牛血清白蛋白粒径及团聚作用

1介绍

牛血清白蛋白（BSA）是一种小的稳定且中等程度的非反应性蛋白质，通常用作实验室蛋白质浓度标准，在各种免疫测定中用作阻断剂或作为细胞培养补充剂。作为牛血中最丰富的血清蛋白，养牛业的副产品，BSA是一种相对便宜且易于获取的化合物。

根据文献，BSA标准粒径是7.1nm、分子量是66.5kDa。牛血清白蛋白在压力条件下显示出自然的二聚趋势，BSA二聚体的分子量是132kDa。磷酸盐缓冲盐水（PBS）是一种水基盐溶液，与哺乳动物细胞等渗，可将pH值稳定在中性值（通常pH7.4）。缓冲液广泛用于溶解蛋白质，重悬细胞或作为生物样品的运输溶液。

为了突出样品制备方法对溶解蛋白质结构的影响，我们溶解纯的BSA在去离子水或PBS中。我们接下来比较两种BSA溶液用Litesizer?测试的粒径和分子量数值。

2实验设计

制备了两种不同的BSA储备溶液。

样品1包含BSA（≥96%，通过冷乙醇分馏获得）溶解于0.2um过滤的去离子水。

样品2包含相同来源的BSA溶解于PBS（0.01M，pH7.4）

每个样品制备四种不同浓度（8，4，2和1mg/mL），在25℃通过Litesizer? 500在石英池中进行测试。

对于粒径测试，使用8mg/mL样品。运行回合数、测试角度和滤光、聚焦位置由仪器自动确定。

分子量测试用侧向散射dn/dc比例0.185mL/g进行。四个不同的BSA浓度用于生成德拜图。甲苯用作参考物质。

粒径和分子量测试都重复三次。

3结果与讨论

3.1粒径结果

Litesizer用动态光散射（DLS）来计算悬浮颗粒的水合动力学直径。如图1，溶解于水的BSA显示双峰的粒径分布，正如光强粒径分布曲线可见的两个明确的峰。第一个峰对应平均粒径小于3nm，远小于BSA

单体预期的7nm，第二个峰平均粒径是22nm，大于BSA二聚体预期的粒径值。因此，BSA单体和BSA二聚体在这个样品中都不能观察到。

这表明一定程度的变性或团聚发生。

图1 去离子水溶解的BSA光强粒径分布

相反，PBS溶解的BSA样品DLS结果显示清晰的单峰粒径分布（图2）。粒径平均值是12.4nm（见表1），结果表明BSA的PBS溶液主要包含BSA二聚体。

图2 PBS溶解的BSA光强粒径分布

3.2分子量结果

静态光散射（SLS）的分子量结果不是由样品中每个存在粒径的散射光强获得，而是所有粒径分布的散射光强。因此，SLS仅对单分布样品有意义。

溶解于水的BSA样品计算平均分子量是56.8kDa（图3，表1）。这个结果看起来与BSA单体预期的分子量一致，DLS结果表明样品是双峰（见3.1部分）。因此，分子量结果是样品中存在的两种颗粒物的“平均值”，而不是BSA单体的分子量，应该被认为是错误的。

图3 去离子水分散的BSA德拜图

因为DLS结果表明溶解于PBS的BSA是单峰，我们认为样品通过SLS得到的分子量结果有意义。如图4和表1所示，这个样品平均分子量是141kDa，与BSA二聚体预期分子量一致（理论值132kDa）。这证明了DLS的观察，溶解于PBS的BSA真的有很大的二聚化。

图4 PBS分散的BSA德拜图

4结论

当BSA溶解于去离子水，DLS结果显示双峰分布证实既不是BSA单体也不是二聚体。这表明在低渗而不是pH稳定的溶剂中稀释BSA会导致BSA分子变性和变性单体的聚集。由于样品的多峰性质，分散液的

分子量测试产生错误结果。

相反，溶于等渗和pH中性缓冲液PBS中的BSA表现出单峰分布，

与BSA二聚体的粒径一致。溶解于PBS的BSA自发组成二聚体的事实

进一步由分子量测试结果证明，测试分子量平均值接近二聚体分子量。

这篇报告强调了以下事实：用于溶解蛋白质的制备方法对蛋白质折叠和低聚化具有至关重要的影响。在我们这种情况下，BSA厂家声称产品可以重新悬浮于水中，我们的数据表明这会导致蛋白质的变性或团聚。重悬于PBS更好，因为我们能通过DLS和SLS检测到自然的蛋白

质二聚体。

Litesizer? 500让用户能够测量蛋白质样品的粒径和分子量，甚至

能够获得溶解蛋白质的三级和四级结构信息。