分子标记技术

食安0801 02 邓凯

近年来，现代生物技术，特别是分子标记技术发及其产品的检验检疫工作中，分子标记技术也得到展迅速，已被广泛应用于生物进化、系统分类、物种了越来越广泛的应用。本文综述了分子标记技术在多样性、遗传育种、品种鉴定、基因组作图或基因定植物检疫实践中的应用和发展前景。位、基因定位克隆（map-based cloning）等领域的研1分子标记技术发展概况究。广义的分子标记（molecular markers）是指可遗传遗传标记（genetic

markers）的发展经历了4个阶的并可检测的DNA序列或蛋白质标记；狭义的分子段：①形态标记（morphological markers），主要指植标记概念只是指DNA标记。蛋白质标记包括种子储物学形态特征；②细胞标记（cytological markers），主藏蛋白、同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的要是染色体核型和带型等；③生化标记（biochemical 不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同markers），主要是同工酶和储藏蛋白等生化物质；等位基因编码的酶的不同分子形式）。在出入境植物④分子标记（molecular markers），即核苷酸。

分子标记是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。理想的分子基于“3S”技术的数字化烟草农业标记所具有的优点：

①多态性高；

②遍布整个基因

③检测手段简单、迅速；

④无基因多效性；

⑤能够明确辨别等位基因；

⑥实验重复性好；

⑦直接以试论林木病虫害防治信息的数DNA的形式表现，不受植物的生长条件和发育阶段的影响，在植物的任何生长阶段都可检测。

第一代分子标记（以Southern杂交技术为核心）对数字农业的认识及其基本构想现代农为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，缩写

20世纪80年代中期发展起来的一种最早的分子标记。目前有2种方法可进行DNA的RFLP 分析：一是根据其原理用RFLP的探针进行特殊基因的DNA克隆、cDNA克隆、随机的基因组DNA克隆和合成的低聚核苷酸克隆；二是对那些分子量较小的DNA样本（如线粒体DNA、核糖体DNA等），可在酶切后对其产物直接电泳，将不同大小的限制性酶切DNA 片段分离，从而得到该DNA的RFLP图谱。RFLP标记呈孟德尔式遗传，大多数RFLP 的等位基因为共显性，在任何分离群体中能区分纯合基因型与杂合基因型。但该技术在

操作过程中涉及了DNA的提取、酶切、电泳分离、探针的制备和Southern杂交等一系列分子生物学技术，步骤繁杂，工作量大，且分析中需要的DNA量大，因此在很大程度上限制了RFLP技术的应用。

第2代分子标记（以PCR技术为核心）包括RAPD（Random amplified polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA）、AFLP（amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性）、SSR（Simple sequence repeat，简单重复序列）、SRAP（Sequence-Related Amplified Polymorphism，相关序列扩增多态性）、TRAP（Target Region Amplification Polymorphism，目标区域扩增多态性）等分子标记。利用PCR技术的忠实性、效率和特异性可以极大地简化样品的收集与处理工作，同时也降低了对样品数量和质量的要求，通常用几十纳克（ng）以内的DNA样品就可满足分析的需要。这对于分子标记辅助育种、QTL定

位等研究带来了很大的便利。此外，PCR技术还可以锁定特定的目标DNA区域进行扩增，有利于后续工作的开展（序列测定、功能研究等）。

第3代分子标记以SNP（Single-Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）为主。同一位点的不同等位基因之间常只有1个或几个核苷酸的差异。因此，从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测具有重要意义。随着计算机和DNA芯片技术引入分子生物学领域，研究者可同时对成千上万个克隆测序，用计算机分析数据和显示最终结果。SNP作为一种新的遗传标记，几乎完全建立在DNA芯片技术的基础上。SNP是同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化，主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠倒以及单碱基的插入或缺失等。分子标记作为新的遗传标记，具有比形态标记、细胞标记和同工酶标记显著的优点。但是，目前发现的任何1种分子标记均不能满足作为理想的遗传标记的所有要求。上述列举的几种分子标记各有优、缺点，应用中应根据研究的需要及实验条件选择相应的标记技术。2在植物及其产品检验检疫中的应用分子标记不但高效、简便、稳定、精确，而且省时，不受生物生长期的限制，所需样品少，对检疫对象的虫态和生理状态没有特定的要求，特别适用于要求快速检出结果的进出境植物检验检疫。因此，分子标记在检验检疫实践中被广泛应用。

2.1分子标记技术在植物病害检疫中的应用采用AFLP、RFLP、RT-PCR、PCR等分子生物学技术，分别以功能基因、核糖体ITS等区域为靶标，对大豆疫霉病菌、小麦矮腥黑穗病菌、水稻细菌性条斑病菌、瓜类果斑病菌和亚洲梨火疫病菌等10多种植物检疫性疫病进行特异性分子靶标的研究，并开发出相应PCR检测方法。

小麦印度腥黑穗病（Tilletia indica）是一种世界性的检疫性有害生物，其冬孢子的形态特征与黑麦草腥黑粉菌（Tilletia walkeri）、水稻腥黑粉菌（Tilletia horrida）及狼尾草腥黑粉菌（Tilletia. bariclayana）的冬孢子十分相似。程颖慧[1]等根据线粒体DNA的序列、ITS区DNA片段设计特异性引物，能有效地鉴别小麦印度腥黑穗病与黑麦草腥黑粉菌以及其他相似种或相关种，检测的灵敏度为1个冬孢子，整个检测过程缩短至1d。大豆疫霉菌的生理小种分化复杂。王化波等（2003）采用RAPD技术，利用13个引物对中国大豆疫霉菌的75个分离物和11个美国分离物进行了PCR扩增。RAPD指纹聚类分析结果表明，在中国的大豆疫霉菌群体内，多数分离物之间遗传相似性较低，在DNA水平上存在显著的遗传变异，具有较丰富的遗传多样性。Whisson等[2]利用RFLPs技术分析了澳大利亚和美国大豆疫霉菌的遗传关系，证明美国分离物较澳大利亚分离物具有更复杂的遗传结构，并推断澳大利亚的大豆疫霉菌可能是从美国传入的。亚洲梨枯死病，又叫梨枝条黑枯病、亚洲梨火疫病，是一种严重为害亚洲梨的毁灭性细菌病害，其病原为Erwinia pyrifoliae。Rhim等[3]利用16S～23 SrDNA的ITS序列对Erwinia pyrifoliae和E. amylovora进行研究，发现通过ITS引物可以区分这两个菌种。McGhee等（2002）也证实E. amylovora和 E. pyrifoliae密切相关，但属于两个不同的种。在植物病毒检疫中目前应用较多的分子标记技术是RT-PCR技术。RT-PCR技术被应用于李坏死环斑病毒、菜豆花叶病毒、番茄不孕病毒（TAv）、烟草环斑病毒（TRsv）、番茄环斑病毒（ToRsv）的检测。结果表明该方法灵敏度和准确度都很高，利用分子检测技术可以快速、准确的鉴定植物病毒病害。

2.2在植物害虫检疫中的应用梁广勤等（1994）利用染色体和同工酶技术鉴定寡鬃实蝇幼虫，节省了从幼虫饲养到成虫的时间与鉴定成本，有利于加快产品的通关速度。朱振华等（2005）利用mtDNACytb基因对果实蝇属的橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）、瓜实蝇（Bactrocera

cucurbitae）、南瓜实蝇（Bactrocera tau）、番石榴实蝇（Bactrocera correcta）、具条实（Bactrocera scutellata）、黑漆实蝇（Bactrocera scutellaris）等6种实蝇进行分析，结果表明mtDNACyt 基因可以作为这6种实蝇种类鉴别的分子标记。张亮等[4]采用RAPD技术有效区分了果实蝇属（Bactrocera）的南瓜实蝇、黑漆实蝇、具条实蝇、瓜实蝇、橘小实蝇和番石榴实蝇等6种实蝇。Kethidi等（2003）通过分析RAPD扩增产物中的序列特异性扩增片段，设计特异性引物对从亚洲长角天牛所有发育阶段的翅、足、触角和卵、幼虫、蛹、成

虫组织的DNA进行扩增。结果表明，RAPD标记可被用于亚洲长角天牛的鉴定。安榆林等（1998）应用RAPD技术分析松墨天牛、云杉大墨天牛和云杉小墨天牛的DNA多态性，证实该技术可以用于区分天牛近缘种，尤其为天牛幼虫的鉴定提供了1种新方法。Burrows[5]以RFLP技术和DNA探针进行线虫种的鉴定，清楚地区别了马铃薯金线虫（Globoderarostochiensis）与马铃薯白线虫（Globodera pallida）。Harris等应用PCR技术对单个根结线虫幼虫的mtDNA进行了鉴定。Power等用PCR技术成功区分了4种常见根结线虫和奇特伍德根结线虫。喻盛甫等（1998）利用RAPD技术对根结线虫进行过种类鉴定。Webster等（1990）用mtDNA克隆得到pCes70基因，作为松材线虫和拟松材线虫的检测的探针。rDNA的ITS区序列分析被应用于松材线虫与拟松材线虫的区别，这些分子标记技术克服了形态学上难以鉴别的困难，且快速准确。

2.3在有害杂草检验检疫中的应用

DNA分子标记如核糖体DNA的ITS区的序列分析及叶绿体rbcL的基因序列分析等已被广泛应用于野生植物的分类与鉴定。但在杂草检疫对象鉴定中的应用报道还不多见。当今生物技术的发展日新月异，新的技术层出不穷，分子标记技术以其准确、稳定、高效等优点已被广泛应用于医学、农林、水产、生物工程等领域。分子生物工作者应该跟踪国内、外最新发展动态，将新技术应用于植物检验检疫工作中。但目前分子检测技术在检验检疫工作中还未得到充分应用。目前某些植物检疫对象可以通过分子标记技术提高鉴定的准确性和工作效率，比如有害杂草和昆虫，检疫现场检出的往往是草籽和幼虫，传统的方法需要将草籽

发芽、幼虫饲养成成虫，才能加以鉴别，花费时间长。而分子标记技术需要的时间短，准确性高。因此，将分子标记技术应用在检验检疫工作中可以提高检验检疫的工作质量与工作效率。

参考文献：

［1］程颖慧，章桂明，王颖，等小麦印度腥黑穗病菌PCR检测［J］.植物检疫，20011（6）：321～325.

［2］WHISSON S C，MACLEAN D J，MANNERS J M，et al. Geneticrelationships among Australian and North Americanisolates of Phytophthora megasperma f.sp.glycine assessed by multicopy DNA probes［J］. Phytopathology，1992，82：863～868.

［3］RHIMm S L. Erwinia pyrifoliae，an Erwinia species differentfrom Erwinia amylovora，causes an ecroticease disof Asianpeartrees［J］. Plant Pathology，1999，48：514～520.

［4］张亮，张智英.云南六种实蝇的RAPD快速鉴定［J］.应用生态学报，2007，18（5）：1 163～1 166.

［5］BURROWS P R. The differentiation of Globodera rostochiensis from G. pallida using specific DNA probes［J］. Nematologica，1988，8（34）：