不同酶源乙酰胆碱酯酶的抑制剂筛选

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刘佳莉1，2

 苑玉和1 陈乃宏1

1. 天然药物活性物质与功能国家重点实验室，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，北京，100050，中国

2. 天津中医药大学，天津，300193，中国

【摘要】 目的：建立一种可靠、快速、便捷、经济的乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase ，AChE ）抑制剂的筛选方法，为新药发现阶段AChE 抑制剂的筛选提供经济可靠的微量筛选方法，然后对植物提取物样品进行筛选。方法：分别采用电鳗AChE 、人源红细胞AChE 、大鼠海马区、纹状体匀浆液中的AChE 为酶源。以96孔板为载体，利用优化的Ellman 方法，在生理pH 值和温度的条件下，以他克林和石杉碱甲作为阳性对照，检测对不同酶源AChE 的抑制作用，确定最佳酶反应条件（最佳底物浓度、反应时间、显色剂浓度），并对植物提取物样品的AChE 抑制作用进行检测。结果：采用上述四种酶源的AChE 进行AChE 抑制剂微量筛选方法操作简便快速、可靠经济。其中应用电鳗AChE 进行筛选显示灵敏度较高，他克林和石杉碱甲对电鳗AChE 的抑制作用相当，而对人源红细胞AChE 、大鼠海马区、纹状体匀浆酶源的抑制作用，石杉碱甲明显优于他克林，所筛选植物提取物对AChE 均没有抑制作用。结论：本实验中所建立的筛选方法操作简便、快速、可靠经济，可用于纯化合物的筛选。【关键词】 乙酰胆碱酯酶；石杉碱甲；他克林；阿尔茨海默病

【中图分类号】 R965.1 【文献标识码】 A 文章编号：2095-1396（2011）03-0027-004

Comparative Study on Screening Acetylcholinesterase Inhibitors from Different Enzyme Sources

LIU Jia -li 1，2

，YUAN Yu -he 1，CHEN Nai -hong 1

1. S tate Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines ，Institute of Materia Medica ，Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College ，Beijing ，100050，China

2. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine ，Tianjin ，300193，China

【ABSTRACT 】 Objective ：To establish a reliable ，fast ，convenient and economical method of screening acetylcholinesterase inhibitors ，and use it to screen acetylcholinesterase inhibitors from extracts of plants. Methods ：Using the optimized Ellman method ，we examined the inhibition effects of tacrine and huperzine on acetylcholinesterase enzyme from electric eel ，human erythro-cyte ，rat hippocampus ，striatum homogenate in 96-well plates under physiological pH value and temperature. The concentration of AChE ，substrate and DTNB ，and reaction time were optimized. We also detected the inhibition effect of plant extracts on AChE. Results ：Practical microassays for screening AChE inhibitors were successfully established by using AChEs mentioned above.

不同酶源乙酰胆碱酯酶的抑制剂筛选方法比较

基金项目： 国家自然科学基金项目（No.U832008，30973887，81073078，81102831，90713045，81072541），科技部项目（No.2010DFB32900），

国家科技重大专项（No.2012ZX09301002-004）

作者简介：刘佳莉，女，硕士生；研究方向：神经药理学和神经生物学；Tel/Fax：+86-10-63165182，E -mail：liujialiyx@

通讯作者： 陈乃宏，男，研究员，博士生导师；研究方向：神经系统疾患创新药物开发及作用机制；Tel/Fax：+86-10-63165177，E -mail：

chennh@

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The data analysis of screening results revealed that electric eel AChE possessed a high sensitivity to inhibitors ，whereas human erythrocyte AChE shared high similarity with rat brain homogenate ，on which the inhibitory effect of huperzine was superior to tacrine. However ，the plant extracts showed no inhibitory effect on AChE. Conclusion ：The screening method established in this ex-periment is simple ，

fast ，reliable and economical ，and it can be used for pure compound screening.【KEY WORDS 】 acetylcholinesterase ；huperzine ；tacrine ；Alzheimer ’s disease 0.1 mol ·L -1的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline ，PBS ）配制成溶液，分装，-20℃保存备用。利用不同浓度酶制作A -电鳗AChE 酶浓度标准曲线，选择合适A 值的酶浓度（选择A 值0.6左右的酶浓度）进行实验。1.2.1.2 人源红细胞AChE 将酶原液用pH 7.4的0.1 mol ·L -1的PBS 稀释成不同浓度的酶液，制作A -人源红细胞AChE 酶浓度标准曲线，同样选择合适的A 值的酶浓度进行实验。

1.2.1.3 大鼠海马、纹状体匀浆 健康SD 大鼠，断头处死，迅速取出脑组织，分离取海马部位和纹状体部位，称量，用10倍裂解液裂解匀浆，3 000 r ·min -1离心10 min ，吸取上清液，分装，-20℃冻存备用。经BCA 法测定，匀浆蛋白含量分别为16.5 μg ·mL -1和18.8 μg · mL -1。根据A 值-酶浓度标准曲线，稀释组织蛋白到一定浓度进行实验。1.2.2 待测化合物的配制

他克林、石杉碱甲

［4］

粉末及待测提取物样品首先用二甲亚砜（dimethyl sulfoxide ，DMSO ）配制成50 mmol ·L -1的储备液，然后再用DMSO 和pH 7.4的0.1 mol ·L -1的PBS 稀释至终浓度1×10-5~ 1×10-9 mol ·L -1，DMSO 浓度为1%。另用1% DMSO 为溶剂对照。

1.2.3 他克林和石杉碱甲及待测提取物样品对4种不同来源AChE 酶源的抑制作用

首先在96孔板中依次加入10 μL 不同浓度的他克林和石杉碱甲溶液，再依次加入60 μL PBS ，10 μL 酶液，震荡混匀，37℃孵育10 min 。然后再加入20 μL 10 mmol 的底物，37℃反应10 min 。加入30 μL 1%的十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate ，SDS ）终止反应，再加入20 μL 5 mmol 的DTNB ，酶标仪测定415 nm 吸光度值（A ）。

由于化合物终浓度中含有1%的DMSO ，因此选择1%的DMSO 作为溶剂对照排除溶剂影响。根据（A 溶剂- A 化合物）

/A 溶剂得到化合物AChE 活性抑制率。1.3 统计学方法

实验结果数据以均数±标准差（x ±s ）表示，采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 电鳗AChE 酶液的浓度确定

选择终浓度在0.01~0.06 U ·mL -1之间几个浓度制随着世界人口不断趋于老龄化，阿尔茨海默病（Al-zheimer ’s disease ，AD ）、帕金森病（Parkinson ’s Disease ，PD ）等神经退行性疾病的发病率亦逐年升高，研究表明它们与胆碱能神经系统减退有关［1］

。目前临床应用的老年痴呆治疗药物，除谷氨酸受体拮抗剂美金刚（memantine ）外，几乎都是基于胆碱能神经损伤假说的乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase ，AChE ）抑制剂，如他克林（tacrine ）、加兰他敏（galanthamine ）、多奈哌齐（donepezil ）、利伐司替明（rivastigmine ）等［2］，但都存在不同程度的副作用。因此，发现和寻找新型的、低毒的AChE 抑制剂对于AD 的有效治疗具有重要意义。AChE 抑制剂的筛选方法多基于Ellman 的方法建立［3］，实验室中常用商品化的试剂盒或购买AChE 标准品进行抑制剂的筛选，但都存在不同的问题：实验操作繁琐，容易造成实验误差；不能进行高通量筛选，成本高等缺点。因此本实验利用临床中广为应用的AChE 抑制剂作为对照，建立一种操作简便，可靠经济的AChE 抑制剂的微量筛选方法。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 动物

清洁级SD 大鼠，由维通利华动物实验中心提供。所筛选植物提取物样品由中国医学科学院药物研究所提供。1.1.2 试剂

电鳗（electric eel ）AChE ，批号：41M7009V ；人源红细胞（human erythrocyte ）AChE ；他克林（tacrine ）；碘化硫代乙酰胆碱（Acetylthiocholine iodide ），批号：BCBF1359V ；5，5-二硫双硝基苯甲酸（5，5'-dithiobis nitrobenzoic acid ，DTNB ），批号67496HMV ；均购自Sigma 公司。石杉碱甲（huperzine A ），中国药品生物制品检定所；Bicinchonin-ic acid （BCA ）蛋白测定试剂盒，北京普利莱基因技术有限公司。1.1.3 仪器

Multiskan FC 全自动酶标仪，美国THERMO 。1.2 方法

1.2.1 酶反应液制备

1.2.1.1 电鳗AChE 将电鳗AChE 冻干粉用pH 7.4的