家畜类腔前卵泡体外分离方法及其影响因素研究进展

四川动物２００９年第２８卷第６期ＳｉｃｈｕａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｏｏｌｏｇｙＶ０１．２８Ｎｏ．６２００９家畜类腔前卵泡体外分离方法及其影响因素研究进展张耀君，王昭晖，文瑞丽，师红，吴民耀’（药用资源与天然药物化学教育部重点实验室。

西北濒危药材资源开发国家工程实验室，陕西师范大学生命科学学院，西安７１００６２）摘要：回顾腔前卵泡体外分离方法的研究历史，着重论述牛、羊、猪等家畜的腔前卵泡体外分离方法及其影响因素，以期为建立一种更为有效的分离方法提供理论基础。

・关键词：家畜；腔前卵泡；体外分离；影响因素中图分类号：￥８１４．８文献标识码：Ａ文章编号：１０００—７０８３（２００９）０６—０９４９—０３ＡｄｖａｎｃｅｓｏｆｔｈｅＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇＦａｃｔｏｒｓｏｆｔｈｅＤｏｍｅｓｔｉｃＰｒｅａｎｔｒａｌＦｏｌｌｉｃｌｅｓ／ｎｖｉｔｒｏＺＨＡＮＧＹａｏ－ｊｕｎ，ＷＡＮＧＺｈａｏ－ｈｕｉ，ＷＥＮＲｕｉ－ｌｉ，ＳＨＩＨｏｎｇ，ＷＵＭｉｎｇ・ｙａｏ＋（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆｔｈｅＭｉｎｉｓｔｒ）ｒｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎｆｏｒＭｅｄｉｃｉｎａｌＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＮａｔｕｒａｌＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＮａｔｉｏｎａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＲｅｓｏｕｒｃｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＥｎｄａｎｇｅｒｅｄＣｒｕｄｅＤｒｕｇｓｉｎＮｏｒｔｈｗｅｓｔｏｆＣｈｉｎａ，Ｃｏｌｌｅｇｅｏｆ“ｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＳｈａａｎｘｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ７１００６２，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｔｈｅｍａｍｍａｌｉａｎｏｖａｒｙ，ａｂｏｕｔ９９％ｏｆｔｈｅｆｏｌｌｉｃｌｅｓｐｒｅｓｅｎｔｉｎｔｈｅｃｏｒｔｅｘａｒｅｉｎｔｈｅｆｏｒｍｏｆａｎｏｎ—ｃａｖｉｔｙ．Ｉｔｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｎｇｐｒｅａｎｔｒａｌｆｏｌｌｉｃｌｅｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｆｏｌｌｉｃｌｅｓｉｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｒｏｄｅｎｔｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｉｓｒｅ—ｍａｉｎｓａｃｈａｌｌｅｎｇｅｉｎｌｉｖｅｓｔｏｃｋｗｈｉｃｈｈａｓｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｌｉｖｅｓｔｏｃｋａｎｉｍａｌｓｐｒｅａｎｔｒａｌｆｏｌｌｉ—ｄｅｓｃａｎｂｅｌａｒｇｅｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｒｅｅｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ：ｅｎｚｙｍａｔｉｃｄｉｇｅｓｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｃｏｍｂｉｎｅｄｅｎｚｙｍｅ—ｍｅ－ｃｈａｎｉｃａｌｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｏｏｌｓｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓｕｓｅ，ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｓｅｐａｒａｔｉｏｎｉｓｇｅｎｅｒａｌｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅｆｏｌ・ｌｏｗｉｎｇｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ：ｃｕｔｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄ，ｃｏｍｂ—ｓｃｒａｐｅｍｅｔｈｏｄ，ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄｇｒｉｎｄｉｎｇ．Ｔｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｒｅｖｉｅｗｓｔｈｅｍｅｔｈｏｄ—ｏｌｏｇｉｃａｌｈｉｓｔｏｒｙｏｆｉｓｏｌａｔｉｎｇｐｒｅａｎｔｒａｌｆｏｌｌｉｃｌｅｓ／ｎｖｉｔｒｏ，ｆｏｃｕｓｅｓｏｎｔｈｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｐｒｅａｎｔｒａｌｆｏｌｌｉｃｌｅｓｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎ－ｆｌｕｅｎｃｉｎｇｆａｃｔｏｒｓ，ｓｕｃｈ８．８ａｎｉｍａｌｓｐｅｃｉｅｓ，ａｇｅ，ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｔｉｍｅ，ａｎｄｏｖａｒｉａｎｓｉｚｅａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｔｈｕｓｌａｙｉｎｇａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇａｍｏｒｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄｏｍｅｓｔｉｃａｎｉｍａｌｓ；ｐｒｅａｎｔｒａｌｆｏｌｌｉｃｌｅｓ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏ；ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｆａｃｔｏｒｓ哺乳动物卵巢皮质中含有大量的腔前卵泡，但是绝大部分在发育过程中会不断闭锁退化。

开发和利用这一潜在的种质资源具有重要的实用价值，因此对腔前卵泡进行体外培养显得尤为重要。

有效地将腔前卵泡分离出来是进行体外一培养的第一步。

目前，已建立啮齿类动物的一套完善的分离体系，但在家畜上由于其卵巢组织的结构密致，纤维化程度比较高，使得家畜类腔前卵泡的分离仍存在很多问题，因而也一直制约着研究工作的进展。

为此许多学者对家畜类腔前卵泡的分离进行了长期不懈的探索。

本文就牛、羊、猪等家畜的腔前卵泡体外分离方法及其影响因素做一综述，以期为建立一种更为有效的分离方法提供理论基础。

ｌ家畜类腔前卵泡体外分离方法研究概况家畜类腔前卵泡体外分离方法的研究始于２０世纪７０年代。

Ｎｉｏｃｓｉａ等（１９７５）用蛋白水解酶法分离兔卵泡并且比较系统地建立了一套家兔各级卵泡的分离技术。

随着动物卵母细胞体外培养技术的发展，对腔前卵泡的分离引起了人们更多的关注。

Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ等（１９８９）用酶法分离猪卵巢卵泡，获得了大量的原始卵泡。

酶的广泛应用，大大增加了卵泡的分离数目，但人们发现酶对卵泡的发育有一定的副作用，因而后来的研究比较倾向于机械分离法或两者结合的方法分离腔前卵泡。

牛、羊、猪等家畜的腔前卵泡分离相对较晚，取得较大进展的是１９９３年Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ等建立了一套酶结合机械法成功地回收了大量牛的各级卵泡。

随后，Ｈｉｒａｏ等（１９９４）先用酶法处理，再用机械法剥离猪卵巢卵泡，经体外培养获得成熟卵子，受精后实现精子穿入。

Ｇｐｕａｔ等（２００２）用机械方式分离水牛的小腔前卵泡与牛卵巢间质细胞或胎牛成纤维细胞共同培养可以存活３０ｄ。

国内学者潘红平等（２００３ａ）采用酶消化结合机械分离法分离水牛的腔前卵泡并进行体外培养，说明了用胶原酶分离水牛的腔前卵泡的适宜浓度为０．０４％，表明在设计好酶浓度的情况下可大大减少对卵泡的伤害。

饶丽娟等（２００５）所建立的钢丝电线刮擦和分收稿日期：２００９－０１—１４修回日期：２００９－０２－２０基金项目：陕西师范大学２１１工程重点项目（８８４０６７）作者简介：张耀君（１９８３一），女，硕一ｌ：研究生，Ｅ—ｍａｉｌ：ｙａｏｊｕｎｚｈａｎ９２００７＠１２６．ｃｏｒｎ‘通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｍｉｎｙａｏｗｕ＠ｓｎｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ９４９万方数据四川动物２００９年第２８卷第６期ＳｉｃｈｕａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｏｏｌｏｇｙＶ０１．２８Ｎｏ．６２００９级过筛技术成功地分离出不同大小的绵羊腔前卵泡，在很大程度上提高丁腔前卵泡的回收效率，并且卵泡的质量也较好。

Ｓｈｉ等（２００７）运用机械一酶消化法，通过密度梯度离心收集不同梯度细胞层的方法大大增加了猪原始卵泡的回收数量（１．８５×１０５—７．７９×１０５个），回收率达８２．４３％±９．４１％（ｎ＝５）。

目前，家畜类腔前卵泡的回收取得了一定进展，但是要达到完好质量和足够数量的双重标准分离技术仍需进一步深入研究。

２家畜类腔前卵泡的体外分离方法目前牛、羊、猪等家畜类动物腔前卵泡的分离方法大体上可分为三大类：酶消化法；机械分离法；酶一机械分离结合法。

２．１酶消化法将卵巢切成两半去掉髓质部将皮质在ＰＢＳ中洗净，在组织切碎机或工作台上切成２～３ｍｌｆｆｌ的碎片与含有０．１％胶原酶培养液在３９℃下消化Ｉｈ后，悬液用吸管吹打后检卵（Ｈｉｒａｏｅｔａ１．，１９９４）。

酶消化法的使用较早，后来的研究比较倾向于机械分离法或两者结合的方法分离腔前卵泡。

２．２机械分离法机械分离法因研究者使用工具的不同又大体归纳为以下几类：剪碎法、梳刮法、显微分离法、研磨法。

２．２．１剪碎法用眼科手术剪刀将皮质置于放有５ｍＬ卵泡分离液的培养皿中剪成碎块（中＜ｌｎｍｌ），然后用直径约ｌｉｌｌｎｌ的巴氏管反复吹打、在旋涡振荡器上振荡１—２ｍｉｎ，再用６０目金属网筛过滤，收集滤液，分类检卵、计数（靳双星等，２００６）。

Ｌｕｃｃｉ等（２００２）用这种简单的机械分离方法有效地分离了大量完整的腔前卵泡。

２．２．２梳刮法将卵巢去掉周围的结缔组织、脂肪组织、黄体及髓质，但保留韧带，置于放有５ｍＬ卵洗液（Ｍ１９９＋５ｍｍｏｌ／ＬＨＥＰＥＳ＋５ｍｍｏｌ／ＬＮａＨＣ０３＋３％新生牛血清）的培养皿中，然后用镊子圊定韧带的一头，用自制工具——梳刮沿纵轴细刮皮质部，待到溶成溶丝状后，再用移液管（管口直径约１ｍｍ）反复吹打，最后用直径２５０ｐ，ｍ的筛网过滤，收集滤液后，进行检卵（潘红平等，２００４）。

２．２．３显微分离法又叫显微解剖法，用眼科剪将卵巢皮质部分剪成１ｒｏＪｎＸ３ｍｍ的块状，转入加有Ｍ１９９培养液的培养皿中，在３０～４０倍体视显微镜下用带有针头的１ｍＬ注射器将腔前卵泡小心地挑出（权青等，２００７）。

Ｓａｈａ等（２００２）研究表明显微分离法是分离牛大腔前卵泡的最适宜方法。

许多研究表明，该法主要用于分离大腔前卵泡（中＞１００ｔＬｍ），虽速度慢，不能满足大量分离的要求，但能保证卵泡的质量。

２．２．４研磨法将卵巢皮质部分用研磨机反复研磨挤压后，将其收集在含有０．３％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，然后通过５００ｐｚｎ、３００ｐ，ｍ、３８ｐ．ｍ的筛网过滤后，收集在含有１０％胎牛血清的Ｍ１９９培养液中，最后在镜下检卵（Ｓａｈａｅｔａ１．，２００２）。

Ｉｔｏｈ等（２０００）用此法分离出了大量的牛小腔前卵泡。

２．３酶－机械分离结合法’９５０即机械处理与酶消化相结合而建立的一套腔前卵泡分离方法。

将卵巢分别用７５％酒精、卵洗液先后浸洗２—３次，再除去周围的结缔组织、脂肪组织、韧带、黄体及髓质，将卵巢皮质部放入培养皿中，用眼科手术剪刀将其剪碎（巾＜１ｌｎｉｎ），加入胶原酶浓度为０．０４％的卵洗液，用略大干组织块的移液管（管口直径约ｌｍｍ）吹打数次，放入培养箱２０ｍｉｎ，再用移液管反复吹打，然后用２５０Ｉｘｍ的筛网过滤，离心２次，去掉胶原酶，进行榆卵、计数（潘红平等，２００３ａ）。

潘红平等（２００６）先用不同浓度的胶原酶消化水牛卵巢２０ｍｉｎ，然后用剪碎法分离腔前卵泡，结果表明酶一机械分离结合法大大提高了腔前卵泡分离效率。

Ｇｕｐｔａ等（２００７）用此方法在胰蛋白酶浓度为１％、３７％条件下作用１０ｒａｉｎ，分离得到了大量的牛腔前卵泡。

３影响家畜类腔前卵泡体外分离方法的因素３．１动物的品种和年龄动物种类不同其卵巢的结构有差异，因而分离得到的腔前卵泡数量就会有差异。

潘红平等（２００３ｂ）采用梳刮的机械法分离水牛胎牛、青年牛和成年牛腔前卵泡，并分别进行培养，结果表明青年牛卵巢分离得到的腔前卵泡数量较多，且培养成活率高，是进行水牛腔前卵泡分离培养等研究的理想试验材料，与Ｆｒｉｇｕｅｉｒｅｄｏ等（１９９３）的研究结果相似。