实验三杀虫剂对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用
实验2 乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药
K 0K t 吸光度A实验二乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药目前有机磷、氨基甲酸酯类农药是我国大量使用的杀虫剂，虽然这类农药与过去使用的有机氯农药相比，降解速度较快，但在果蔬中的残留仍然较为严重。
由于该类农药能抑制人体内乙酰胆碱酯酶的生理活性，神经传导因此受阻，引起神经麻痹乃至死亡，对人类健康造成极大危害。
对于果蔬中的农药通常采用气相色谱等方法进行分析，但分析时间长，操作步骤烦琐，适用于实验室分析。
长期以来在大部分果蔬市场中，通常采用乙酰胆碱酯酶抑制法进行快速检测，即以乙酰胆碱酯酶作为检测试剂，采用农药残留检测仪，根据乙酰胆碱酯酶活性变化的程度来测定果蔬样品中的残留农药。
一、 实验目的1． 了解果蔬中残留农药的分析方法；2． 掌握酶抑制分析方法的原理及操作方法； 3． 理解农药残留性评价的意义。
二、 实验原理有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死，酶抑制法就是根据这一昆虫毒理学原理，对农药残留进行检测。
以乙酰胆碱为底物，在乙酰胆碱酯酶（ACHE ）的作用下，乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，胆碱和二硫双对硝基苯甲酸（DNTB ）产生显色反应，使反应液呈黄色（于410nm 处有最大吸收峰）。
根据酶促反应动力学原理，在没有有机磷和氨基甲酸酯类农药存在时，底物在酶的催化作用下发生水解，反应速率可以用吸光度值随时间的变化率K 0来表示。
当有机磷和氨基甲酸酯类农药加入到酶的显色体系中时，农药抑制了酶的活性，影响显色体系的反应速度，此时体系吸光度随时间的变化率为K t ，则有机磷和氨基甲酸酯类农药对酶的活性的抑制率Y 的计算公式如下：%10000⨯-=K K K Y tK 0：空白样品的吸光度随时间变化曲线的斜率值K t ：样品溶液的吸光度随时间变化曲线的斜率值其中K 0和K t 都可通过以下过程进行推导和计算。
喷雾杀死蟑螂的原理是啥
喷雾杀死蟑螂的原理是啥喷雾杀死蟑螂的原理主要基于喷雾剂中所含有的活性成分对蟑螂产生杀灭效果。
喷雾剂的活性成分可进入蟑螂体内，干扰其神经系统或破坏其细胞结构，最终导致蟑螂死亡。
喷雾剂一般包含杀虫剂、溶剂和助剂。
杀虫剂是喷雾剂的主要成分，其中最常见的杀虫剂包括气雾剂（如氨基甲酸酯）和液体喷雾剂（如氯虫苯甲酸酯）。
这些杀虫剂在蟑螂触碰到或吸入时会通过体表或呼吸道吸收进入体内。
溶剂和助剂主要提供稀释杀虫剂、增加喷雾剂的粘性和稳定性，并促进杀虫剂的吸收和渗透。
当喷雾剂喷洒到蟑螂的身体表面时，其主要成分可通过蟑螂的皮肤或斯坦尼吸管（spiracles）吸收进入体内。
这些成分进入体内后，会通过血管或直接扩散到蟑螂的内脏器官，如消化系统、呼吸系统和神经系统等。
不同的杀虫剂对蟑螂产生杀灭效果的机制多样，下面主要介绍几种常见的杀虫剂及其杀虫机制：1. 神经毒剂：这类杀虫剂主要通过干扰蟑螂的神经系统来实现杀灭效果。
例如，氨基甲酸酯类杀虫剂会抑制蟑螂神经细胞内乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase）的活性，导致乙酰胆碱（acetylcholine）积聚在神经突触间隙，从而干扰神经信号的传递。
这会导致蟑螂的神经系统紊乱，如抽搐、瘫痪和最终死亡。
2. 生长调节剂：这类杀虫剂主要通过影响蟑螂的生命周期和生长发育实现杀灭效果。
生长调节剂可分为昆虫激素类和昆虫生长调节剂激动剂类两大类。
昆虫激素类杀虫剂模拟昆虫体内的激素，干扰蟑螂的生长发育和生殖能力。
昆虫生长调节剂激动剂类属于激动剂类杀虫剂，它们能够诱导对昆虫生长发育过程有重要调节作用的功能蛋白过量发生，从而引起蟑螂瘫痪和死亡。
3. 胃毒剂和触杀剂：这类杀虫剂通过蟑螂通过摄食或直接接触的方式进入体内，进而对蟑螂产生杀灭效果。
胃毒剂主要通过蟑螂进食含有杀虫剂的诱饵，使其摄入杀虫剂而死亡。
触杀剂则是通过蟑螂直接接触含有杀虫剂的物质，导致其体表被毒素吸收从而死亡。
除了喷雾剂中的活性成分，喷雾过程本身也能对蟑螂产生一定的杀灭效果。
星豹蛛乙酰胆碱酯酶(AChE)活性测定及药剂对其活性的抑制作用
星豹蛛乙酰胆碱酯酶(AChE)活性测定及药剂对其活性的抑制作用马敏;张宾;葛衍珍;李生才【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)006【摘要】[目的]系统研究星豹蛛(Pardosa astrigera)乙酰胆碱酯酶(AChE)的性质,确定其抗药性的发生和发展及其抗性水平,建立快速、准确的AChE活性检测方法.[方法]采用正交试验设计确定星豹蛛不同部位AChE活性测定的最优条件组合,并在此基础上进一步研究豹蛛AChE的体躯分布及其对4种常用药剂的敏感度.[结果]星豹蛛头胸部、腹部和附肢AChE活性测定的最优条件组合是:酶浓度分别为12、18、29 g/L;底物浓度分别为0.6、1.0、1.0 mmol/L;反应体系pH值均为7.0;反应温度分别为30、35、35℃;反应时间均为5min.AChE主要分布在星豹蛛的头胸部,提取液中含有Triton X-100时,AChE的比活力要比无Triton X-100时大.灭多威、辛硫磷、高效氯氰菊酯、毒死蜱对星豹蛛头胸部中AChE的抑制中浓度(IC<,50>)分别为7.76×10<'-5>、1.76×10<'-4>、4.12×10<'-4>、4.94×10<'-4>mol/L.[结论]星豹蛛体内AChE是膜结合的;4种药剂对星豹蛛头胸部中AChE的抑制具有很好的剂量效应,表明星豹蛛头胸部AChE可以作为环境中有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类农药污染的生物化学标记.【总页数】3页(P3362-3364)【作者】马敏;张宾;葛衍珍;李生才【作者单位】山西农业大学农学院,山西太谷030801;山西农业大学文理学院,山西太谷030801;山西农业大学农学院,山西太谷030801;山西农业大学农学院,山西太谷030801【正文语种】中文【中图分类】Q965.9【相关文献】1.星豹蛛乙酰胆碱酯酶活性测定条件的优化 [J], 马敏;张宾;李生才2.鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性测定及对有机磷农药的敏感性研究 [J], 刘晓宇;郝强;吴谋成;杨健;徐盈3.BDE-47和BDE-209对乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的抑制特性及分子作用力研究[J], 巫川;王树涛;朱婧;尤宏4.砷对大鼠大脑乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的影响 [J], 王成艳;毕伟东5.星豹蛛乙酰胆碱酯酶（AChE）活性测定及药剂对其活性的抑制作用 [J], 马敏;张宾;蔼衍珍;李生才因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
植物化学保护学第三章杀虫杀螨剂
4、杀扑磷（methidathion）
毒性：大白鼠急性口服 LD50 为 26 － 43.8mg/kg 。
制剂：40%乳油。 生物活性：具有触杀、胃
毒和渗透作用。用于防治 果树等作物的介壳虫。
（三）杀虫剂在昆虫体内的分布
杀虫剂
（保留） （转运）
表皮 血淋巴
脂肪体（保留代谢） 其他器官（保留排泄）
（中毒代谢） 神经系统
消化道（保留代谢）
二、杀虫剂对昆虫的作用机制
p （一）杀虫剂的作用靶标 p （二）杀虫剂对乙酰胆碱酯酶的抑制作用 p （三）杀虫剂对乙酰胆碱受体的作用 p （四）杀虫剂对轴状突部位的作用 p （五）杀虫剂对昆虫呼吸作用的影响
毒扁豆碱
氨基甲酸酯类杀虫剂的结构通式
二、氨基甲酸酯类杀虫剂的特点
Ø 1、分子结构与毒力关系密切。 Ø 2、速效性好，持效期短，选择性强。 Ø 3、毒性差异大。 Ø 4、增效性能多样。 Ø 5、在环境中易分解，残留量低。
三、氨基甲酸酯类杀虫剂主要品种
1、异丙威（isoprocarb）
结构式： 毒性：大白鼠急性口服LD50
生物活性：具有触杀、内吸和
胃毒作用。用于防治多种刺吸 CH3O O
O
式口器害虫和害螨。进入昆虫 CH3O P S CH2 C NHCH3
体内迅速被氧化为毒性更强的
氧化乐果
氧化乐果。
2、马拉硫磷（malathion）
毒 性 ： 大 白 鼠 急 性 口 服 LD50 为 1634.5－1751.5mg/kg。
2、乙酰胆碱酯酶水解乙酰胆碱的 过程
E + AX
3种农药对花翅摇蚊毒力和AChE活性影响
3种农药对花翅摇蚊毒力和AChE活性影响[目的]研究3种农药对花翅摇蚊毒力和AChE活性影响。
[方法]以花翅摇蚊为对象，测定氧化乐果、甲萘威和辛硫磷对花翅摇蚊4龄幼虫毒力和体内AChE 活性的影响。
[结果]氧化乐果、甲萘威和辛硫磷24 h 致死中浓度LC50分别为193.45、73.53和100.30 mg/L。
亚致死浓度（LC5、LC10和LC20）胁迫下，氧化乐果和甲萘威对摇蚊幼虫AChE活性抑制率分别为-9.03%～5389%和514%～3814%，主要表现为抑制作用。
辛硫磷对AChE活性抑制率为-27.27%～33.13%。
[结论]摇蚊幼虫AChE对3种农药有高敏感性，可作为监测水体农药污染的生化标志物。
标签：花翅摇蚊；农药；乙酰胆碱酯酶；毒力；活性近年来化学农药已成为水体环境的主要污染物之一。
目前，对于水体污染的监测主要通过化学分析方法，而这并不能直观地反映污染物对机体的毒性作用[1]。
生物标志物是生物体受到严重损害之前，在不同生物学水平（分子、细胞、个体等）上因受环境污染物影响而异常化的信号指标[2]，寻找和发现敏感性生物标志物已成为研究的热点[3]。
研究表明，乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是有机磷和氨基甲酸酯类农药的作用靶标，被广泛用于特异性生物标志物来监测该类有机化合物[4]。
笔者以花翅摇蚊（Chironomus kiinensis）为模式生物，在研究农业生产上常用的氧化乐果、甲萘威和辛硫磷对摇蚊4龄幼虫急性毒性基础上，进一步研究3种亚致死浓度农药对AChE活性影响效应，旨在探讨AChE对农药的敏感性，为进一步开发用于监测常用农药污染的生物化学标志物提供理论依据。
1材料与方法1.1供试昆虫花翅摇蚊（Chironomus kiinensis）初始种群来源于中国农业大学昆虫生理与分子生物学实验室，于室内用暴氯3 d的自来水（pH 7.58；溶解氧6.02 mg/L；总硬度80 mg/L），水温（25±1）℃，自然光照饲养，驯化3 d后挑选健壮、大小一致的4龄幼虫用于试验。
乙酰胆碱酯酶实验方案
大豆肽乙酰胆碱酯酶抑制活性实验乙酰胆碱酯酶（AchE）是老年痴呆疾病阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s Disease,AD）的一个酶抑制剂作用靶点。
乙酰胆碱酯酶浓度过高，催化乙酰胆碱的裂解反应，导致乙酰胆碱过度的缺失，直接造成神经信号传递失败，引起老年痴呆症。
在以往的研究中，已经被证明发酵豆腐乳中具有ACHE的抑制活性，大豆异黄酮（染料木素、山奈酚、大豆素）也具有抑制活性，但是大豆蛋白不具有乙酰胆碱酯酶抑制活性。
本次实验旨在检测大豆肽中是否具有乙酰胆碱酯酶抑制活性肽，如果具有，则可证明大豆肽具有保护大脑神经记忆的作用，同时也可以进行接下来的实验，利用层析分离大豆肽，找出具有活性的具体肽，鉴定其结构，人工合成此肽，检验活性。
1实验原理根据Ellman的方法，底物碘代硫代乙酰胆碱(ATch)在乙酰胆碱酯酶(AchE)作用下分解，生成硫代胆碱(Thiocholine)，硫代胆碱与显色剂DTNB迅速作用，生成在405nm处有光吸收的黄色物质，在酶催反应的稳态阶段其OD值即可代表起始反应速率。
O+AchE→Acetyrate+ThiocholineAcetylthiocholine+H2Thiocholine+5’5’-thiobis-2-nitrobenzoic acid→5-thio-2-nitrobenzoic acid2实验材料与仪器2.1实验材料磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配成0.1M的PBS磷酸缓冲液。
乙酰胆碱酯酶(AchE)：冻干粉溶于PBS中，配成4.3U/ml溶液。
DTNB：溶于PBS中，配成756uM的溶液。
碘代硫代乙酰胆碱(ATch)：溶于PBS中，配成0.3mM的溶液。
2.2实验仪器酶标仪、96孔板3实验步骤3.1实验样品阴性对照组、阳性对照组、产品对照组、大豆肽原液、0~1000u、1000~3000u、3000~10000和10000~30000共八组，每组做五组平行实验取平均值。
吡虫啉的功能主治什么
吡虫啉的功能主治什么什么是吡虫啉？吡虫啉是一种广谱杀虫剂，属于乙酰胆碱酯酶抑制剂，在农业领域被广泛使用。
这种化学物质可以有效地控制和杀灭多种昆虫害虫，使其无法正常进行食物摄取和移动，从而减轻农作物的虫害压力。
吡虫啉的主要功能和应用领域吡虫啉具有以下主要功能：1.杀虫作用：吡虫啉对多种农作物害虫具有高度的杀灭效果。
它能够通过与昆虫体内的乙酰胆碱酯酶结合，抑制其正常的神经传导，造成肌肉瘫痪和死亡。
作为一种广谱杀虫剂，吡虫啉可以有效地控制田间常见的昆虫害虫，如蚜虫、小菜蛾、红蜘蛛等。
2.持效性高：吡虫啉具有较长的残效期，一般可持续在农作物表面活性时间为1至2周，有些情况下甚至更长。
这使得吡虫啉可以有效抵御农作物上不断出现的昆虫侵袭，提供持久的保护。
3.系统性作用：吡虫啉具有一定的系统性作用，能够被作物吸收并在植物体内运输。
这意味着吡虫啉不仅可以直接接触杀虫，还可以通过作物内部循环达到杀虫的效果，从而更全面地保护农作物。
吡虫啉在农业领域的应用非常广泛，主要适用于以下领域：•水果和蔬菜种植：吡虫啉对水果和蔬菜上的害虫具有很好的控制效果，可以保持作物的产量和品质。
在种植过程中，定期施用吡虫啉可以有效地抑制昆虫害虫的繁殖和扩散，减少损失。
•粮食作物种植：吡虫啉也被广泛应用于粮食作物的种植，如水稻、小麦和玉米等。
这些作物常常受到蚜虫、甲虫和稻纵卷叶螟等害虫的侵袭，而吡虫啉可以起到非常好的防治效果，保障作物的产量和品质。
•园艺植物：吡虫啉也可以用于花卉、观赏植物和园林绿化中。
这些植物也容易受到各类害虫的侵袭，而吡虫啉有效地控制害虫数量，保持植物健康和美观。
注意事项和安全使用在使用吡虫啉时，有一些注意事项需要遵守，以确保使用安全和有效性：1.使用前请详细阅读产品说明书，并按照推荐的剂量和使用方法使用。
2.注意保护自己的皮肤和眼睛，使用时请戴好防护用品，如手套、帽子、口罩和护目镜。
3.使用时请注意风向和天气条件，避免药物飘散至周围环境和非目标植物上。
实验二 乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药
K 0K t 吸光度A实验二乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药目前有机磷、氨基甲酸酯类农药是我国大量使用的杀虫剂，虽然这类农药与过去使用的有机氯农药相比，降解速度较快，但在果蔬中的残留仍然较为严重。
由于该类农药能抑制人体内乙酰胆碱酯酶的生理活性，神经传导因此受阻，引起神经麻痹乃至死亡，对人类健康造成极大危害。
对于果蔬中的农药通常采用气相色谱等方法进行分析，但分析时间长，操作步骤烦琐，适用于实验室分析。
长期以来在大部分果蔬市场中，通常采用乙酰胆碱酯酶抑制法进行快速检测，即以乙酰胆碱酯酶作为检测试剂，采用农药残留检测仪，根据乙酰胆碱酯酶活性变化的程度来测定果蔬样品中的残留农药。
一、 实验目的1． 了解果蔬中残留农药的分析方法；2． 掌握酶抑制分析方法的原理及操作方法； 3． 理解农药残留性评价的意义。
二、 实验原理有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死，酶抑制法就是根据这一昆虫毒理学原理，对农药残留进行检测。
以乙酰胆碱为底物，在乙酰胆碱酯酶（ACHE ）的作用下，乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，胆碱和二硫双对硝基苯甲酸（DNTB ）产生显色反应，使反应液呈黄色（于410nm 处有最大吸收峰）。
根据酶促反应动力学原理，在没有有机磷和氨基甲酸酯类农药存在时，底物在酶的催化作用下发生水解，反应速率可以用吸光度值随时间的变化率K 0来表示。
当有机磷和氨基甲酸酯类农药加入到酶的显色体系中时，农药抑制了酶的活性，影响显色体系的反应速度，此时体系吸光度随时间的变化率为K t ，则有机磷和氨基甲酸酯类农药对酶的活性的抑制率Y 的计算公式如下：%10000⨯-=K K K Y tK 0：空白样品的吸光度随时间变化曲线的斜率值K t ：样品溶液的吸光度随时间变化曲线的斜率值其中K 0和K t 都可通过以下过程进行推导和计算。
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实验三杀虫剂对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用
一、试验原理和目的
在昆虫中枢神经系统的兴奋性突触中，乙酷胆碱是主要神经递质，它通过生物合成、释放以及与受体的结合，使得神经传导能正常进行。
当神经接受到某一刺激时，冲动传导到突触处，就由突触前膜释出含有乙胆碱的小囊胞，一次冲动可释出小囊胞100-150个，每个小囊胞含有乙酰胆碱(ACh)分300-2000个。
在突触后膜上约有乙酰胆碱分子900个就可产生局部膜电位的去极化，致神经传导正常进行。
多余的乙酰胆碱分子及完成刺激受体后而解离的乙酰胆碱分子应立即被突触间隙的乙酰胆碱酯酶(AChE)所水解，使神经又处于静止状态而有利于迎接下一个刺激。
因此，比较乙酰胆碱酯酶的活力和性质，可以作为测定神经递质的一个指标。
有机磷酸酯和氨基甲酸酯类杀虫剂在昆虫体内主要作用于神经系统，抑制胆碱酯酶的活性，导致神经传导的阻抑而引起昆虫中毒死亡。
研究其毒理机制，胆碱酯酶活力是重要指标之一。
其活力测定方法较多，发展较快，有测压和测pH法、比色法、电化学法、荧光法、放射法等。
其中比色法中由于应用的底物和显色剂不同，又有不同的测定方法。
本实验主要介绍一种常用的比色测定方法乙酰硫代胆碱一二硫双对硝基苯甲酸法(ASCh一DTNB法)。
该法是Ellmanl961年创制的方法，其原理是应用乙酰硫代胆碱(ASCh)为底物，在胆碱酯酶作用下水解为硫代胆碱及乙酸，然后以二硫双对硝基苯甲酸(DTNB)为显色剂，形成黄色产物，在412nm处有最大吸收峰。
生成物浓度和光密度在一定范围内密切相关，故用分光光度计可以进行定量测定，以此代表AChE的活性。
本实验通过测定有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂对昆虫乙酰胆碱酯酶活力的影响，以理解该两类杀虫剂的作用机理，并熟练掌握该酶活性测定方法。
二、仪器、试剂和材料
1. 仪器
721型分光光度计、冰箱、离心机、恒温水浴、匀浆器、具筛刻度试管、吸管等。
2. 供试昆虫
5或6龄的粘虫或家蝇成虫。
3. 试剂
(1) %溶液生理盐水：称取kcl 1.5g，加入蒸馏水，置于100ml的容量瓶中。
(2) ×10-3M谷胱甘肽（还原型）生理盐水溶液：称取谷胱甘肽（还原型）0.030733g，以%的%溶液生理盐水定容于50ml的容量中。
(3) 0.2M 磷酸缓冲液：取0.2M Na2HPO4溶液435ml和0.2M NaH2PO4 65ml混匀后装在500ml的容量瓶中。
即称取15.579g Na2HPO4•12H2O和1.01407g NaH2PO4•2H2O，加入蒸馏水定容至500ml。
(4) DTNB-磷酸盐-乙醇液：称取溶于95%乙醇（120ml）中，加入80ml蒸馏水，再用缓冲液定容至250ml。
(5) х10-3硫代乙酰胆碱（Asch）生理盐水溶液：取Asch0.011567g，用%溶液生理盐水定容至50ml。
(6) 配制适当浓度的辛硫磷和灭多威丙酮溶液。
(7) 考马斯亮蓝G－250法测定蛋白含量用试剂。
A 牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1 000μg／mL的原液。
B 蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。
此溶液在常温下可放置一个月。
C 乙醇
D 磷酸（85％）
（8）供试农药：灭多威原药（mL）、辛硫磷原药（mg/mL）
三、操作步骤
1. 试虫处理方法
用待测之杀虫剂丙酮溶液以饲喂法或点滴法处理试虫，待表现出明显中毒症状时，置于冰箱冷冻贮存待用。
正常组只用等量丙酮处理虫体，于处理组表现症状的同时，也移于冰箱冷冻室贮存待用。
2. 酶液制备方法
取处理和正常试虫各10头，剪取试虫头壳（带少量胸部），加入的磷酸缓冲液于冰浴中匀浆（先放入头壳，加入，匀浆，至无碎片且为浑浊溶液为止，倒入离心管中，分三次共加），定容匀浆液至4ml，在冰箱中于4000rpm离心15min，取上清液冷贮供试。
3. 酶活性测定方法
（1）标准曲线制作
取6支试管，分别加入、、、、和还原型谷胱甘肽溶液，用磷酸缓冲液补足到，加入二硫双硝基苯甲酸（DTNB）-磷酸-乙醇液,在412nm处测定OD值。
以谷胱甘肽浓度为横坐标，OD值为纵坐标做图，的标准曲线，求回归方程。
（2）酶活性测定
取处理、对照酶源各，加入的Pbs（磷酸缓冲液）；再加入；30℃温浴20min；加入DTNB-磷酸盐-乙醇液，显色并终止反应；于412nm下比色,测光密度（OD）。
4. 蛋白含量测定方法
参照实验三蛋白质含量测定（考马斯G－250法）测定酶液中蛋白含量。
四、结果处理
将测定的各酶液的OD412带入标准曲线，计算出被水解的底物含量（µmol）。
然后将测定的各酶液的OD595带入标准曲线，计算出蛋白含量（mg）。
以底物含量除以蛋白含量即为各酶液的活力，单位为µmol底物/ mg蛋白·20min。
按照下式计算各处理酶活力抑制率。
酶抑制率(%)= （对照酶活力－处理酶活力）/对照酶活力×100
计算出酶抑制率后，分析各供试药剂对乙酰胆碱酯酶的影响，结合供试药剂的作用机理理论，分析药剂作用症状、酶活力及作用机理之间的关系。
蛋白含量的测定
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
1. 0~1 000μg／mL标准曲线的制作
取6支10mL具塞试管，按表1取样。
盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用
1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
表1 标准曲线制作
管号123456
1 000μg／mL标准蛋白液（mL）0
蒸馏水（mL）0考马斯亮蓝G-250试剂（mL）555555蛋白质含量（μg）0200400600800 1 000
OD595nm
2. 0~100μg／mL标准曲线的制作。
表2 低浓度标准曲线制作
管号123456
1 000μg／mL标准蛋白液（mL）0
蒸馏水（mL）
考马斯亮蓝G-250试剂（mL）555555蛋白质含量（μg）020********* OD595nm。