荧光报告基因实验
双荧光报告基因分析2
双荧光报告基因分析实验目的:研究转录因子的活性和调控元件的活性。
实验原理:通过将感兴趣的目的基因转录调控元件构建到带荧光素酶（firefly luciferase）的表达载体, 如pGL3, 构建成报告基因质粒, 使这段DNA序列调控luciferase的转录。
然后将报告基因质粒转染细胞, 适当刺激或处理后裂解细胞, 并加入底物荧光素后（luciferin）, luciferase可以催化荧光素发出荧光, 从而可以通过测量荧光值的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。
为避免由于质粒转细胞时效率的差异而带来的误差, 可以同时转入Renilla荧光素酶的报告基因质粒作为内参, 即双荧光报告系统。
该实验可以用于研究转录因子对promoter或enhancer序列的调控, 也可以用于研究受体活性, 细胞内信号通路, 或者microRNA对基因表达的调控。
1．实验过程:2．质粒构建1.1载体的选择常用的载体有pGL3系列, 包括pGL3-basic(附图1a), pGL3-promoter(附图1b), pGL3-enhancer(附图1c)。
如果要研究的序列是promoter, 可选择将目的片段插入pGL3-enhancer载体；若要研究的序列是enhancer, 则可选择pGL-promoter载体。
1.2抽提基因组DNA, 并以基因组DNA为模板PCR, 克隆目的片段, 通过合适的酶切, 插入载体, 构建报告基因表达质粒。
2. 转染将报告基因质粒和作为内参的Renilla以及待研究的转录因子的表达质粒共转染细胞, 并根据需要刺激或处理细胞, 24h-48h后收细胞。
在共转染时, 由于内参质粒Renilla有很强的promoter/enhancer, 因此报告基因质粒:Renilla转染量一般为10: 1到50: 1。
3. Luciferase活性的测定（以promega的双荧光报告试剂盒为例）3.1 细胞裂解试剂盒中提供的裂解液为5X PLB（passive lysis buffer）, 使用前取1体积的PLB, 加4体积的dH2O混匀。
双荧光素酶报告基因实验步骤
双荧光素酶报告基因实验步骤实验目的：本实验采用双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告系统，探究基因调控机制。
通过构建表达报告基因的质粒，研究不同因素对基因转录的影响。
实验材料：1. 双荧光素酶检测试剂盒（Promega）2. 293T细胞系3. Lipofectamine 2000转染试剂4. 培养基（DMEM + 10% FBS）实验步骤：1. 构建表达报告基因的质粒。
选择含有目标基因启动子区域的DNA片段，与质粒载体pGL3-基因报告载体连接，形成表达质粒pGL3-目标启动子-火萤酶（Luciferase）。
2. 细胞培养。
将293T细胞接种于6孔板中，培养至70-80%的稳定生长。
注意，细胞仅用到2×105个，否则检测结果会受内源性酶的影响。
3. 细胞转染。
将转染试剂与质粒混合，加入到细胞培养皿中。
注意，Lipofectamine 2000转染试剂与质粒的比例应按照转染试剂说明书进行调整。
4. 点亮荧光素酶（Luciferase）。
在细胞转染后48小时，加入荧光素酶检测试剂和积木酶抑制剂，使细胞产生发光，并通过微量板阅读器记录荧光值。
5. 关闭荧光素酶（Luciferase）。
在荧光素酶检测试剂作用后加入积木酶检测剂，称为“阻滞液”，使细胞发出的光信号被阻断。
加入Renilla荧光素酶检测试剂，使细胞重新产生新的发光信号，并通过微量板阅读器记录荧光值。
6. 数据统计。
按照公式计算相邻荧光信号的比值（荧光素酶/Renilla荧光素酶），以此作为表达目标启动子的相对活性。
（注意，双荧光素酶检测试剂盒中已包含此项标准）实验结果：通过双荧光素酶报告系统，研究了不同生物因素对基因转录的影响。
在细胞实验中，通过记录不同重复单元（replicate）的相对活性，为科研人员提供基因调控机制的新思路。
（数据统计请参照附表）结论：本实验采用双荧光素酶报告系统，通过构建表达报告基因的质粒，检测对基因转录的影响。
双荧光素酶报告基因实验的一些影响因素及注意事项
双荧光素酶报告基因实验的一些影响因素及注意事项双荧光素酶报告基因实验的一些影响因素及注意事项1．报告基因检测受多种因素影响（载体状态、细胞状态、转染量、转染效率、裂解效率、加样精度、检测过程等），因此同批次样品检测值也可能出现浮动。
所以实验一般需要做3个或3个以上复孔，并且引入另一个报告基因作为内参。
2．细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好；长时间培养后，细胞难裂解。
3．双荧光素酶报告基因的载体选择：a)萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4的载体或自己构建相应的载体；b)海肾荧光素酶建议选取phRL-TK或pGL-4代载体或自己构建相应的载体。
建议海肾载体不使用强启动子（如SV40、CMV），而选用中等强度的启动子（如TK）。
4．双荧光素酶报告基因的载体比例：根据实验具体情况调整。
建议作一个预实验来调整（萤火虫载体与海肾载体比例分别用1：10、1：20、1：50、1：100），萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。
5．最适反应温度：室温（20-22℃）。
各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温。
6．双荧光素酶反应体积：20ul（细胞裂解产物）-100ul（萤火虫荧光素酶底物）-100ul（海肾荧光素酶底物），底物量可根据实际情况调整，但一定要保证底物过量，不然会造成检测结果出现大的偏差7．细胞裂解产物存放：常温不超过6小时；-20℃一个月；-80℃半年8．裂解产物与底物混合（手动加样）：要求混合快速、混合时间一致，避免荧光素酶衰变的影响。
9．发光半衰期：a)单荧光素酶检测试剂盒（E1500），萤火虫荧光素酶的`发光半衰期约12minb)双荧光素酶检测试剂盒（E1910），萤火虫荧光素酶的发光半衰期约9min，海肾荧光素酶的发光半衰期约2min10．检测结果检测前应检测孔板或空管的发光值，作为仪器发光背景值，Modulus多功能检测仪的仪器背景值应小于100；样品检测发光值应该远大于仪器背景值，例如10000。
荧光素酶报告基因实验原理
荧光素酶报告基因实验原理一、引言荧光素酶报告基因实验是一种常用的分子生物学技术，它可以用来研究基因的表达情况。
本报告将介绍荧光素酶报告基因实验的原理、步骤、优缺点以及应用。
二、原理荧光素酶（luciferase）是一种能够将化学能转化为光能的酶，它可以与荧光素底物发生反应，产生强烈的荧光信号。
在荧光素酶报告基因实验中，将荧光素酶基因与感兴趣的基因连在一起，构建成一个重组质粒。
当这个重组质粒被转染到细胞中时，只有在目标基因表达时才会产生荧光信号。
通过测量荧光信号的强度，可以间接地反映目标基因的表达水平。
三、步骤1.构建重组质粒：将荧光素酶基因和感兴趣的基因连接起来，并插入适当的启动子和终止子序列。
2.转染到细胞中：将构建好的重组质粒导入到感兴趣的细胞中，可以使用化学法、电转染法或病毒载体等方法。
3.添加底物：将荧光素底物注入到细胞培养基中，观察产生的荧光信号。
4.测量荧光强度：通过荧光显微镜或流式细胞术等技术测量荧光信号的强度，从而间接反映目标基因的表达水平。
四、优缺点优点：1.高灵敏度：荧光素酶报告基因实验可以检测非常低水平的基因表达。
2.高特异性：只有在目标基因表达时才会产生荧光信号，不会被其他非目标基因影响。
3.实时性：可以在活细胞中进行检测，观察动态变化。
缺点：1.需要构建重组质粒：需要进行DNA重组技术，操作复杂。
2.需要添加底物：需要购买和添加特定的底物，成本较高。
3.受到细胞状态和环境影响：细胞状态和环境对实验结果有一定影响。
五、应用1.研究基因调控机制：通过构建不同启动子或转录因子的荧光素酶报告基因，可以研究基因调控机制。
2.筛选药物：可以使用荧光素酶报告基因实验来筛选和评估药物的效果。
3.检测生物污染：可以将荧光素酶基因插入到细菌或病毒中，用于检测生物污染。
六、结论荧光素酶报告基因实验是一种常用的分子生物学技术，具有高灵敏度、高特异性和实时性等优点。
它可以用于研究基因调控机制、筛选药物和检测生物污染等领域。
双荧光报告实验步骤
双荧光报告实验步骤1. 实验目的本实验旨在使用双荧光报告基因体系，通过改变操作步骤，观察荧光信号的变化，从而了解该基因体系在实验条件下的表达情况。
2. 实验材料•双荧光报告基因体系•细胞培养基（适合目标细胞的培养基）•细胞培养器具（细胞培养箱、培养皿、离心管等）•显微镜和荧光显微镜•实验操作工具（离心机、移液器等）3. 实验步骤步骤一：细胞培养1.选取适合目标细胞的培养基，并按照相关规定配制培养基。
2.将培养基分装至培养皿中，保持无菌状态。
3.用吸管将目标细胞悬浮液加入培养皿，使细胞均匀附着在培养皿底部。
4.将培养皿置于细胞培养箱中，控制好温度、湿度和二氧化碳浓度。
5.在适当的时间点观察细胞的生长情况。
步骤二：转染双荧光报告基因体系1.将待转染的细胞收集至离心管中，进行离心。
去除上清液，保留沉淀。
2.使用合适的转染试剂将双荧光报告基因体系导入细胞。
3.转染后，将细胞培养于适合其生长的培养基中，并继续培养。
步骤三：观察荧光信号1.在一定时间后，取出培养皿，观察转染细胞的形态。
2.使用显微镜观察细胞的荧光信号。
3.如果需要，可以使用荧光显微镜进行进一步观察。
步骤四：数据分析1.根据观察到的荧光信号，记录下各组细胞的荧光强度等数据。
2.对数据进行统计学分析，比较不同实验组之间的差异性。
3.对结果进行解读，得出实验结论。
4. 注意事项1.实验过程中需保持实验环境的无菌状态，避免细菌和其他微生物的污染。
2.实验材料和工具的选择要合适，确保实验顺利进行。
3.实验步骤中的时间、温度和湿度等参数要严格控制，以保证实验结果的可靠性。
4.实验结束后，要对实验设备和实验区域进行清理和消毒，避免交叉污染。
总结通过以上实验步骤，我们可以使用双荧光报告基因体系来观察荧光信号的变化情况。
这个实验体系可以广泛应用于生物学、医学等领域的研究中，帮助人们了解细胞的表达情况和功能特性。
在实验中，要注意保持实验环境的无菌状态，严格控制实验参数，以获得可靠的实验结果。
荧光素酶报告基因
荧光素酶报告基因荧光素酶报告基因是一种常用的生物标记物，广泛应用于分子生物学和细胞生物学领域。
它能够通过荧光素酶的催化作用，将底物荧光素氧化成发光产物，从而实现对特定基因的检测和表达分析。
荧光素酶报告基因的应用不仅提高了基因检测的灵敏度和准确性，还为研究人员提供了一种简便、快速、高效的基因表达分析方法。
在实验室研究中，荧光素酶报告基因常被用于分析基因的启动子活性、转录水平和蛋白质结合活性。
通过将荧光素酶报告基因与感兴趣的基因或启动子连接，研究人员可以利用其发光信号来监测特定基因的表达情况。
这种非破坏性的检测方法不仅避免了对样本的破坏，还能够实现实时、动态的监测，为基因表达调控研究提供了有力的工具。
除了在基础科学研究中的应用，荧光素酶报告基因还被广泛应用于生物医学领域。
在药物研发和药效评价中，荧光素酶报告基因可以用来筛选潜在的药物靶点和评价药物的活性。
通过构建荧光素酶报告基因的转基因小鼠模型，研究人员可以实现对药物代谢、毒性和药效的实时监测，从而加速新药的研发过程。
此外，荧光素酶报告基因还被应用于基因敲除和基因编辑技术中。
通过将荧光素酶报告基因与CRISPR/Cas9等基因编辑工具相结合，研究人员可以实现对特定基因的精准编辑和修复。
荧光素酶报告基因的高灵敏度和高特异性，为基因编辑技术的研究和应用提供了重要的技术支持。
总的来说，荧光素酶报告基因作为一种重要的生物标记物，在生命科学研究和生物医学应用中发挥着重要作用。
它不仅为基因表达分析提供了一种简便、快速、高效的方法，还为药物研发、基因编辑和基因治疗等领域提供了重要的技术支持。
随着生物技术的不断发展和完善，相信荧光素酶报告基因在未来会有更广泛的应用前景。
双荧光素酶报告基因检测实验过程
双荧光素酶报告基因检测实验过程在生物实验室里，双荧光素酶报告基因检测可真是一门有趣的技术。
听起来复杂，其实也不难，咱们就来聊聊这其中的酸甜苦辣吧。
双荧光素酶就像两个好朋友，默契配合，帮助我们探测基因的活动。
想象一下，一对小伙伴儿，打着灯笼，帮你照亮那条神秘的基因小路。
你看看，这灯光一亮，哎呀，所有的秘密都暴露无遗了！咱们实验的第一步就是准备样品。
这个过程呢，就像做一顿美味的家常菜，得有好食材。
我们需要选择适合的细胞或者组织，像是挑选新鲜的蔬菜水果一样，小心翼翼。
然后把这些样品处理得干干净净，保证它们能发出耀眼的荧光。
你瞧，这准备工作就像打好基础，只有基础打牢，后面的实验才会顺顺利利。
就这点小细节，可别大意了哦。
就是要把我们的双荧光素酶基因转染到细胞里。
转染的过程其实挺像是给细胞植入一个小秘密，嘿嘿，细胞可不知道它们要接收什么新鲜玩意儿。
一旦转染成功，细胞就开始疯狂表达这两个荧光素酶，像是开了趴一样热闹。
不久后，这些小家伙儿就会开始发光，灯火通明。
这时候，你可能会想，“哇，真的发光了？”没错，这就是科学的魅力，真是让人惊叹不已啊。
然后，我们就得用荧光显微镜来观察这些细胞。
看着这些发光的小家伙，就像看星星一样，特别美妙。
这里的关键在于调节显微镜的参数，光亮得刚刚好，不多不少。
太亮了可能看不清，太暗了就显得有些无趣。
就像调味料，得掌握好分寸。
这个过程有点像是在做一场灯光秀，要把每一个细节都调到最佳，才能让你眼前一亮。
然后呢，咱们得定量分析一下这些荧光的强度。
说白了，就是要算一算，哪些基因在欢欢喜喜地工作，哪些可能在“打瞌睡”。
这可不是简单的算术题，而是一场数据的盛宴。
把所有的荧光强度都记录下来，汇总成一个漂亮的数据表。
看到那些图表的时候，你会觉得，哎，自己的努力真是没有白费。
每一个数字都像是一颗颗璀璨的宝石，闪闪发光。
哦，对了，实验过程中还得小心翼翼，不要让外部因素影响到结果。
就像在厨房里，锅得掌握好温度，火候过了就糟糕了。
荧光素酶报告基因检测
荧光素酶报告基因检测荧光素酶报告基因检测是一种常用的生物学实验技术，它利用荧光素酶作为报告基因，通过检测其活性来研究目标基因的表达情况。
荧光素酶报告基因检测技术具有灵敏度高、操作简便、结果快速等优点，在分子生物学研究和生物医学领域得到了广泛的应用。
荧光素酶报告基因检测的原理是利用荧光素酶与其底物荧光素结合产生荧光反应，从而实现对目标基因表达的定量和定性检测。
在实验操作中，首先需要构建含有荧光素酶报告基因的表达载体，然后转染至目标细胞中。
随后添加荧光素底物，荧光素酶与底物结合产生荧光信号，通过荧光测定仪器检测荧光强度，从而反映目标基因在细胞中的表达水平。
荧光素酶报告基因检测技术在基因表达调控、信号转导、蛋白质相互作用等方面发挥着重要作用。
通过该技术可以实现对基因表达水平的定量检测，进而研究基因的调控机制和功能。
在药物筛选、基因治疗、疾病诊断等领域，荧光素酶报告基因检测也被广泛应用，为生物医学研究和临床诊断提供了重要的实验手段。
荧光素酶报告基因检测技术的发展不断推动着生物学研究的进步，但在实验操作中也需要注意一些关键问题。
例如，合理设计实验方案、选择合适的表达载体、优化转染条件等，都会对实验结果产生重要影响。
因此，在进行荧光素酶报告基因检测时，需要充分了解该技术的原理和操作要点，严格按照操作规程进行实验操作，确保获得准确可靠的实验结果。
总的来说，荧光素酶报告基因检测技术作为一种重要的生物学实验技术，具有广泛的应用前景和重要的科学研究意义。
通过对目标基因表达水平的检测和分析，可以深入了解基因调控机制、信号转导途径等生物学问题，为生命科学领域的研究提供有力支持。
随着生物技术的不断发展和完善，相信荧光素酶报告基因检测技术在未来会发挥更加重要的作用，为人类健康和生命科学研究做出更大贡献。
双荧光素酶报告基因
双荧光素酶报告基因双荧光素酶（dual-luciferase）报告基因是一种常用的生物学工具，广泛应用于生物荧光信号的定量检测。
它可以帮助科研人员更准确地研究细胞的生物过程，如基因表达调控、蛋白质相互作用等。
本文将介绍双荧光素酶报告基因的原理、应用以及未来的发展方向。
双荧光素酶报告基因的原理基于荧光素酶（luciferase）的发光反应。
荧光素酶分为火焰荧光素酶（firefly luciferase，FLuc）和海蟑螂荧光素酶（Renilla luciferase，RLuc）两种。
FLuc是一种生物体内广泛存在的酶，能将底物D-荧光素磷酸酯（D-luciferin）氧化为产生黄绿色的荧光。
而RLuc则能将底物深海蟑螂荧光素酯（coelenterazine）氧化为产生蓝绿色的荧光。
双荧光素酶报告基因的主要用途是测定基因表达的活性。
在实验中，研究者将希望研究的基因启动子区域与荧光素酶报告基因FLuc或RLuc相连构建成转染载体。
接着，将该转染载体与内参基因载体同时转染至细胞中。
内参基因载体中含有RLuc基因，用于校正实验中的转染效率和细胞数的变化。
转染后，利用荧光素底物对FLuc和RLuc进行反应，测定二者的荧光强度。
通过确定FLuc和RLuc荧光强度的比值，可以消除转染效率和细胞数的影响，准确反映基因表达活性的变化。
双荧光素酶报告基因在生命科学中有着广泛的应用。
首先，在基因表达调控的研究中，双荧光素酶报告基因可以帮助研究者分析不同启动子的活性，揭示基因调控网络的机制。
此外，它还可以用于研究RNA干扰（RNAi）技术的效果，评估基因沉默的程度。
其次，双荧光素酶报告基因也被广泛应用于研究蛋白质相互作用。
通过将FLuc和RLuc融合到感兴趣的蛋白质上，可以实时监测蛋白质相互作用的强弱和时空分布。
此外，双荧光素酶报告基因还可以用于筛选药物分子，评估其对某一特定信号通路的影响。
未来，双荧光素酶报告基因技术还有许多发展方向。
双荧光素酶报告基因
双荧光素酶报告基因双荧光素酶报告基因（双荧光素酶报告基因，Dual-Luciferase Reporter Assay System）是一种用于研究基因调控和信号转导的常用实验技术。
该技术利用双荧光素酶作为报告基因，通过测定其荧光素酶活性来分析靶基因的启动子活性、miRNA的靶向调控等生物学过程。
本文将介绍双荧光素酶报告基因的原理、操作步骤以及应用范围，希望能够为相关研究人员提供一些参考和帮助。
原理。
双荧光素酶报告基因系统主要由两种荧光素酶构成，火萤酶（Luciferase）和甲氧基荧光素酶（Renilla）。
其中，火萤酶作为实验基因的报告基因，用于研究感兴趣基因的启动子活性或miRNA的靶向调控；而甲氧基荧光素酶则作为内参基因，用于校正转染效率和荧光素酶活性的差异。
通过在细胞中共转染携带不同启动子序列的火萤酶报告基因质粒和甲氧基荧光素酶质粒，再分别加入两种底物来测定其荧光素酶活性，从而得出感兴趣基因的表达水平和启动子活性。
操作步骤。
1. 细胞培养和转染，将感兴趣的细胞系进行培养，并在适当的时机进行转染，使其表达双荧光素酶报告基因系统中的火萤酶和甲氧基荧光素酶。
2. 荧光素酶活性检测，在转染后的适当时间点，加入火萤酶底物和甲氧基荧光素酶底物，分别测定其荧光素酶活性。
3. 数据分析，根据实验结果，计算出火萤酶活性与甲氧基荧光素酶活性的比值，得出感兴趣基因的表达水平和启动子活性。
应用范围。
双荧光素酶报告基因系统广泛应用于基因调控和信号转导等研究领域。
例如，用于筛选miRNA的靶基因、研究转录因子对启动子的调控、评价药物对基因表达的影响等。
此外，双荧光素酶报告基因系统还可以用于高通量筛选和药物研发等领域。
结语。
双荧光素酶报告基因系统作为一种灵敏、快速、准确的基因表达分析技术，已成为生物学研究中不可或缺的工具。
通过测定火萤酶和甲氧基荧光素酶的活性，可以全面地了解靶基因的表达水平和启动子活性，为研究人员提供了重要的实验数据。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
荧光报告基因实验一、什么是荧光素酶和双荧光素酶？荧光素酶报告基因检测是以荧光素（luciferin）为底物来检测萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）活性的一种报告系统。
荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光（bioluminescence），可通过荧光测定仪设备测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光，常应用于miRNA靶基因验证及启动子转录活性调控等方向研究。
利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上/下游，构建成荧光素酶报告质粒。
然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。
通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。
双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。
萤火虫荧光素酶是从甲虫（Photinus pyralis）中分离得到，分子量为61kDa；海肾荧光素酶（Renilla Luciferase）则是从海肾（Renilla reniformis）中分离，分子量为36kDa。
（一）两种酶的区别？1. 底物和辅因子不同：萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发光；而海肾荧光素酶仅需要腔肠素（coelenterazine）和氧气。
2. 发光的颜色不同：萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。
正是由于这两种酶的底物和发光颜色不同，所以在双报告实验中得到广泛应用。
（二）为什么采用双荧光素酶报告系统？单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。
一般情况下，海肾荧光素酶基因作为内参使用，将带有海肾荧光素酶基因的质粒与报告基因质粒共转染细胞；或是将两个报告基因构建到同一个质粒上，分别用不同的启动子启动其表达。
计算结果时，将萤火虫荧光素酶的检测值比上海肾荧光素酶检测值（Firefly Luciferase/ Renilla Luciferase），这样就可以减少内在变化因素对实验准确性的影响，相当于做了标准化，使测试结果不受实验条件变化的干扰。
（三）双荧光素酶报告基因检测有哪些常用的载体？1. 两种荧光素酶分别位于两个载体上。
比如研究miRNA的靶基因实验时，这两种载体分别为：（1）pMIR-REPORT载体：它用来插入miRNA靶序列，评估细胞内miRNA 功能。
该载体包含一个CMV启动子控制下的萤火虫荧光素酶报告基因。
在荧光素酶基因的3'UTR区域包含一个多克隆位点，用于插入预测miRNA的结合靶序列或其他核苷酸序列。
若荧光素酶活性下降，说明该段插入序列受到miRNA调节，这模仿了miRNA靶序列的作用方式。
（2）pRL系列载体（以pRL-CMV为例），pRL系列载体可在哺乳动物细胞中组成型地表达海肾荧光素酶。
又如，研究转录因子和启动子的实验时，两种载体分别为：（1）pGL4.20载体，pGL4.20载体含Luciferase荧光素酶报告基因，无启动子，用于研究目的启动子的功能，在荧光素酶基因的上游包含一个多克隆位点，用于插入启动子序列，若Luciferase荧光素酶活性上升，说明该段启动子受到转录因子的调控。
（2）pRL系列载体。
2. 两种荧光素酶位于同一个载体上。
这样偏差更小，毕竟转染一个质粒比转染两个质粒要容易，在这方面，根据检索到的资料显示，现在的这类质粒比较有名的是Promega公司的pmirGLO质粒。
二、双荧光素酶报告系统有哪些应用？（一）验证microRNA同某基因mRNA靶向互作。
将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，如果萤光素酶活性下降，则提示为其靶序列。
（二）验证microRNA同lncRNA靶向互作。
将候选的lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，检测萤光素酶活性。
（三）验证特定转录因子同其调控序列的作用。
将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达该转录因子，可分析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性。
（四）启动子结构分析。
将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体，检测其启动子活性。
（五）启动子SNP分析。
一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用萤光素酶报告系统分析其相对活性。
（六）可以分析信号通路是否激活。
将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，在不同上游信号条件下，萤光素酶活性代表了通路的下游响应。
如将HIF1α的响应原件hypoxia-responsive element(HRE)插入luciferase报告载体构建稳转细胞株，可以用于低氧相关通路的研究。
又如，在GPCR研究中，将cAMP response element（CRE）载入报告基因载体，构建稳定表达细胞株后，可以用于分析GPCR的激活与抑制剂筛选。
三、实验步骤（以验证Gene A为miRNA的靶基因为例）主要分为：质粒转染细胞→双报告基因检测→统计学分析。
1.需要的病毒或者质粒：miRNA-Ctrl/miRNA-OE（miRNA的ctrl和OE可以提前包好病毒）pMIR-REPORT（不插入任何片段，作为control）pMIR-REPORT-WT（将Gene A的3’UTR插入pMIR-REPORT）pMIR-REPORT-MT（将Gene A的3’UTR突变后插入pMIR-REPORT）pMIR-REPORT-miRNA pos（将miRNA的反向互补序列插入，作为阳性对照）pRL-CMV（作为内参）（根据实验需要也可以再设置siRNA组）2.实验步骤（以24孔板为例）·Day1 种细胞于24孔板·Day2 病毒感染（根据实验加入一定量的miRNA-Ctrl/miRNA-OE）·Day3 Report质粒转染（以24孔板一个孔为例，实验时可配置成Mix逐孔加入以减少误差）:25ul opti-MEM+300ng plasmid+10ng pRL-CMV25ul opti-MEM+0.45ul lip20006h后换液（实验分组可参考下图，每个组可以设置3个重复孔）·Day4 双报告基因检测（1）1 X cold PBS清洗一遍，加入80-100ul lysis buffer（buffer用量可以根据细胞量进行调整）；（2）在摇床上冰上被动裂解30min；（3）4℃，12000rpm离心10min；（4）吸取上清10ul于luciferase 专用96孔板；（5）依次加入50ul Firefly Luciferase Buffer(FB)或50ul Renilla Luciferase Buffer(RB)（RB中加入腔肠素，现用现加,FB和RB可在441室再加入）;（6）酶标仪检测发光。
四、数据分析（以miRNA调控靶基因的实验为例）1.先计算出每孔的Firefly Luciferase/Renilla Luciferase的比值(F/R，第4列和第10列)；2.求出miRNA-Ctrl三个重复孔的平均值（下图第5列average1）；3.再以miRNA-Ctrl组的average1为标准1，用miRNA-OE组的F/R三个重复值（第10列）分别除以average1 得到三个ratio(相当于进行了一个标准化);4.求出ratio的平均值作为average2。
5.分别用average1和average2的值作柱状图。
五、常见问题分析正是由于报告基因检测结果受多种因素影响，如载体状态、细胞状态、转染量、转染效率、裂解效率、加样精度、检测过程等，一旦某个细节处理不好，都可能导致实验失败或结果的不准确。
（一）荧光值过高荧光值过高可通过以下方式尝试解决：1. 减少质粒转染量；2. 细胞样品裂解后，离心取上清后可适当稀释后检测。
注：不建议通过减少底物量来降低荧光值，需要保证底物的饱和来反映荧光素酶真实的表达水平，否则会造成检测结果出现大的偏差。
（二）荧光值过低若检测到的荧光值比较低或无荧光值，可从样品裂解效率、转染效率、检测过程等这几方面进行考虑：1.转染效率低（1）优化转染实验条件；（2）确保转染DNA的质量，可通过酶切或琼脂糖凝胶电泳的方法对DNA 质量进行鉴定；（3）选择活性较高，处于指数分裂期的细胞进行转染。
2.检测过程操作不规范（1）需加入足量底物，保证底物的饱和，否则会造成检测结果出现很大偏差；（2）室温反应。
反应时各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温；（3）荧光素酶的半衰期一般约30min，加完底物后可立即检测，尽量在30 min内完成。
3.底物氧化失效（1）底物避光密封保存，萤火虫荧光素酶底物-20℃保存；海肾荧光素酶底物推荐-80℃保存；（2）反应工作液建议现用现配。
（三）复孔重复性差报告基因检测实验受多种因素影响，因此同批次样品检测值也可能出现浮动。
除了引入另一个报告基因作为内参照避免实验条件变化的干扰之外，一般还需设置3个复孔。
想要得到一个准确的结果，应尽可能减小复孔之间的差异性：1. 细胞裂解后建议离心取上清，保证样本的均一性；2. 保证加样的准确性，移液器需定期校准，确保移液精准；注：荧光素酶报告基因实验的检测结果非常灵敏，复孔之间的数值有一定差异是正常的，一般认为在同一个数量级的差异是可以接受的。
六、荧光素酶报告基因还有哪些其他用法？荧光素酶基因还可以用来标记细胞和活体动物，步骤如下：·将荧光素酶基因插到预期分析的细胞染色体内；·通过单克隆细胞技术的筛选，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时, 荧光素酶也会得到持续稳定的表达；·将标记好的细胞接种到实验动物体内后，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。
这种酶在ATP，氧存在的条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。
荧光素酶报告基因标记活体动物的应用领域：（1）肿瘤学：荧光素酶报告基因活体成像能够让研究人员能够直接快速的测量各种癌症模型中肿瘤的生长、转移以及对药物的反应。
非常适合于肿瘤体内生长的定量分析，避免宰杀老鼠。
（2）干细胞与免疫学：萤火虫荧光素酶报告基因做示踪标记干细胞，将目的基因与萤火虫荧光素酶基因融合融合表达，做成转基因小鼠，进行干细胞移植，可以用活体生物发光成像技术示踪干细胞在体内的增殖、分化及迁徙的过程。