用高效液相色谱法定量表征云南烤烟烟叶的颜色相似性

Quantitative characterization of color similarity among Yunnan flue-cured tobacco leaves by high performance liquid chromatography
Mao Youan, Liu Wei, Dong Daozhu, Lu Hongbin, Zhong Kejun
*
[4] [1, 3] [1, 2]
，其中绿原酸、芸香苷、莨菪葶、莨菪灵
[3]
。多酚类物质含量随着烟草遗传类型和栽培条件的变化而大不相同 ，
毛友安(1959-)，男，河南嵩县人，研究员，理学博士，Tel: 0736-7294553, E-mail: youanmao@
高的卷烟等级越高，反之亦然，其中绿原酸是改善烟叶等级的最主要多酚。在合理的调制、陈化作用下， 多酚类化合物经一系列反应降解成小分子，这些降解物能赋予烟草制品优雅的香气，增加烟草制品的香 气量，对改善烟草制品品质有着重要作用。另一方面，从颜色上看。多酚类化合物对调制后的烟叶颜色 起着决定作用。在多酚氧化酶的作用下，多酚氧化形成聚合多醌类物质，烟叶颜色逐渐加深，而黄体酮 类化合物中的芸香苷和鼠李糖本身就是色素。 烟草是一种天然产物。为了对天然产物进行质量评价，常常采用器官感觉的方法。然而，这些方法 的主观性强，需要用客观方法（如色谱分析法）弥补，以便提供有价值的质量参数的多元信息。然而， 仅凭肉眼观察不同试样的色谱图， 很难看出差别， 而且也不可靠， 尤其是当要比较大量试样时更是如此。 这一难题通过发展能对色谱图轮廓实施数学处理的化学计量学方法已经解决 ，包括模式识别方法的化 学计量学已经用来估计一系列质量特征，例如香气、味道、香味等，已经用于精油、水果、酒类的质量 评价
[6]
3.1 烟叶中多酚类物质的 HPLC 分析 一般来说，烟草多酚分析局限于测定烟叶中所谓“典型 5 种”，即绿原酸及其异构体新绿原酸和 4-O-咖啡酰基奎尼酸、莨菪葶和芸香苷。其它多酚类物质存在的量很低，因而对烟叶质量没有影响
22] [4, 19,
。 在 2.2 所述实验条件下，本工作得到的烤烟烟叶的典型 HPLC 图谱如图 1 所示。本工作所研究试样
所以一直试图发展更可靠的技术，如反射分光光度法，但后一方法只有通过数据统计处理才能得到令人 满意的结果
[12]
。模式识别方法能够通过天然产物组分色谱图轮廓的数据处理，以定量的术语提供质量评
价的具体信息。文献[13, 14]基于烟草中多酚类物质高效液相色谱(HPLC)图轮廓的模式识别，评价了几 种保加利亚烤烟和香料烟烟叶的颜色性能。 关于用 HPLC 法分析测定烟草中多酚类物质含量的方法，已经有许多报道
芸香苷，典型的相对标准偏差在 5％以内。
图 1 烟草试样ห้องสมุดไป่ตู้酚物质的典型 HPLC 图 Fig.1 A typical HPLC response curve of polyphenols in tobacco samples
-1 -1
磷酸二氢钾缓冲溶液，B 为无水甲醇。梯度洗提程序为：0min 时，90％A＋10％B；10min 内，A 减至 0， B 增至 100％；维持 100％B10min；20min 内，A 增至 90％，B 减至 10％；维持 90％A＋10％B25min。 2.3 模式识别方法 首先，根据烟叶试样中多酚的 HPLC 谱图，确定几种代表性组分，这些组分应是所有待研究烟叶中 都存在的。然后建立各种试样的浓度比矩阵。本文中的矢量元素就是各种组分的浓度或百分含量（由色 谱图上峰面积计算） 。浓度比就是试样中每种组分的浓度被这些组分之一的浓度去除所得的比值，这样 就可以得到一个三角矩阵，该矩阵包含一系列对角元素，所以称为浓度比矩阵。最后，根据下述方法编 程计算两种试样的颜色相似性标度参数 TK ：
[2, 19, 21, 22]
。
云南产烤烟型烟叶是我国卷烟企业最主要的烟叶原料。本工作旨在基于烟草中多酚类物质的 HPLC 谱图轮廓数据，尝试运用模式识别方法定量表征有代表性的云南烤烟烟叶的颜色性能。 2 2.1 实验部分 材料、仪器与试剂 实验用烟叶原料均取自我厂烟叶仓库，均为 2004 年度外购或自制烤烟型复烤片烟，产地分别为云 南昆明、思茅、宣威、大理、楚雄、保山、会泽等，烟叶等级包括 C1F、C2F、C3F、C2L、B2F 和 X1L 等。 Alliance 高效液相色谱仪（Waters 公司） ，包括 Waters 2695 分离系统（四元泵、柱温箱及自动进 样器）和 2996 紫外二极管矩阵检测器（PDA） ，Millennium 色谱软件控制仪器并处理数据。 甲醇为 HPLC 专用试剂（MERCK 公司） ，水为石英亚沸蒸馏水，并经 Milli－Q 超纯水仪（Millipore 公司）处理，电阻率≥18Ω·cm。绿原酸、咖啡酸、芸香苷、莨菪葶标准品分别购于 Sigma 和 Fluka 公 司，含量＞95％。 2.2 多酚的 HPLC 测定 将复烤片烟蒸馏回潮，使烟叶湿度达 10－13％；用切丝机将回潮片烟切丝，烟丝宽度 0.8-1.0mm； 烟丝置于 40℃烘箱中烘干 4h；用粉碎机将烘干烟丝粉碎为粉末，过 80 目筛，储于磨口试剂瓶中。 准确称取 0.400g 烟末试样置于干燥洁净的 100mL 锥形瓶中，加入 50.00mL60％（V/V）甲醇/水溶 液，旋涡混匀后，常温超声萃取 30min，再旋涡混匀。静止数分钟后，移取 5mL 上层清液，以低压过滤 方式通过预处理好的 Superlco Supelclean ENVI-18 固相萃取小柱（预处理：先用 20mL 无水甲醇润洗，
29. 用高效液相色谱法定量表征云南烤烟烟叶的颜色相似性
毛友安 ，刘巍，董道竹，卢红兵，钟科军 (常德卷烟厂技术中心，湖南常德 415000)
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摘
要
用高效液相色谱法 （HPLC） 分析了 17 种云南产烤烟型烟叶中多酚类物质， 并定量测定了 7 种主要烟草多酚物质，
用模式识别方法处理了 HPLC 测定多酚的谱图轮廓数据，计算了这些烟叶之间的颜色相似性标度参数 TK 值，并与人工感 官结果进行了比较。结果表明，通过用模式识别技术处理多酚的 HPLC 轮廓数据，可以定量表征不同等级云南烟叶之间的 颜色相似性。模式识别方法处理与感官评价结果基本一致，但前者更客观。因此，模式识别技术可以作为客观评价烟叶 颜色质量、弥补人工感官方法的工具。 关键词 高效液相色谱，云南烤烟烟叶，颜色相似性，多酚，模式识别
的 HPLC 图都包含 7 个易分辨的多酚组分峰。绿原酸、咖啡酸、莨菪葶和芸香苷色谱峰的识别通过使用 标准物对照进行，对没有获得标准物的那些组分（如新绿原酸和 4-O-咖啡酰基奎尼酸）峰的归属是基于 文献[21]的保留时间顺序进行的。组分峰 1、2 和 3 分别被识别为新绿原酸，绿原酸和 4-O-咖啡酰基奎 尼酸；峰 4、5 和 6 分别被识别为咖啡酸、莨菪葶和芸香苷；峰 7 也是一种多酚类物质，与文献[21]中 组分 9 和 10 之间的未识别的小峰属同一种组分，在此未作进一步识别。 采用工作曲线法进行定量分析。先分别用绿原酸、咖啡酸、莨菪葶和芸香苷标样制备工作曲线，然 后根据待测组分峰面积，由工作曲线求其含量。对另外 3 种无标样组分进行近似处理，即根据其结构与 光学特性相近原理，分别用绿原酸的校正曲线计算新绿原酸（5-o-caffeoylquinic acid, 简称为 5-o-acid）和 4-O-咖啡酰基奎尼酸（4-o-caffeoylquinic acid, 简称为 4-O-酸或 4-o-acid） ，用芸香 苷的校正曲线计算未知组分 7 的含量。实验结果表明，方法重现性良好，对绿原酸、咖啡酸、莨菪葶和
n −1 i −1 2 x(i, j ) 2 TK = (1 − ) ∑∑ n(n − 1) i = 2 j =1 a(i, j )
[6]
（1）
其中，n 为试样中代表性组分峰的数目，x（i,j）和 a（i,j）分别为试样 X 和 A 的浓度比矩阵的一 般元素。如果 x（i,j）/a(i,j)>1，则采用其倒数值计算。 TK 值是这种模式识别方法对两种试样的颜色相似性标度。TK 值越小，两种试样的颜色越相似；TK 值越大，两种试样的颜色差异性越大。但一般来说，当 TK<0.08 时 ，试样的颜色已非常相似，不易区 分。 3 结果与讨论
R 32
再用 30mL 纯水活化） ，收集滤液，然后用 2－3mL 无水甲醇洗脱小柱，收集洗脱液，并与滤液合并，定 容至 10mL，取 1mL 置于 2mL 液相色谱瓶中备用。 色谱分析在如下条件下进行：色谱柱 NOV-PAK-C18（250mm×4.6 mm×5μm） ，柱温 38℃，柱压 进样量 5μL。 流动相由 A+B 组成， A 为 0.05moL·L 2400-2700Psi， 检测波长 324nm， 洗脱液流速 1mL·min ，
1
引
言
多酚类物质是指分子结构中含有多个酚羟基的化合物， 它们是烟草中一类主要的次生化合物。 烟草 中多酚物质主要包括单宁类（如绿原酸及其异构体） 、香豆素类（如莨菪葶、莨菪灵、七叶葶等） 、黄体 酮类（如芸香苷、黄体酮、鼠李糖、黄体酮醇、山萘酚糖苷、槲皮苷等） 、花色素类（如花色素 3 芸香 糖苷、花葵素 3 芸香苷、莰非醇等）及简单酚的衍生物等 是烟草中最主要的多酚类物质 其含量一般达 3％以上。 多酚类物质对烟草质量的重要性早已被认识 。多酚类物质及其分解产物与烟草的香味相关，多酚 类化合物是对产生烟气芳香气味有贡献的一类物质，而且与烟草制品的等级呈正相关，多酚类物质含量
[6-10] [5]
以及医学诊断中
[11]
。然而，将模式识别方法用于烟草方面，目前只有很少报道
[12-14]
。
颜色和香气是反映烟叶质量的两个重要特征，它们分别与烟叶中的多酚类物质和精油成分有关，这 一点已被许多研究证实
[4, 15-20]
。当前评价烟叶颜色的方法主要是感官评价。由于这种方法是主观性的，