的定量检测技术
１．１ｓｔｅｍｌｏｏｐ和ｋｅｙｌｉｋｅ这两种技术的原理基本相同，首先以ｓｔｅｍｌｏｏｐ为ｔｅｍｌｏｏｐ技术主要例简要地介绍一下它的技术流程。Ｓ包括２个步骤： ① 设计一个可形成茎环结构的逆转录引物（ＲＴｐｒｉｍｅｒ），该引物３ ′ 端有６个碱基与成熟ｍｉＲＮＡ的３ ′ 端互补配对，逆转录合成第一链ｃＤＮＡ； ② ｍｉＲｃＤＮＡ与ＴａｑＭａｎ探针杂交，并利用设计好的正反向引物进行ＰＣＲ扩增，当引物ＰＣＲ延伸到ｔａｑＭａｎ探针与ｃＤＮＡ结合位置时，ＴａｑＭａｎ探针被置换，荧光基团和猝灭基团分离，随即触发荧光，ＰＣＲ反应体系中ＴａｑＭａｎ探针置换的越多，荧光信号越强，荧光信号的强弱与目标模板量之间存在一定的线性关系，通过荧光信号的收集与监测，即可确定ｍｉＲＮＡ的准确表达量（图２Ａ）。ｋｅｙｌｉｋｅ技术是在ｓｔｅｍｌｏｏｐ技术基础上做了一定的修改而形成的。两者的区别主要在以下３个方面。１．１．１逆转录引物的区别ｓｔｅｍｌｏｏｐ技术的逆转录引物为５ ′ ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＮＮＮＮＮＮ３ ′ ，由４４个碱基组成，其形成互补双链的ｓｔｅｍ部分由１４对互补碱基构成，Ａ＝Ｔ和Ｇ＝Ｃ对数目相同，有６个碱基与成熟ｍｉＲＮＡ互

定量检测microRNA的PCR分析方法[发明专利]

专利名称：定量检测microRNA的PCR分析方法专利类型：发明专利
发明人：叶邦策,尹斌成,于翠媛
申请号：CN201310291939.3
申请日：20130712
公开号：CN103320519A
公开日：
20130925
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种基于碱基堆积杂交原理的定量检测microRNA的PCR分析方法，包括以下步骤：利用靶标microRNA与DNA扩增模板结合后，通过碱基堆积杂交作用稳定了正向引物与DNA扩增模板的结合，在DNA聚合酶作用下延伸正向引物，在与反向引物共同作用下，引发PCR反应，得到双链DNA，染料SYBR Green I与双链DNA结合产生荧光信号，实时测定反应体系中的荧光信号强度，与标准工作曲线对比，计算出靶标microRNA的浓度。

该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单、成本低等特点，可广泛应用于组织，血液或细胞的生物样本中microRNA检测。

申请人：华东理工大学
地址：200237 上海市徐汇区梅陇路130号华东理工大学实验18楼711室/715室
国籍：CN
代理机构：上海新天专利代理有限公司
代理人：俞滢
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一种外泌体miRNA的定量检测方法[发明专利]

(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510488030.6(22)申请日 2015.08.10C12Q 1/68(2006.01)(71)申请人北京吉因加科技有限公司地址102206 北京市昌平区北清路生命科学园北大医疗产业园2号楼5层(72)发明人赵美茹吕小星易鑫管彦芳刘涛杨玲(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司 11002代理人王文君(54)发明名称一种外泌体miRNA 的定量检测方法(57)摘要本发明提供了一种外泌体miRNA 的定量检测方法，包括外泌体总RNA 提取、3’端和5’端特异性唯一标签接头连接、反转录合成cDNA 并进行PCR扩增、miRNA 文库的筛选纯化与上机测序、纠错算法的信息分析等步骤。

本发明方法基于特异性的唯一标签接头的标记，对每个原始模板进行区分，避免了扩增时分子间存在的偏好性，可以精确检测低于10拷贝以下的miRNA 分子，且特异性高，可用于肿瘤源性的外泌体miRNA 的检测，神经退行性疾病、心血管疾病，生育健康等领域的检测，可为疾病的早期筛查提供依据，还可应用于其他小RNA 精准定量检测领域。

具有广阔的应用前景和市场价值。

(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书3页说明书8页序列表1页附图1页CN 105063209 A 2015.11.18C N 105063209A1.一种外泌体miRNA的定量检测方法，包括以下步骤：(1)外泌体总RNA的提取；(2)3’端和5’端特异性唯一标签接头连接；(3)反转录合成cDNA并进行PCR扩增；(4)miRNA文库的筛选纯化与上机测序；(5)纠错算法的信息分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的特异性唯一标签接头连接是指在常规miRNA接头的基础上添加了8个随机的碱基N以及3个固定碱基CGA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)在RNA的3’端连接特异性唯一标签接头的序列为：CGANNNNNNNNAGAUCGGAAGAGACACGUCUGAACUCCAGUCAC；在5’端连接特异性唯一标签接头的序列为：UACACUCUUUCCCUACACGACNNNNNNNNCGA。

miRNA的常用检测方法研究

miRNA的常用检测方法研究miRNA (microRNA) 是一类长度约22个核苷酸的内源性非编码RNA，在细胞中起着重要的调控作用。

miRNA参与调控基因表达、细胞周期、代谢、增殖和凋亡等各种生物学过程，因此在许多疾病的发生发展中也扮演着重要角色。

miRNA的检测方法成为了当前研究的热点之一。

本文将介绍miRNA的常用检测方法，并对其优缺点进行探讨。

目前miRNA的检测方法主要包括定量PCR、芯片芯片技术、Next-generation sequencing(NGS)、蛋白质悬浊微球(Protein-coated-magnetic beads)和分子影像技术等。

以下将详细介绍各种方法的原理、步骤和特点。

第一种miRNA检测方法是定量PCR。

PCR是一种常用的核酸检测技术，通过链式反应扩增目标区域的DNA序列，基于PCR的miRNA检测技术可以分为两类：miRNA逆转录-定量PCR(RT-qPCR)和miRNA转录-定量PCR(TaqMan PCR)。

在RT-qPCR中，miRNA首先被逆转录成cDNA，然后通过PCR扩增cDNA，最后通过实时荧光技术检测PCR产物的数量。

TaqMan PCR则是直接对miRNA进行PCR扩增并检测。

这两种方法都具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，但需要提取RNA，且不能检测未知miRNA。

第二种miRNA检测方法是芯片技术。

芯片技术是一种高通量平行检测技术，能够同时检测数千种核酸分子。

miRNA芯片技术主要包括两类：杂交芯片和基于微阵列的miRNA检测芯片。

杂交芯片是通过杂交技术检测miRNA的表达水平，而基于微阵列的miRNA检测芯片则是通过检测miRNA与探针的结合情况来定量miRNA水平。

芯片技术具有高通量和高比较度的优点，但需要大量的样本，并且只能检测已知的miRNA。

第三种miRNA检测方法是Next-generation sequencing(NGS)。

双尾RT-qPCR技术——miRNA定量检测方案

双尾RT-qPCR技术——miRNA定量检测方案
传统检测miRNA的方法有Northern 印迹分析，微点阵(microarray)分析和实时定量PCR(quantitative Real-Time PCR)。

目前已有新的，升级版的基于PCR法的miRNA定量检测方法——双尾RT-qPCR。

首先，对以上三种传统检测miRNA的方法进行一个比较，如下：
那再一起来看看新的双尾RT-qPCR技术，这种方法是BioVendor最近一项新的技术，具有特别的RT引物机制，与其他方法相比，可提供出色的灵敏度和特异性，用于总的miRNA和piRNA的定量。

双尾RT-qPCR技术的优点如下：
1.高灵敏度（最多少于10个分子）
2.高特异性
1）适合于多种样本（血浆/血清，血液，组织等）中的miRNA检测和定量
血浆/ 血清/ 尿液/ 脑脊液/ 生物液体
新鲜组织，冷冻／福尔马林固定组织的
细胞，外泌体
2）通过折叠的系链连接的两个半探针（结合不同的microRNA片段）3）动态范围广（高达9 log）
4）在进行单重qPCR之前，可进行双管多重RT-PCR
5）定制化服务
3.检测流程简便
文章来源：艾美捷科技。

(完整版)microRNA定量PCR检测方法

microRNA 定量PCR检测实验设计●首先特异性检测：最常用的ABI公司的Taqman 探针法，其策略是采用发卡RT引物反转录，随后taqman探针做real-time。

ABI的TaqMan探针法，设计的是颈环引物，针对特定的microRNA，反转后以特定的引物和探针做荧光定量。

反转录引物和荧光定量引物及探针组成一个assay。

大多数研究的位点，都能在ABI网站上找到现成的assay。

TaqMan探针法检测灵敏度高，目前大多数文章中都采用的这种方法。

同时TaqMan探针技术是专利技术，所以相对较贵。

如果资金有限，可以使用SYBR 染料法代替，这方面很多公司都有相应的试剂盒，比如TIANGEN，TaKARA等，国内公司广州锐博或上海吉玛也可以，相对便宜一些。

●其次是非特异性方法，即总RNA加上poly A尾巴，再用poly T的引物做反转，然后用SYBR Green做荧光定量。

代表性的Qiagen方法是首先给miRNA加poly（A）+adapter，然后利用adapter的序列作为反向引物，miRNA本身为正向引物（或者5‘端修饰下）。

然后和普通real-time PCR一样进行就可以了。

这个可以自己设计，adapter就是一段随即引物，末端转移酶等。

具体可以搜下相关资料。

关于microRNA定量PCR的RT引物：●1、Oligo d(T)特异的RT引物QIAGEN产品为主由特异序列Oligo d (T)20左右兼并碱基V或VN组成。

所有miRNA可以公用一个Oligod(T)的RT引物但是RNA在反转录前需要进行末端Poly(A)加尾●2、茎环状结构的RT引物ABI产品为主由可以自身呈环茎状的特异序列6到8个miRNA3’端反向互补碱基组成。

(一条miRNA序列特异对应一个茎环状结构的RT引物1）stem-loop RT引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6个碱基即可。

基于qPCR的循环miRNA定量检测的方法探讨

ｔｍｅｒｈａｈｔｂｉｏｔｏｈｅＣｔａｕｓｏＲ一１ｎｓｌｍｎｌｓｒ７．２±１０ｎ５．５±１８ｅｐｃｉｅｙ．Ｃｔａ．ｉｓｍｏｅｔｎｔａｙＴｒｌｍｅｈｄ；ｔｌｅｆｍｉｚｖ６ｉｅｌａｄｐａｍａｗｅｅ２８ｘ．３ａｄ２７．３ｒｓｅｔｌｖ１ｖｕｓ０ｍｉ一２ｎｓｒｍｎｌｍａｗｅｅ２１ｅｆＲ１ｉｅｕａｄｐａｓｒ７．２土１３ｎ５６．５ａｄ２．９±２．４ｒｓｃｖｌ．Ｓｅｒｎｏｒｌｔｎｃｅｆｃｅｔｅｗｅｎｔｍｅａ．０ｅｐｅｔｅｙｐａｍａｃｒｅａｉｏｆｉｎｂｔｅｗｏｔｓｍｅｉｏｉｉｓｕｍｅｔｏｌｍａｍｉ一１ｓ０．８５，ｔｅｒｇｅｓｏｕｖｅｗｅｎＣｔＶＵＳａｄｌｇｃｎｅｔａｉｎｆｒｓｒａｌｉｔｄｐａｍａｓｏｄａｇｏｅｒｎｆｐａｓＲ６ｗａ８８ｈｒｓｉｎｃｒｅｂｔｅａｅｎｏｏｃｎｒｔｅｉｙｄｌｅｌｅｌｏｏｌｕｓｈｗｅｏｄ
【关键词】血清ｍｉＮ血浆ｍＲＡ实时定量ＰＲＲＡｉＮＣ
Ｓｕｙｏｕｎｔｔｅｄ￣ｃｏｆｉｕａｎｃｏＮＡｂｓｄｏＰＲ．ＡＸｅ—ｍｅａｏａｏｙｏｅｅａｕｇｒＢｏｎ，ｎｈｔｄｎｑａｔａｖｅｆｎｏｒｌｔｇｍｉＲａｅｎｑＣＭｕｉｉｉｃｃｉｒｉｂｒｔｒｆＧｎｒｌｒｅ．ＬＳｙ，ｅ＇ｇｒ＇，ｉｉｉ￣ｐｅ

miRNA定量方法

miRNA定量方法miRNA定量是研究miRNA表达水平的一种方法，它可以帮助我们理解miRNA在生物体内的功能以及相关的生物学过程。

目前，有多种miRNA定量方法可供选择，包括实时荧光定量PCR（qPCR）、Northern blot、原位杂交等。

以下将对这些方法进行详细介绍。

实时荧光定量PCR（qPCR）是miRNA定量的主要方法之一、它基于PCR原理，通过荧光信号测定目标miRNA的数量。

首先，对miRNA进行反转录，得到相应的cDNA。

然后，在PCR反应中，使用miRNA特异性引物和探针针对目标miRNA进行扩增和荧光探测。

最后，通过测量荧光信号的强度，可以定量目标miRNA的表达水平。

qPCR具有高特异性和敏感性，可以快速、准确地定量miRNA的表达水平。

另一种miRNA定量方法是Northern blot。

它是一种常用的分子生物学技术，可以检测miRNA的分子量和相对表达水平。

首先，将miRNA分离和富集，然后进行琼脂糖凝胶电泳分离。

之后，将miRNA转移到膜上，并与标记有亮氨酯的miRNA探针进行杂交。

最后，通过暴露于荧光显像仪中，可以观察到目标miRNA的带和相对表达水平。

虽然Northern blot方法比较耗时，但它可以同时检测多个miRNA，并提供关于miRNA大小和水平的重要信息。

原位杂交是一种用于检测miRNA分布和表达模式的方法。

它基于miRNA与mRNA的互补性配对，在组织或细胞级别上检测miRNA的表达。

首先，制备含有亲miRNA探针的标记物，并将其与靶组织或细胞进行杂交。

然后，使用染色或荧光染料进行可视化和观察。

原位杂交提供了关于miRNA在时间和空间上的表达变化的有价值的信息，并可用于探索miRNA与相关生物过程之间的关系。

此外，还有其他一些miRNA定量方法，例如基于序列特征的计算预测、芯片技术和测序方法。

计算预测方法通过分析miRNA序列的保守性和特征，预测和识别miRNA的存在和表达。

荧光定量技术及miRNA定量

荧光定量PCR技术及其在microRNA定量分析方面应用摘要荧光定量PCR技术是近几年在PCR技术基础上发展起来的一种核酸定性定量技术。

荧光定量 PCR 具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等特点, 扩大了PCR 的应用范围，成为分子生物学和医学研究中的重要工具。

microRNA是存在于真核生物中的一种大小为20-25nt的非编码RNA。

自2001年被发现以来，一直备受关注。

论文综述了荧光定量PCR 技术的原理、荧光定量PCR 实时定量检测系统及其在microRNA表达分析方面的应用。

关键词：荧光定量PCR 荧光染料探针标记 microRNA定量1前言荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

该技术是由美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，目前已经得到广泛应用。

它不仅实现了PCR技术从定性到定量的飞跃，更重要的是与常规PCR相比，它具有操作简便、快速高效、高通量、特异性强、灵敏度更高、重复性好、定量准确、自动化程度高、全封闭式反应等优点成为分子生物学和医学研究中的重要工具[1]。

microRNA( miRNA)是一类广泛存在于真核生物中, 不编码蛋白质的短序列RNA,长度为20-24nt。

成熟miRNA的5’端为磷酸基团, 3’端为羟基, 它通过与靶mRNA3’端非编码区特异性结合,引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译, 从而调低基因表达。

miRNAs在控制真核生物生长发育、新陈代谢和生理反应等方面起着重要作用。

除此之外, 多数miRNA还具有高度保守性、时序性和组织特异性[2-6]。

目前大量miRNA在真核生物中被发现, 但绝大多数miRNA的生物学功能研究尚显滞后, 而miRNA生物学功能研究的重要一环是探究miRNA在特定时期、特定组织及特定环境的表达特性, 进而实现miRNA对目标基因的调控。

一种直接对miRNA进行绝对定量检测的方法[发明专利]

专利名称：一种直接对miRNA进行绝对定量检测的方法专利类型：发明专利
发明人：徐凯,唐放,张耀艺,罗德伦,杨莉
申请号：CN201510740984.1
申请日：20151104
公开号：CN105331695A
公开日：
20160217
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种直接对miRNA进行绝对定量检测的方法，属于分子生物学领域，采用miRFLP测定法，其步骤包括：待测样本与动态miRNA标准混合均匀，经过miRNA逆转录、cDNA加尾、PCR同步扩增及PCR扩增产物的荧光片段长度多态性分析，在所述cDNA加尾步骤中，对适配寡聚核苷酸链3’末端进行修饰，降低反应背景信号，避免miRNA3’末端同源序列的干扰；采用生物素-琼脂糖链霉素偶联试剂或链霉素磁珠富集逆转录及PCR反应物，增加上样量，减低方法误差，加入细菌RNA作为保护试剂，降低测定误差，本方法可以对0.4μl的样本进行直接测定，在128个分子的测定水平，测定变动范围降低至9.9％，本方法测定的灵敏度显著提高，测定误差范围显著缩小。

申请人：成都诺恩生物科技有限公司
地址：610041 四川省成都市高新区科园南路88号B6楼501
国籍：CN
代理机构：北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：杨兵
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，ｍｉｒＶａｎａ等，这
（Ａｍｂｉｏｎ公司）和ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｍｉＲＮＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
［１８１９］
些方法的优点是通量高，一次可以同时检测多个ｍｉＲＮＡ的表达情况，缺点是技术含量较高，成本大，还存在同一ｍｉＲＮＡ不同家族成员之间互相错配杂交的噪ｉＲＮＡ检测；音信号，且不适合表达量较低的ｍ ② 结合ＰＣＲ与探针的定量检测技术，如ｓｔｅｍｌｏｏｐ，ｋｅｙｉｇａｔｉｏｎＡｓｓａｙ，这三者需要使用ｍｉＲＮＡ特ｌｉｋｅ及Ｌ异的探针，这类方法的突出优点是特异性强，常常能区分同一ｍｉＲＮＡ家族的不同变体，缺点是探针的设计与合成需借助于商业公司，方便性与特异性很难得到统一的解决；ＣＲ与荧光染料如ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ的定 ③基于Ｐ量检测技术，如ｐｏｌｙＡ聚合酶加尾法法
。ｍｉＲＮＡｓ在控制植物发育、开花时序、新陈代谢
［５１０］
和应激反应等方面起着重要作用
。除此之外，多数
［１１１５］
ｍｉＲＮＡ还具有高度保守性、时序性和组织特异性
①
。
自ｍｉＲＮＡ被发现以来，该领域的研究得到迅猛的发展。ｍｉＲＮＡ的数目从ｍｉＲｂａｓｅ数据库２００２年１２月最初发布Ｒｅｌｅａｓｅ１．０版本的２１８个迅速增加到现在的５０００个，目前已连续更新发布了２９个版本，在接近１２００５年４月和２００７年１２月为时间节点可将ｍｉＲＮＡ的第一阶段ｍｉＲＮＡ数目增长缓发展分为３个发展阶段，慢；第二阶段增长较快；第三阶段则为ｍｉＲＮＡ的快速增长阶段，且增加相同ｍｉＲＮＡ数量所需的时间越来越短（图１）。２０１０年４月ｍｉＲｂａｓｅ数据库释放了Ｒｅｌｅａｓｅ１５．０版本，公布了１４１９７个ｍｉＲＮＡ，这些ｍｉＲＮＡ分布于１３３物种，比半年前公布的１４．０版本增加了１８个物种和４０２２个成熟ｍｉＲＮＡ。其中植物ｍｉＲＮＡ有２５７０个，增加了６３６个。被子植物内双子叶植物的ｍｉＲＮＡ有１３６３个，增加了３２４个，其中双子叶
收稿日期：２０１００７１６修回日期：２０１００８１８９７３ ” 计划资助项目（２０１０ＣＢ１２６６０１）国家“ 电子信箱：ｃｈｅｎｘｉｎ３１８９＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ通讯作者，
［２４］［２３］［２１］［２２］［２０］
、引物延伸等，由于这
、ＭｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄＲＴ法
［２５］
和ｍｉＲＱ法
［２６］
些技术灵敏度高、操作流程简单、设备和试剂要求相对较低、集通用性和特异性于一身，便于一般实验室开展。因此，本文主要介绍第２类和第３类ｍｉＲＮＡ检测技术。
［１４］
４种增加到１１科２９种，增加的２植物从原来的９科２科是大戟科（蓖麻）和芸香科（金钱橘、红橘、甜橙、三叶橘）。单子叶植物有水稻、甘蔗、高粱、小麦、玉米，物种数虽然没有增加，但ｍｉＲＮＡ的数量增加了３１２个。尽管ｍｉＲＮＡ的数目得到迅猛增长，但绝大多数ｍｉＲＮＡ的ｉＲＮＡ生物学功能研究生物学功能研究尚显滞后，而ｍ的重要一环是探究ｍｉＲＮＡ在特定时期、特定组织及特定环境的表达特性，进而实现ｍｉＲＮＡ对目标基因的调ｉＲＮＡ定量检测的常用方法，并从控。本文重点介绍ｍ原理上剖析了各种方法的异同及优缺点，以便科研人员根据具体的实验目的和要求，选择最为恰当且经济有效的检测方法，开展针对ｍｉＲＮＡ的研究。
１结合ＰＣＲ与探针的定量检测技术
１．１ｓｔｅｍｌｏｏｐ和ｋｅｙｌｉｋｅ这两种技术的原理基本相同，首先以ｓｔｅｍｌｏｏｐ为ｔｅｍｌｏｏｐ技术主要例简要地介绍一下它的技术流程。Ｓ包括２个步骤： ① 设计一个可形成茎环结构的逆转录引物（ＲＴｐｒｉｍｅｒ），该引物３ ′ 端有６个碱基与成熟ｍｉＲＮＡ的３ ′ 端互补配对，逆转录合成第一链ｃＤＮＡ； ② ｍｉＲｃＤＮＡ与ＴａｑＭａｎ探针杂交，并利用设计好的正反向引物进行ＰＣＲ扩增，当引物ＰＣＲ延伸到ｔａｑＭａｎ探针与ｃＤＮＡ结合位置时，ＴａｑＭａｎ探针被置换，荧光基团和猝灭基团分离，随即触发荧光，ＰＣＲ反应体系中ＴａｑＭａｎ探针置换的越多，荧光信号越强，荧光信号的强弱与目标模板量之间存在一定的线性关系，通过荧光信号的收集与监测，即可确定ｍｉＲＮＡ的准确表达量（图２Ａ）。ｋｅｙｌｉｋｅ技术是在ｓｔｅｍｌｏｏｐ技术基础上做了一定的修改而形成的。两者的区别主要在以下３个方面。１．１．１逆转录引物的区别ｓｔｅｍｌｏｏｐ技术的逆转录引物为５ ′ ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＮＮＮＮＮＮ３ ′ ，由４４个碱基组成，其形成互补双链的ｓｔｅｍ部分由１４对互补碱基构成，Ａ＝Ｔ和Ｇ＝Ｃ对数目相同，有６个碱基与成熟ｍｉＲＮＡ互
摘要ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）是一类广泛存在于真核生物中，不编码蛋白质的短序列ＲＮＡ，它广泛参与真核生物的生长发育、新陈代谢和应激反应等生命活动。但绝大多数ｍｉＲＮＡ的生物学功能还不清楚，通过灵敏的定量检测方法，了解ｍｉＲＮＡ在不同组织部位的时空表达，是探究其功能的重要环节。现着重介绍了２类７种基于ＰＣＲ技术的ｍｉＲＮＡ定量检测方法的基本原理和实验流程，并分析了这些定量检测技术间的异同和适用范围。关键词ｍｉＲＮＡ探针荧光染料定量ＰＣＲ
中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（１１）：８８９３ ?
基于ＰＣＲ技术的ｍｉＲＮＡ定量检测方法
陈新曾长英卢诚王文泉（中国热带农业科学院热带生物技术研究所海口５７１１０１）
２０１０，３０（１１）
陈新等：基于ＰＣＲ技术的ｍｉＲＮＡ定量检测方法
８９
根据这些定量检测技术的特点，可分为３大类： ① 基于直接杂交的检测技术，如Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ
［１６１７］
ｋｅｙｌｉｋｅ技术的逆转录引物为５ ′ ＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡ补；ＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＣＧＣＧＮＮＮＮＮＮＮＮ３ ′ ，由３５个碱基组成，其形成互补双链的ｓｔｅｍ部分由４对互补碱基构成，均为Ｇ＝Ｃ，有８个碱基与成熟ｍｉＲＮＡ互补Ｂ）。ｓｔｅｍｌｏｏｐ逆转录引物的成环性较为稳定，但（图２其相对稳定的内部二级结构在随后ｑＰＣＲ中可能会给ｅｙｌｉｋｅ的逆转录线性模板的形成造成一定的困扰；而ｋ引物减少了ｓｔｅｍ茎段的互补碱基数，同时通过在松散ｏｏｐ段配置４对互补碱基加强其形成ｋｅｙｌｉｋｅ结构的ｌ的能力，后期ｑＰＣＲ中形成线性模板相对较容易。１．１．２探针的区别ｓｔｅｍｌｏｏｐ技术的探针有８个左右的碱基与成熟ｍｉＲＮＡ互补，而ｋｅｙｌｉｋｅ技术的探针只有３个碱基与成熟ｍｉＲＮＡ互补，但ｓｔｅｍｌｏｏｐ技术探针的发光基团位于与反向引物配对的一端，而ｋｅｙｌｉｋｅ技术探针的发光基团位于与ｍｉＲＮＡ配对的一端。两者相比，ｓｔｅｍｌｏｏｐ技术探针的互补碱基虽然多，但发光基ｉＲＮＡ配对的部分，而ｋｅｙｌｉｋｅ技团并不直接位于与ｍ术探针的发光基团虽位于与ｍｉＲＮＡ配对的部分，但配特异性还有待提高。对碱基数只有３个，１．１．３正向引物的区别ｓｔｅｍｌｏｏｐ技术的正向引物在设计时为了让探针与更多的ｍｉＲＮＡ配对，有意识地ｅｙｌｉｋｅ技术的正向引让引物向外滑动了一些碱基，而ｋ物则基本上是ｍｉＲＮＡ序列。若ｋｅｙｌｉｋｅ技术的正向引ｔｅｍｌｏｏｐ技术的设计理念，并改进探针的设计，物采用ｓ则可提高ｋｅｙｌｉｋｅ技术的特异性和准确性，同时也可克服ｓｔｅｍｌｏｏｐ技术的缺陷。１．２连接法连接法（ｌｉｇａｔｉｏｎａｓｓａｙ）与前２种检测技术相比，其原理略有不同。连接法首先利用８个左右的与成熟ｍｉＲＮＡ互补的短核苷酸链逆转录合成单链ｃＤＮＡ，在利用包含通用序列和ｍｉＲＮＡ特异序列的左、右核苷酸链与ｍｉＲｃＤＮＡ互补配对（图２Ｃ），并用Ｔ４连接酶补平缺口，形成一条完成的ｍｉＲｃＤＮＡ链；再利用根据ｍｉＲＮＡ序列设计的探针和左、右核苷酸链前端预置的正反向引物进行实时定量ＰＣＲ扩增，收集荧光信号，获得ｍｉＲＮＡ的表达量。连接法避免了使用可形成复杂二级结构的逆转录引物，但实验过程中有一个使用连接酶补平双链缺口的过程，因存在连接效率的问题，可能会增加实验误差的来源，甚至影响实验的重复性和精确性。

基于PCR技术的miRNA定量检测方法 陈 新 曾长英 卢 诚 王文泉