DNA分子标记及其在作物品种鉴定上的应用

第２９卷第１１期２０１１年１１月河南科学

ＨＥＮＡＮＳＣＩＥＮＣＥ、，０１．２９Ｎｏ．１ｌ

Ｎｏｖ．２０ｌｌ

文章编号：１００４－３９１８（２０１１）１１－１３３５－－０４

ＤＮＡ分子标记及其在作物品种鉴定上的应用张曼１，胡建斌－，‘孙守如ｔ，李永鑫２（１．河南农业大学园艺学院，郑州４５０００２；２．河南省科学院，郑州４５０００２）摘要：阐述了ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ，ＡＦＬＰ，ＳＳＲ、ＳＲＡＰ等ＤＮＡ分子标记技术的原理、特点，介绍了这些分子标记技术在作物品种真伪性和纯度检测中的应用，最后对其发展进行了展望．

关键词：ＤＮＡ分子标记：作物；品种真伪性鉴定；纯度检测中图分类号：Ｓ１８８＋．１文献标识码：Ａ

种子纯度是种子质量的核心指标，是种子质量分级的主要标准．在制种过程中由于母本自交和姊妹交会形成假杂种，另外，人们在操作过程中相互传粉，家畜、鸟类、蜜蜂等造成串粉，此外在收获、脱粒、加工贮藏、包装、销售的过程中，其他作物或同种作物不同品种的种子机械混杂或人为混杂也在所难免．随着商业化育种的推进和种质资源利用的受限，造成种质基础较窄，致使商业品种问的遗传相似性愈来愈高，同种异名、同名异种现象日益严重，种子质量纠纷时有发生，直接影响到农业增产和农民增收．目前，我国很多作物品种真伪与纯度鉴定大多依靠田间表现鉴定，此方法依赖于品种表现型差异，用于品种真实性和纯度鉴定虽然直观简单，但是鉴定工作量大，占地面积大，费用高、受季节的限制，而且作物的表现型容易受到栽培措施和环境条件的变化而变化，特别是对于一些形态差异比较小的品种问鉴定难度比较大，可能影响到品种纯度鉴定的准确性，并直接影响到良种的推广；此外由于鉴定周期长，有些作物进行田间鉴定需要依靠果实的形态进行鉴定，用时较长，当年生产的种子往往要到次年才能销售，造成商机错失、种子积压．为解决这些难题，迫切需要研究开发能在早期、周年、快速、准确鉴定作物品种真伪和纯度的检测方法．

１分子标记特点及其在品种纯度鉴定中的优越性分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种比较理想的遗传标记形式，它能够反映生物个体或者种群间基因组中某种差异特征的ＤＮＡ片段，能够直接反映基因组ＤＮＡ问的差异．ＤＮＡ分子标记与前３种遗传标记相比，具有诸多独特的优点：①直接以ＤＮＡ的形式表现，不受组织类别、发育阶段等因素制约．植物的任何组织在任何生长阶段都可以进行ＤＮＡ分子标记分析，不存在表达与否的问题；②遗传稳定，不受环境因素的影响；③能够区别纯合体和杂合体，提供完整的遗传信息，因为分子标记多为共显性的特点；④多态性高，自然界中存在许多等位变异，无须人为创造；⑤标记数量多，可以遍及整个基因组，可检测座位几乎是无限的；⑥表现为中性，不影响目标性转的表达；⑦操作简便、迅速，提取的ＤＮＡ样品在适宜的温度条件下可以长期保存，易于实现自动化．因此，ＤＮＡ分子标记技术在杂交种子纯度检测中得到了快速应用．

２分子标记技术的种类及其在作物品种鉴定中的应用目前，被广泛应用的ＤＮＡ分子标记主要有ＲＦＬＰ（限制性片段长度多态性）、ＲＡＰＤ（随即扩增多态性ＤＮＡ）、ＡＬｆ’Ｐ（扩增片段长度多态性）、ＳＳＲ（简单重复序列）、ＳＲＡＰ（相关序列扩增多态性）等．２．１基于杂交的分子标记限制性长度片段多态性（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）．由Ｂｏｔｅｓｉｎ于１９８０年提出，开

创了直接应用ＤＮＡ多态性的新阶段，它是基于Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交技术为基础的第一代分子标记，是最早应用的

分子标记技术ｆ１Ｊ．ＲＦＬＰ基本原理是利用限制性内切酶酶切基因组ＤＮＡ，使之产生不同大小的ＤＮＡ片段；电

收稿日期：２０１ｌ－０８—２４基金项目：国家农业科技成果转化资金项目（２００９ＧＢ２Ｄ（１０Ｉ吆１７）作者简介：张曼（１９８６－），女，河南商丘人，硕士研究生．研究方向为蔬菜育种及良种繁育通信作者：孙守如（１９６３一），男，河南封丘人，教授，博士，硕士生导师．

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泳后通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上；吸印的ＤＮＡ同ＤＮＡ探针杂交，而后通过放射自显影或其他技术显示杂交结果，记录ＲＦＬＰ标记．它所代表的是基因组ＤＮＡ在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异．由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异，从而产生多态性．ＲＦＬＰ的特点是：①具有共显性，不受显隐性、环境条件、发育阶段及组织部位的影响；②ＲｒＬＰ标记位点数量不受限制，通常可检测到１－４个基因座位；③结果稳定可靠，重复性好，比较适合构建遗传连锁图．该技术是最早在ＤＮＡ水平上用于品种鉴别和种子纯度分析的技术，已初步在辣椒、大白菜等作物的品种纯度和真伪鉴定．Ｍａｓｔｕｕｒａ等１２ｌ利用２个ＲＦＬＰ克隆作为探针，对黄瓜亲本及其Ｆ，杂交种进行ＲＦＬＰ分析，结果表明该方法能够快速、准确的测定出Ｆ。杂交种的纯度．但是同时也存在对ＤＮＡ多态性检出的灵敏度不高，ＲＦＬＰ连锁图上还有很多大的空间区、操作比较繁琐，成本高，检测周期长等问题．因而该方法在蔬菜作物种子生产中并没有得到推广普及，一般只可作为发生重大种子纠纷时仲裁．２．２基于ＰＣＲ技术的分子标记２．２．１随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲａｎｄｏｍＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，ＲＡＰＤ）为了克服ＲＦＬＰ技术上的不足，

美国杜邦公司的科学家Ｗｉｌｌｉａｍｆ３ｊ和加利福尼亚生物研究所的Ｗｅｌｓｈｔ４ｌ等人于１９９０年利用ＰＣＲ技术建立了ＲＡＰＤ技术．基本原理是利用随即引物（一般８—１０ｂｐ）通过ＰＣＲ反应非定点扩增ＤＮＡ片段，然后利用凝胶

电泳分析扩增片段来进行ＤＮＡ多态性研究．与ＲＦＬＰ相比，ＲＡＰＤ有以下特点：①操作简单，不需使用放射性同位素，也不需要尼龙膜转印和分子杂交等繁琐程序，一般实验室也可操作；②ＤＮＡ用量少，一次反应只需１０．５０ｎｇ模板，成本较低．方淑桂等１５１以大白菜杂交种中熟５号及其亲本为材料，应用ＲＡＰＤ技术，从

２００个随机引物中筛选出互补带明显的引物Ｓ剪，构建了相应的ＤＮＡ指纹图谱，通过对１００株中熟５号进行

纯度鉴定，结果与大田检测结果完全一致，杂交率为９８％．高蓝等［０３用ＲＡＰＤ方法完成了对番茄种子纯度的初步鉴定．戴修纯等１７Ｉ利用ＲＡＰＤ技术鉴定两个番茄一代杂种的种子纯度，建立了适合于番茄ＲＡＰＤ分析的程序，并从１００个随机引物中筛选到十几个合适的随机引物，能快速、准确地鉴定Ｆ。种子的纯度．在ＤＮＡ分析技术中，ＲＡＰＤ是最有潜力和应用前景的品种鉴定和纯度分析方法．但是ＲＡＰＤ技术还有不足之处：①它是显性遗传，无法在Ｆ２中区别纯合显性和杂合体的基因型，在基因定位、作连锁遗传距离的准确性下降；②稳定性差；③重复性差，ＲＡＰＤ对反应条件比较敏感，包括模板浓度、ＭＳ；＋浓度；④存在共迁移问题，凝胶电泳只能分开不同长度ＤＮＡ片段，而不能分开那些分子量相同但碱基序列组成不同的ＤＮＡ片段．所以，在使用此技术的时候应注意扬长避短．２．２．２简单重复序列（ＳｉｍｐｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅｐｅａｔ，ＳＳＲ）

也称微卫星ＤＮＡ，一般是指由ｌ。６个核苷酸组成的序

列以串联排列的方式组成的ＤＮＡ序列，我们称之为简单重复序列．其基本原理是：根据微卫星序列两端互补序列设计一对特异引物，通过ＰＣＲ反应扩增微卫星片段，由于基本重复单元次数不同，从而形成ＳＳＲ座位的多态性．该技术的关键在于设计出一对特异的ＰＣＲ引物．ＳＳＲ标记一般检测到的是一个单一的多等位基因位点，所需的ＤＮＡ量比较少，而且呈现共显性，可以鉴别杂合子和纯合子，实验程序简单，耗时短，结果重复性好，完全符合作物品种鉴定的４个基本准则：环境的稳定性、品种间变异可识别性、最小的品种内变异性和实验结果的可靠性．到目前为止，ＳＳＲ技术已在水稻睁¨１、玉米【１２～３１、黄瓜【１４．１６１、油菜１１７．嘲、大白菜［１９—２０ｊ等多种农作物种子的品种纯度中得到应用．李菊芬１２１】等人以西瓜杂交种“东方红ｌ号’，和“８４２４”及其各自的亲本为材料，利用特异ＳＳＲ引物ＷＳ４７和ＷＳ２７对其进行快速鉴定，结果与海南田间鉴结果相比，符合率达９８％以上．田蕾，关荣霞［２２１等采用亲本间具有多态性的３对ＳＳＲ引物对１４８个耐盐和盐敏感大豆品种正反交Ｆｌ植株进行分子鉴定，结果表明：有８１．８％的Ｆ，为真杂种，且３对多态性引物检测结果一致，在亲本基因型纯合的情况下，采用１对在亲本问有多态性的ＳＳＲ引物即可对Ｆ。真伪进行准确判断，亲本间分子量差异大的ＳＳＲ位点可用高浓度琼脂糖电泳进行快速鉴定．虽然ＳＳＲ标记测序引物开发成本比较高，但是现在已经有不少商品化的ＳＳＲ引物，另外包括玉米在内的多种作物中已经有一大批现成的公开发表的ＳＳＲ位点引物序列可免费利用，这有利于ＳＳＲ技术的发展．随着更多多态性ＳＳＲ位点的开发和ＳＳＲ检测技术的进步及普及，该项技术将在品种真实性鉴定和种子纯度检测中得到广泛应用．２．３基于ＰＣＲ与限制性酶切相结合的分子标记技术２．３．１扩增片段长度多态性（ＡｍｐｌｉｆｉｅｄＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＡＦＬＰ）该分子标记是１９９３年由衙

万方数据２０１１年１１月张曼等：ＤＮＡ分子标记及其在作物品种鉴定上的应用一１３３７－

兰科学家Ｚｅｂｅａｕ发现，后由Ｖｏｓ等１２３１发展起来的．它将基因组ＤＮＡ用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段与含有共粘末端的人工接头连接，并通过５’端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量ＤＮＡ片段，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，产生扩增片段不同的多态性带型．它是ＰＣＲ与ＲＦＬＰ相结合的一种检测ＤＮＡ多态性的技术，既有ＲＡＰＤ的灵敏性，同时也具备ＲＦＬＰ的可靠性，使用少量高效的引物组合即可获得覆盖整个基因组的ＡＦＬＰ标记．刘杰等［２４１从杂交油葵Ａ１５及其亲本的１／２于种子中提取基因组ＤＮＡ，选用１７对引物组合进行ＡＦＬＰ分析，构建了它们的指纹图谱，迸一步实验表明，ＡＦＬＰ标记检测油用向日葵品种杂交种子的纯度是可行的．王玲平，戴丹丽等人凶以瓠瓜杂种一代浙蒲２号及其父、母本和品系Ｊ０９９为材料，建立了利用ＡＦＬＰ分子标记技术进行瓠瓜杂种纯度鉴定技术体系．但ＡＦＬＰ技术对模板ＤＮＡ的纯度要求很高，ＤＮＡ质量的高低是实验成败的关键．另外，如果酶切不彻底就会出现很多高分子量的条带，重复性差．因此，ＡＦＬＰ技术不太适宜种子纯度鉴定．２．３．２相关序列扩增多态性（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ—ＲｅｌａｔｅｄＡｍｐｌｉｆｔｅｄ

Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＲＡＰ）

是由美国加州大学蔬菜作