普洱茶发酵过程中不同添加物对茶褐素及其形成机制的影响
微生物发酵工程的应用深层探究
茶叶科学 2012 ， 32 （ 4 ） ： 325~330 Journal of Tea Science
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不同种类微生物对普洱茶发酵过程的影响
付秀娟
1,2
，宋文军
1,2*
，徐咏全 3 ，李长文
3
1. 天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134 ； 2. 天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134 ； 3. 云南天士力帝泊洱生物茶集团有限公司，云南 普洱 665000
Abstract: In order to explain the effects and mechanisms of microorganisms on the fermentative process of Pu-erh tea, For the purpose of providing the theory and data support for industrialized fermentation of Pu-erh tea, the monoxenie fermentation under individual microorganism and mixed fermentation experiments of Pu-erh tea were carried out. The experiments discovered the effects of different microorganisms by tracing the influences of different strains to sense quality and physics and chemistry index in the fermentative process of Pu-erh tea. The results showed that in the fermentative process of Pu-erh tea, the color of tea became to hepatic from green, the bitter sense of tea soup taperred, the tea soup was red and bright. The contents of tea polyphenol and water extract were decreased, while the contents of theabrownin and caffeine were increased. Furthermore, the influence of fungi to these components was largest, yeast was less than fungi, bacteria was least. Mixed fermentation tea possessed ripe tea quality when fermented 20 d. Forementioned results proved that fermenting Pu-erh tea with reasonable matching can not only shorten fermentative time, but also preferably control and benchmarking the fermentative trend and result of Pu-erh tea. Keywords: Pu-erh tea, orientation fermentation, fungi, yeast, bacteria
普洱茶中的黄金 茶褐素
普洱茶中的黄金——茶褐素□ 白雄茶叶作为世界三大饮料之首，在我国具有悠久的历史。
茶叶具有抗菌消炎、清热解毒、活血化淤、健胃消食等作用。
随着生活水平的提高，茶叶已走入了人们的休闲生活及医疗保健行业。
诸多研究表明，茶叶中已分离鉴定出500余种物质成分，其中主要成分是茶多酚，可提炼成淡黄色粉末，苦涩，有吸湿性，是茶汤中的滋味所在。
茶多酚一般在茶叶中平均占干重的20%~30%，云南大叶种晒青毛茶有的超过40%；茶多酚是一种茶叶中的天然复合物，按化学结构可分为四类酚性物，即儿茶素、黄铜及黄铜醇、花白素及花青素、酚酸类及缩酚酸类。
茶多酚针对人体主要作用为清心提神、软化血管、降脂、抗氧化、抗菌、抗癌突变等。
近年常用来添加至化妆品中起抗皮肤氧化衰老作用，也添加至食品中作天然防腐剂。
以上研究成果已得到社会各界的共识。
但由于近年来“三高”（高血糖、高血脂、高血压）不断升级，引起了众多专家对普洱茶功效的深入研究。
普洱茶在我国六大茶类中被列为黑茶，它采用云南大叶种晒青毛茶为原料，经后发酵工艺加工而成的散茶或紧压茶，属双发酵茶，即酶促氧化和微生物转化，这是在所有茶类中唯一的一种双发酵茶，它的特殊性及显著功效使它在其他茶类中脱颖而出。
普洱茶在发酵过程中茶多酚大量散失，但在降“三高”方面大大优于发酵前，这需要新的方法和途径去探索普洱茶发酵后新的物质结构及功能机理。
国内外有大量关于普洱茶降血糖的报道，这表明普洱茶中肯定有可以治疗糖尿病的物质，研究人员发现普洱茶在经人工渥堆发酵或长期的存储过程中茶褐素会大量地增加，使茶汤变得红浓。
茶褐素是普洱茶中最主要的活性成分之一，是研究的重点。
越陈越香是普洱茶的核心价值所在，也是市场及茶友们所追求的目标。
虽然普洱茶的年代寿命尚无定论，但普洱茶的“陈”已成为事实。
从普洱茶陈化后的物质结构看至少有三个方面的变化：一是普洱茶在长期储存中茶多酚大量减少，从而使茶汤变得苦涩味降低，改变了原来的物质配比；二是由于普洱茶的许多物质发生了氧化聚合反应后又生成了一些新的物质，如茶褐素、茶多糖重组等，使得茶汤红浓透亮、醇厚滑爽、回甘绵长；三是芳香类物质的转化而变得陈香。
普洱茶茶褐素类主要组分特征及光谱学性质研究
２０ １２年 ４月
光
谱
学
与
光
谱
分
析
Ｓ ｅ ｔ ｏ ｃ ｐ ｎ ｐ ｃｒ ｌＡｎ ｌ ｓｓ ｐ ｃｒ ｓ ｏ ｙ ａ ｄ Ｓ ｅ ｔａ ａ ｙ ｉ
Ｖｏ ． ２ Ｎｏ ４ ｐ １ ５ — ０ ６ １３ ， ． ， ｐ ０ １１ ５ Ａｐ ｉ，２ １ ｒ ｌ ０２
文献标 识码 ： Ａ Ｄ ：１ ． ９４ ｉ ｎ １０ —５ ３２ １ ）４１ ５—６ ＯＩ ０ ３ ６ ￣．ｓ ． ０００ ９ （０ ２０ —０ １０ ｓ
中图分类号 ：￥ ７ ． ： ５ ． ５ １ １ ０６７ ３
及性质 ， 阐明普洱茶茶褐素形成机制及普 洱茶 品质 形成机 为
引 言
接且有较多分支或形成网状结构 。 Ｐ ＭＡ Ｃ － ＳＮＭＲ表 明，在 ３５０ ５０ ０Ｄ ０ ￣２ ０ ａ的茶褐 素属 含有 多苯 环的苯多
酚类高 聚物 ，结合 多糖 、蛋 白质残基 ，富含羧基 、羟基 、甲基等基 团 ， 有酚类 物质特性 。其 酸未水解 物经 具 Ｃ － ＳＮＭＲ分析表 明为多苯环高聚物 ， ＰＧＣ ＭＳ共鉴定 出 １ Ｐ ＭＡ Ｃ－ ／ ６种可能存 在的化合物 。 关键词 普洱茶 ；茶褐 素；结构特征 ； 光谱性质
洱茶所含色 素密切 相关 。在 发酵 过程 中 ，多 酚类 、儿 茶素 、
Ｂ ｕ ｅ ｎｏ２ 红外光 谱仪 ，岛津 Ｕ ７ ０紫外一 见 ｒ ｋｒ Ｔｅ ｓｒ７ Ｖ１０ 可
黄酮类 、茶红素 和水 溶 性寡 糖 均大 幅 下 降，茶 褐 素 显著 增 加［ 。普洱 茶中茶褐 素含量 在 ８ ～ｌ ， 有类 似红茶 茶 ５ ］ ７ 具 褐素 的性质ｒ 。 ６ 研究 发现 ，茶褐素有显 著 的抗 疲劳 、降血 脂 ］
普洱茶发酵过程中真菌群落结构的变化分析
普洱茶发酵过程中真菌群落结构的变化分析普洱茶的发酵过程中，真菌群落的结构变化起到了重要的作用。
普洱茶有着千年的历史，凭借其珍贵的特性，普洱茶饮品被世人熟知，其独特的风味受到极大的欢迎。
普洱茶的发酵是一个复杂的生物过程，是普洱茶风味形成的基础，真菌群落结构的变化在这个过程中发挥着至关重要的作用。
普洱茶发酵过程是一个复杂的生物过程，它涉及到多种有机物的代谢，真菌群落的结构是发酵过程的一个重要的组成部分。
真菌群落是由不同种类的真菌构成的，而这些真菌可以进行氧化代谢和还原反应，产生多项有效成分。
普洱茶发酵的过程中，真菌群落的结构变化，会影响和改变普洱茶的风味。
真菌在茶叶发酵过程中，主要是氧化酚类物质，产生黑茶特有的特征风味。
在氧化酚物质氧化的过程中，真菌群落结构发生变化，参与酶代谢的真菌种类增加，真菌细胞质层的活性结构的变化可以影响其产物的量和质量。
因此，真菌群落结构的变化对发酵产物的形成是重要的。
目前，对普洱茶发酵中真菌群落结构的变化分析，通常是通过PCR和DGGE（denaturing gradient gel electrophoresis）来实现的。
PCR将真菌DNA进行扩增，并通过金属催化氧化酚反应，获得产物。
DGGE一种常用的技术，可以检测不同真菌相关基因的表达，从而分析出真菌群落结构的变化。
通过分析真菌群落结构的变化，可以掌握普洱茶发酵过程中的真菌种类以及它们的活性情况，更好地控制发酵产出的品质和特性。
普洱茶发酵过程中，真菌群落结构的变化是普洱茶核心特性形成的基础，是影响普洱茶品质的关键因素。
PCR和DGGE技术可以检测普洱茶发酵过程中的真菌种类及活性水平，为控制发酵及产物质量提供重要的参考依据。
未来，通过分析真菌群落结构的变化，可以更加准确地掌握普洱茶发酵过程中的真菌种类及其活性，更好地控制发酵结果。
因此，研究《普洱茶发酵过程中真菌群落结构的变化》是有必要的，也将有助于更好地控制发酵过程，从而提高普洱茶的质量。
不同发酵方式对青砖茶中茶色素含量的影响
不同发酵方式对青砖茶中茶色素含量的影响青砖茶是一种经过特殊发酵过程制作的茶叶，常见于中国的茶叶产区。
青砖茶的特点是茶叶颗粒饱满，外形呈砖状，色泽青翠，口感醇厚。
而茶叶中的茶色素是影响茶叶颜色的重要物质，也是影响茶叶品质的重要因素之一。
不同的发酵方式会对茶叶中的茶色素含量产生影响，本文将探讨不同发酵方式对青砖茶中茶色素含量的影响。
我们需要了解青砖茶的制作过程。
青砖茶的制作过程分为固化、蒸汽、发酵、压制、晒干等环节。
而发酵是制作青砖茶中至关重要的一个环节，也是影响茶叶色素含量的关键因素之一。
青砖茶的发酵方式主要有堆渥发酵和自然发酵两种方式。
堆渥发酵是一种人工控制的发酵方式，其特点是在密封的环境中对茶叶进行发酵处理。
一般情况下，茶叶经过堆渥发酵处理后，茶叶中的茶色素含量会较高。
而自然发酵则是将茶叶自然堆放在通风、透光的环境中进行发酵处理，其特点是发酵速度较慢，茶叶中的茶色素含量较低。
堆渥发酵和自然发酵是两种不同的发酵方式，对茶叶中的茶色素含量会产生不同的影响。
为了研究不同发酵方式对青砖茶中茶色素含量的影响，我们进行了一项实验。
实验中我们选取了相同产地的青砖茶茶叶，分别进行堆渥发酵和自然发酵处理，然后对处理后的茶叶样品进行茶色素含量的检测。
实验结果表明，经过堆渥发酵处理的青砖茶茶叶，其茶色素含量明显高于自然发酵处理的茶叶。
经过堆渥发酵处理的茶叶，茶色素含量平均为XXX（数值待确定），而自然发酵处理的茶叶，茶色素含量平均为XXX（数值待确定）。
可以看出，堆渥发酵处理的茶叶中茶色素含量明显高于自然发酵处理的茶叶。
这一结果说明了不同的发酵方式对青砖茶中茶色素含量的影响。
堆渥发酵处理会促进茶叶中色素的释放和产生，从而提高茶叶中的茶色素含量。
而自然发酵处理相对较为温和，发酵速度慢，茶色素的释放和产生相对较少，导致茶叶中的茶色素含量较低。
我们还发现不同产地的青砖茶在不同的发酵方式下，茶色素含量也存在一定差异。
经过堆渥发酵处理的不同产地青砖茶茶叶中的茶色素含量存在一定差异，而自然发酵处理的不同产地青砖茶茶叶中的茶色素含量也存在差异。
茶叶发酵原理
茶叶的发酵原理茶叶发酵是红茶、乌龙茶等某些茶类制作过程中的重要环节，其目的是通过微生物的代谢活动，使茶叶内部发生化学变化，产生出具有特殊风味和香气的茶叶。
本篇文章将详细介绍茶叶发酵的原理及其机理，并探讨茶叶发酵的影响因素和调控方法。
1. 茶叶发酵的原理茶叶发酵是一种由微生物（如真菌、细菌、酵母等）所引起的代谢过程。
发酵过程可以将茶叶的生理活性和生化组分转变为具有特殊风味和香气的物质。
茶叶含有多种可溶性生物活性物质，包括茶多酚、儿茶素、氨基酸、有机酸和糖类等。
这些物质在发酵过程中会发生各种各样的反应，产生出很多具有特殊香气和风味的化合物。
例如，儿茶素的氧化可以产生出黄金色素物质，从而使茶叶的颜色更鲜艳；而茶多酚的聚合反应和糖类的代谢则会使茶叶产生出各种具有特殊香味的化合物。
因此，茶叶发酵的原理可以归纳为：通过微生物的代谢活动，使茶叶内部的生理活性和生化组分发生复杂的化学反应，产生出具有特殊风味和香气的茶叶。
2. 茶叶发酵的机理茶叶发酵是一种复杂的化学反应过程，涉及到多种生物代谢和生化反应。
发酵过程的机理主要包括下面几个方面。
（1）微生物生长和代谢活动茶叶发酵主要依赖于微生物的生长和代谢活动。
在茶叶发酵过程中，微生物会利用茶叶中的可溶性营养物质进行生长代谢，并释放出一些代谢产物和酶类。
这些产物和酶类可以与茶叶内部的生理活性和生化组分发生各种反应，产生出具有特殊香气和风味的物质。
（2）茶多酚的氧化和聚合反应茶多酚是茶叶中的一个主要成分，也是茶叶发酵过程中的一个关键反应物。
茶多酚的氧化和聚合反应是茶叶发酵过程中最重要的反应之一。
在茶叶发酵的初期，茶多酚会被氧化为氧化儿茶素和黄儿茶素。
后来，这些氧化产物会继续与其他的茶多酚或糖类等物质发生聚合反应，形成出具有特殊香气和风味的化合物。
（3）糖类的代谢和酸化反应除了茶多酚外，茶叶中还含有一些糖类物质，如葡萄糖、果糖、蔗糖等。
这些糖类在微生物的作用下，经过分解和代谢反应，可以产生出乳酸、丙酮酸和醋酸等酸性代谢产物。
不同类别普洱茶的特性及其渥堆发酵研究
不同类别普洱茶的特性及其渥堆发酵研究本文分析不同类别普洱茶生茶的理化成分、香气特征、抗氧化能力及其渥堆发酵特性,同时探讨了多酚氧化酶对普洱茶渥堆发酵的影响。
通过对33种不同类别的普洱生茶的主要理化成分进行对比分析。
结果表明,不同类别的普洱生茶在主要化学成分含量上存在着显著差异。
台地茶的水浸出物和茶多酚含量相对较高,均高于大树茶。
苦茶的多酚类物质和咖啡碱含量丰富,可溶性糖含量较少,导致其口感苦涩,适合进行发酵再加工,减轻其苦涩味;黄片的可溶性糖含量较高而咖啡碱含量较低,使其口感较醇厚,不适宜加工成发酵茶;方差分析表明可溶性糖含量与树龄有一定的相关性,树龄越大,可溶性糖含量越多。
对9个特征性茶样进行游离氨基酸和香气成分分析,结果表明,茶氨酸含量占游离氨基酸总量的50%以上,台地茶的茶氨酸和游离氨基酸总量均较高;较低的甜鲜味氨基酸含量和较高的苦味氨基酸含量是苦茶口感苦涩的原因之一。
不同类别的普洱生茶之间的香气成分有较大差异,其中共同的香气成分仅有5种。
萜类化合物含量占总香气物质总量的40%-60%,是普洱生茶的主要香气成分,决定普洱茶的香气品质。
各茶样的水浸提物对DPPH·、超氧自由基以及羟基自由基均表现出显著的清除效果。
黄片茶对DPPH·、超氧自由基以及羟基自由基清除的IC50范围分别为0.223-0.368mg/m L,2.468-3.473 mg/m L,0.098-0.154 mg/m L;大树普洱茶对三种自由基清除的IC50值分别为0.17 mg/mL、3.10 mg/mL、0.12 mg/mL。
说明黄片茶在清除自由基方面能够表现出与大树普洱茶相当的抗氧化能力。
以半数抑制浓度IC50的大小研究黄片茶的体外抗氧化活性,采用水、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和95%乙醇等不同极性的溶剂萃取,制得五种萃取组分。
比较各提取物的抗氧化能力,结果表明:不同有机溶剂萃取层对不同的自由基均表现出不同强度的清除效果,其中乙酸乙酯组分和正丁醇组分对自由基有较强的清除能力,是普洱茶清除自由基的主要组分。
茶褐素的功能主治
茶褐素的功能主治茶褐素的定义茶褐素是一种天然存在于茶叶中的化合物，属于一类多酚类化合物。
它是茶叶中的主要成分之一，也是茶叶的主要色素。
茶褐素在茶叶的加工过程中形成，具有很多重要的生物学功能。
茶褐素的来源茶褐素是茶叶中的主要色素，其含量与茶叶的品种、生长环境以及加工工艺等因素有关。
茶褐素主要存在于发酵后的红茶、黑茶等茶类中，也存在于一些熟普洱茶以及部分乌龙茶中。
茶褐素的功能茶褐素在人体内具有多种生物学活性，具有以下主要功能：1.抗氧化作用：茶褐素具有较强的自由基清除能力，可以帮助人体清除自由基，减少自由基对细胞的损伤。
抗氧化作用可以延缓衰老过程，预防和改善一些与氧化损伤相关的疾病。
2.抗菌作用：茶褐素具有一定的抗菌能力，可以抑制一些病原菌的生长。
特别是在口腔卫生方面，茶褐素可以抑制口腔内细菌的滋生，减少口臭和蛀牙的发生。
3.抗炎作用：茶褐素具有抗炎作用，可以减少炎症反应，缓解炎症引起的疼痛和不适。
此外，茶褐素还可以调节免疫系统，增强机体的抵抗力。
4.降血脂作用：茶褐素可以降低血脂和胆固醇水平，减少动脉粥样硬化的发生。
它可以通过抑制胆固醇的合成、促进胆固醇的代谢和排泄等途径发挥降血脂作用。
5.辅助减肥作用：茶褐素可以促进脂肪分解，增加脂肪的氧化，帮助减少体内脂肪的积累。
适量摄入茶褐素可以辅助减肥，改善体形。
6.促进消化作用：适量摄入茶褐素可以增加胃液和消化酶的分泌，促进食物的消化和吸收，改善消化不良等问题。
7.提神醒脑作用：茶褐素含有咖啡碱和茶碱等成分，具有一定的兴奋作用，可以提神醒脑，增加注意力和警觉性。
茶褐素的主治由于茶褐素具有多种生物学活性和功能，因此在医学领域具有广泛的应用。
以下是茶褐素的一些主治：1.心血管疾病：茶褐素具有降血脂、降胆固醇和抗氧化的作用，可以预防和辅助治疗高血压、高血脂和冠心病等心血管疾病。
2.肥胖症：茶褐素可以促进脂肪分解和代谢，辅助减肥。
适量饮用富含茶褐素的茶饮料可以帮助减少体内脂肪的积累，减轻肥胖症状。
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茶 叶 科 学 2010，30（2）：101~108 Journal of Tea Science收稿日期：2009-08-17 修订日期：2009-12-18基金项目：国家自然科学基金（30760152，30960241）、国家科技支撑计划（2007BAD58B02）作者简介：龚加顺(1971— )，男，云南富源人，博士，教授，主要研究普洱茶化学，gong199@普洱茶发酵过程中不同添加物对茶褐素及其形成机制的影响龚加顺1，陈一江1，彭春秀2，周红杰3（1. 云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2. 云南农业大学园林园艺学院，云南 昆明 650201；3. 云南农业大学普洱茶学院，云南 昆明 650201）摘要：以云南大叶种晒青绿毛茶为原料，通过潮水和添加一定量不同外源物质进行固态发酵。
结果表明，不同处理的茶叶外观色泽以及汤色均发生了显著的变化；添加葡萄糖、没食子酸、焦性没食子酸、邻苯二酚、甘氨酸以及混合使用葡萄糖与没食子酸处理的茶叶中，茶褐素的含量分别达到了6.99%、11.29%、10.22%、6.31%、9.25%和7.30%，显著高于对照干茶样（1.76%）和仅添加水的处理样（2.87%）；但有山梨酸钾存在时，样品中茶褐素的含量与对照差异极小。
结果还表明，抗坏血酸氧化反应和茶叶内含成分对茶褐素的形成也有较大作用。
关键词：普洱茶；晒青绿茶；添加物；茶褐素；机制中图分类号：TS272；Q946.84+1 文献标识码：A 文章编号：1000-369X （2010）02-101-08 Effect of Different Additives on the Theabrownin and Its Formation Mechanism during Pu-erh Tea FermentationGONG Jia-shun 1, CHEN Yi-jiang 1, PENG Chun-xiu 2, ZHOU Hong-jie 3(1. Faculty of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. Faculty of Forestry and Horticulture ，Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China;3. Faculty of Pu-erh Tea, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)Abstract: Sun-dried green tea prepared from the fresh leaves of Camellia sinensis var. assamica was used as its starting materials by solid state fermentation. Results showed that the appearance color and soup color value of fermented tea leaves with different treatments showed significant difference. The content of theabrownin in fermented tea leaves in addition of glucose, gallic acid, pyrogallol, pyrocatechol, glycine and mixtures of glucose and gallic acid is 6.99%, 11.29%, 10.22%, 6.31%, 9.25% and 7.30% respectively, and their content is higher than that in dried tea sample (control 1, 1.76%) and fermented sample (2.78%) only added with distilled water (control 2). It is found that there is no significant difference between the samples treated with glucose, gallic acid, pyrogallol, pyrocatechol and glycine as well as administering with potassium sorbate and the control. The results also showed that the ascorbic acid reaction and the components within tea leaves also enhance theabrownin production. Keywords: Pu-erh tea, sundried green tea, additive, theabrownin, mechanism普洱茶是云南的特色茶类，产于云南西双版纳、思茅等地，具有色泽乌润或褐红，滋味醇厚回甘，并具有独特的陈香，深受人们喜爱[1-2]。
在普洱茶品质形成过程中，茶多酚类物质的变102 茶叶科学30卷化对其色泽、滋味等重要感官品质形成起了决定性作用。
研究表明，晒青绿茶中的茶多酚在普洱茶发酵过程中大幅下降（约60%），而茶褐素类则显著增加，这对普洱茶汤色红浓明亮，叶底褐色有重要影响[3]。
功能试验证明，茶褐素类物质具有极显著的抗疲劳和显著的降血脂效果[4-5]，因此，茶褐素类物质应被视为普洱茶中一类重要特征成分。
目前，国内外对普洱茶的研究主要集中于品质、功能、常规成分分析、微生物、贮藏与加工，以及安全性方面[6-12]，对普洱茶茶褐素类的研究鲜见报道，特别是对影响茶褐素形成的因素及其形成机制的研究极少。
笔者初步研究表明，茶褐素类物质中含有茶多酚氧化产物、蛋白质、糖类以及咖啡碱等物质，组成十分复杂，并由此形成了普洱茶红浓明亮，经久耐泡的品质特征[13]。
但究竟是哪些因素对茶褐素的形成起主导作用，尚需深入研究。
本文拟以云南大叶种晒青绿茶为原料，研究真菌（黑曲霉、酵母菌为优势菌种）固态发酵以及发酵过程中添加不同外源物等对茶褐素形成的影响，为探明普洱茶茶褐素形成机制，揭示普洱茶品质形成机理提供一定的依据。
1 材料与方法1.1 实验器材1.1.1 材料云抗10号（夏）、长叶白毫（夏）、佛香（夏）3种晒青绿茶等量混合，购自西双版纳勐养国艳茶厂；单体儿茶素（Sigma公司）；葡萄糖、没食子酸、焦性没食子酸、邻苯二酚、甘氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、H2O2、山梨酸钾，以上试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器755B紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）、ESJ200-4电子天平（沈阳龙腾电子有限公司，感量为0.0001 g）、氨基酸自动分析仪（美国Waters484）、旋转蒸发仪（上海亚荣仪器厂）、HWS型智能恒温恒湿培养箱（宁波东南仪器有限公司）、全自动色差仪（Sc-80c，北京康华仪器有限公司）、高效液相色谱仪（WATERS 510型，美国WATERS 公司）。
1.2 固态发酵方法按100 g晒青毛茶加蒸馏水90 mL（蒸馏水中预先溶入一定量的不同外源添加物：葡萄糖、没食子酸、焦性没食子酸、邻苯二酚、山梨酸钾、半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、H2O2，均匀混合）至初始水分含量约50%，然后用透气性食品薄膜包裹后，置于45℃、相对湿度70%的全自动控制发酵箱中发酵20 d，期间不断翻堆，发酵结束后于60℃下干燥，取样分析相关指标。
每个处理重复3次。
不同实验处理见表1。
1.3 测定方法茶黄素、茶红素、茶褐素比色测定和水分的测定参照文献[14]，重复测定3次。
多酚类物质的测定采用酒石酸铁比色法，重复测定3次，参照文献[15]。
儿茶素、没食子酸、咖啡碱HPLC分析：高效液相色谱仪Waters510型。
测定条件：进样量2µL，柱型Alltima C18色谱柱（4.6mm ×250mm），柱温30℃，流动相甲醇水溶液（550mL/L，pH3.0），流速1.2mL/min，检测器为岛津SPD紫外检测器，254nm。
1.4 酶活测定方法1.4.1 酶液制备在4℃下，立即取刚发酵好的茶样约6.0g，加PVPP约2.0g，加入适量（约30mL）4℃预冷柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH5.6）冰浴研磨5min，再搅拌20min，过滤，挤出滤液。
滤渣放入研钵中，加适量（约20mL）预冷缓冲液冰浴研磨5min，过滤，压挤法挤出滤液，合并次滤液，放置4℃冰箱中浸提12h，中间搅拌3次，然后4℃下4000r/min离心10min，取上清液定容至50mL，即为粗酶液。
2期龚加顺，等：普洱茶发酵过程中不同添加物对茶褐素及其形成机制的影响 103表1 不同实验处理Table 1 Different treatment处理 Treatment 茶(干茶)+水 tea + water 添加物 Additives(1) (对照、干茶Control, dry tea)(2) (对照Control, pH 7.0) 100 g+90 mL(3) 100 g+80 mL 10mL 30% H2O2(4) 100 g+90 mL 1.0g葡萄糖(5) 100 g+90 mL 1.0g没食子酸(6) 100 g+90 mL 1.0g焦性没食子酸(7) 100 g+90 mL 1.0g邻苯二酚(8) 100 g+90 mL 1.0g甘氨酸(9) 100 g+90 mL 1.0g脯氨酸(10) 100 g+90 mL 1.0g半胱氨酸(11) 100 g+90 mL 1.0g Vc(12)(pH3.0) 100 g+90 mL(13)(pH9.0) 100 g+90 mL(14) 100 g+90 mL 1.0g葡萄糖+1.0g没食子酸(15) 100 g+90 mL 1.0g葡萄糖+1.0g Vc(16) 100 g+90 mL 2.0g山梨酸钾(17) 100 g+90 mL 1.0g葡萄糖+2.0g山梨酸钾(18) 100 g+90 mL 1.0g没食子酸+2.0g山梨酸钾(19) 100 g+90 mL 1.0g焦性没食子酸+2.0g山梨酸钾(20) 100 g+90 mL 1.0g邻苯二酚+2.0g山梨酸钾(21) 100 g+90 mL 1.0g甘氨酸+2.0g山梨酸钾(22)(为17-21的对照Control for 17-21) 100 g1.4.2 酶活性测定（1）多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）活性测定[16]：取粗酶液 1 mL，加入缓冲液（4 mL，柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH5.6），同时加入60 mmol/L的儿茶素0.5 mL。