细胞冻存、复苏、传代、转染(超详细版)(优质严制)

细胞培养系列方法

【实验前准备】

（1）实验前准备好高压的离心管、冻存管、1ml/100ul枪头、PBS溶液。

（2）清洁超净工作台面，照紫外30分钟；同时根据需要将培养基、胎牛血清、胰酶PBS液、双抗置于室温下复温。

细胞的冻存与复苏

【实验用品】

（1）材料：培养的贴壁细胞（70%-80%融合）、于液氮中冻存的细胞

（2）试剂： PBS液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM培养基、胎牛血清、二甲亚砜（DMSO）、双抗

（3）设备：培养瓶、巴氏吸管、15ml离心管、1.5ml冻存管、盛酒精的喷壶、

培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微镜、超净工作酒精灯、水浴锅、CO

2

台。

试剂配制：（1）完全培养基含90%DMEM培养液加10%的胎牛血清加1%的双抗。

（2）冻存液含80%的DMEM培养基加10%的胎牛血清加10%的DMSO，用吸管混匀，置于4℃冰箱中备用。

细胞的冻存

(1)依照传代的方法用0.25%胰蛋白酶液对处于对数生长期的单层细胞进行消

化。

(2)收集消化细胞于离心管中，800-1000r/min离心5min。

(3)弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为

5*106-1*107个/ml。

(4)每个冻存管分装细胞悬液1.5ml，旋紧冻存管的盖，并用封口膜密封。

(5)在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻存人名等。

(6)将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：4℃,0.5h→-20℃，1h→-80℃，过

夜→转入液氮灌中。

细胞的复苏

（1）准备水浴锅，调温度至37℃。打开离心机。

（2）用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管1只，迅速将其置入38℃水浴锅中，不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。

（3）用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中。

（4）将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加10倍体积的DMEM培养基，吹打混匀。

（5） 1000r/min离心5min，弃上清液。

（6）加入培养液吹打沉淀的细胞，使其悬浮，对细胞进行计数。

（7）按5*105个/ml的细胞浓度，将细胞接种在培养瓶中，置于培养箱中培养。（8） 24h后取出培养瓶，观察细胞生长状况。

【注意事项】

（1）对数期的细胞增值能力强，冻存后生存率较高，因此，在进行细胞冻存时，应尽量选择处于此期的细胞加以冻存。

（2）为了保证复苏后细胞的存活率，复苏接种时，细胞的浓度不能太低，最好控制在5*106-1*107个/ml，这样才能保证复苏成功。

（3）冻存管的瓶盖应封盖严密，以免复苏时细胞外溢。

（4）复苏时，从液氮取出冻存管到水浴中融化的过程要快，否则会导致冰晶的形成，伤害细胞。同时，一次复苏的冻存管数量不要太多，否则会引起水

浴锅中传热不佳，延缓冻存的细胞悬液融化的时间。

（5）为防止液氮冻伤，注意戴上防护手套。

【实验结果及分析】

经复苏刚接种的细胞是悬浮于培养基中的。复苏成功的细胞24h左右可贴壁，48h后即可开始生长、增殖。复苏不成功的细胞，将继续悬浮于培养液中，不能贴壁。

细胞的传代培养

【实验用品】

（1）材料：原代培养的肝细胞、原代培养的外周血淋巴细胞

（2）试剂：PBS液、DMEM培养基（含10%小牛血清）、0.25%胰蛋白酶消化液（3）设备：25ml培养瓶、吸管、离心管、酒精棉球、酒精灯、离心机、倒置显微镜、超净工作台、C02培养箱

【实验方案】

1.贴壁细胞的传代培养

（1）用吸管吸出原代培养的肝细胞培养瓶中培养液。

（2）向瓶内加入适量的PBS液，轻轻摇动后倒掉。

（3）每25ml的培养瓶内加入0.25%胰蛋白酶消化液1ml，消化液的量以覆盖整个细胞培养面为宜，置于37℃的培养箱环境中。轻轻摇动培养瓶，

在倒置显微镜下对培养细胞进行观察，当细胞胞质回缩、细胞间隙增

大时，迅速将消化液吸出。

（4）加入PBS液于培养瓶中，轻轻转动培养瓶，然后用吸管将溶液吸出，加入含血清的培养液终止消化。

（5）用吸管吸取培养液，反复轻轻吹打瓶壁，制备细胞悬液。吹打的部位应均匀，可按从上到下、从左到右的顺序进行，保证瓶底各个部位的

细胞均能被吹到。此外，吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以

免损伤细胞。

（6）将吹打后的细胞置于倒置显微镜下观察，当发现原贴壁的细胞均已悬浮于培养液中，成片的细胞已分散成小的细胞团或单细胞，即可终止

吹打。

（7）收集细胞悬液于离心管中，1000r/min，离心5-8min，去除上清。

（8）细胞计数，按照1*105-1*106个细胞的密度接种细胞于新培养瓶中。2.悬浮细胞的传代

（1）将原代培养的外周血淋巴细胞连同培养液一并转移到离心管中。

（2）800-1000r/min离心5min，去除上清液。

（3）加新的培养液到离心管中，吸管吹打、制悬。根据细胞的数量多少，将细胞悬液按1:2或1:3的比例分别接种于新的培养瓶中。

【注意事项】

（1）消化过程中需根据培养细胞形态的变化来严格控制消化时间。当胞质回缩、细胞间的连接变松散等情况出现时，应终止消化。因上皮样细胞彼此间连接较为紧密，其消化时的时间通常比成纤维细胞长。此外，首次传代的细胞与已建系的细胞相比，也需要更多的消化时间。

（2）首次传代的细胞因需适应新的环境，可适当增加其接种量，以促进生存与增殖。

（3）在对细胞进行吹打时，不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。（4）传代培养的过程通常较长，细胞被污染的可能增加，因此，必须严格进行无菌操作。

【实验结果及分析】

用倒置显微镜观察可见接种24h后，大多数肝细胞已贴附于培养瓶底部，有少数细胞悬浮于培养基中。48h以后，细胞开始增殖、细胞的数量增多，在接种的肝细胞或肝细胞团周围可见新生细胞长出，这些细胞内含物少而较为透明，胞体轮廓通常较浅。96h以后，培养细胞数量明显增多，并逐渐汇合，细胞轮廓清晰、可见。