免疫佐剂
04第四章 灭活剂、保护剂和免疫佐剂(兽医生物制品学)
温度越高，灭活越快，灭活作用随温度上升而加速。在低温时，温 度每上升10C，细菌死亡率可成倍增加。每升高10C，金属盐类的灭菌 作用增加2-5倍，石炭酸的杀菌作用增加5-8倍。但是，如果温度超过 40C 或更高，对微生物的抗原性将有不利影响。
(五)pH
在微酸性时灭活速度慢，抗原性保持较好，在碱性时灭活速度快，但 抗原性易受破坏。灭活初期损失较快，以后逐渐减慢，尤其甲醛溶液浓度 高时，在碱性溶液中抗原性损失更大。
附：
用乙烯亚胺衍生物对病毒进行灭活，当灭活结束时，应中止灭活并 除去其残存物，以免继续作用而损害疫苗的免疫原性。采用的方法是： 在乙烯亚胺衍生物灭活的病毒液中加入过量的硫代硫酸钠或亚硫酸钠， 不论是0.05%AEI或0.02%BEI，病毒液中硫代硫酸钠最终浓度均为2%， 以中断灭活剂灭活作用。
此外，-丙内脂（-propiolactone）也是一种良好的病毒灭活剂， 它是一种不稳定的液体，于37C 2h后能自行水解为无毒物质。
注意：这里指的是甲醛的浓度，并非福尔马林的浓度！
(二) 苯酚
酚类是以羟基取代苯环上的氢而形成一类化合物。苯酚(phenolum)， 又称石炭酸(acidum carbolicum)，为具有特殊气味的无色结晶，易潮解， 溶于水及有机溶剂，见光则颜色变深，置于空气中易被氧化，颜色也变深， 所以应避光保存。
三、影响灭活作用的因素
(一) 灭活剂的特异性
某些灭活剂只对一部分微生物有明显的灭活作用，而对另一些微生物 则效力很差。如酚类能抑制和杀灭大部分细菌的繁殖体，5%石炭酸溶液 于数小时内能杀死细菌的芽胞。阳离子表面活性剂抗菌谱广，效力快，对 组织无刺激性，能杀死多种革兰氏阳性菌和阴性菌，但对绿脓杆菌和细菌 芽胞作用弱。
兽用免疫佐剂浅谈
山东畜牧兽医2016年第37卷兽用免疫佐剂浅谈李宁王应玉（山东省威海市文登区张家产畜牧兽医工作站 264407）王亮（山东省威海市文登区畜牧兽医局）中图分类号：S851.33 文献标识码：C 文章编号：1007-1733(2016)11-0048-02免疫佐剂具有增强免疫效应的作用，与疫苗配合使用，延长免疫时间，减少免疫次数，提高免疫效果，在畜牧生产上有重要意义。
1 油乳佐剂油乳佐剂是用矿物油、乳化剂(如span-80，Tween-80)及稳定剂(如硬脂酸铝)、水按一定比例混合制备而成。
有油包水型(W/O)和水包油型(O/W)。
油乳佐剂作为储存库，抗原被包藏其中，注射体内后起到缓释作用，免疫持久。
油乳佐剂在灭活疫苗生产中用广泛。
1.1 弗氏佐剂分为弗氏不完全佐剂(FIA)和弗氏完全佐剂(FCA)。
弗氏不完全佐剂(FIA)是将矿物油(石蜡油)和乳化剂(羊毛脂、Tween-80)混合制成油包水型(W/O)佐剂，弗氏完全佐剂(FCA)是在弗氏不完全佐剂(FIA)的基础上加入灭活的分枝杆菌或卡介苗。
1.2 其它油乳佐剂 除了FCA和FIA，基于矿物油的佐剂还有白油Span佐剂、Specol佐剂、MontanideISA50、ISA 206等。
除了矿物油，其他油脂也可以制成油乳佐剂，比较常用的有植物油(如花生油)、角鲨烯和角鲨烷等。
2 矿物质类佐剂矿物质佐剂属于传统佐剂之一，主要指铝盐和钙盐佐剂，包括氢氧化铝胶、硫酸铝钾胶、磷酸铝、磷酸钙等，矿物质类佐剂能吸附和沉淀抗原，与抗原形成复合物，形成凝胶状态，注入动物体内后形成抗原储存库，缓慢释放抗原，较长时间刺激免疫系统，主要增强机体的体液免疫应答。
铝盐佐剂已有70多年的应用历史，在人用生物制品广泛应用。
3 微生物佐剂某些微生物菌体、组分、代谢产物能够活化免疫细胞，加强免疫效应，对特异性和非特异性免疫都有明显的增强作用。
3.1 微生物菌体 分枝杆菌、乳酸菌类、短小棒状杆菌、葡萄球菌、链球菌、百日咳杆菌。
Antigenwrap水溶性新型免疫佐剂简介
如果一支一周内用完，可以先用生理盐水稀释放冷藏环境，不可冷冻；或者 先分装到有刻度的离心管 ，用前取一管直接稀释后取用。
21+ 15 天 12+ 10 天
抗体 亲和力
高
高
抗体效价 OD 值 抗体效价 OD 值 二免后 7 天 四免后 7 天
1：5K 1：5W 1：5K 1：5W
1.56 0.45 2.78
1.23
1.62 0.55 2.68
1.51
Antigenwrap 水溶性免疫佐剂使用难题解答
一 ： 难取 Antigenwrap 佐剂优点粘稠度稍高，保质期长 3-5 年，缺点不好吸取，所以
实用新型水溶性 Antigenwrap 免疫佐剂优势分析
Antigenwrap 水溶性新型佐剂是吸取进口原材及专利精华研制而成的一类 水溶性佐剂，使用时不需复杂的乳化过程，抗原和佐剂只需简单混合即可用于 免疫动物，具有抗原用量低、抗体产生快、抗体亲合力高等多方面优点。
首先，此佐剂用量 5%-20%，免疫效果却一致 ，也就是成本低 3～5 倍; 其次，佐剂保质期长，3～5 年，且最适合兔子免疫，大大减少佐剂成本 和使用方便性; 再次，佐剂累积年用 50-100ml，价格 3～5 折 ；
保存温度：4℃
保质期：3~5 年
Antigenwrap 水溶性新型佐剂使用方法：
1、用生理盐水将抗原稀释到2-20 倍（根据注射体积和质量）。 （1）免疫原性较弱的亚单位蛋白抗原每针次30~60μg； （2）免疫原性较强的灭活全病毒或全细菌以及病毒样颗粒抗原每针次 10~30μg。 2、Antigenwrap 水溶性新型佐剂与抗原按体积比 1:8－1:4 混匀，震荡 2-5 分钟 混匀即可。（用滴管吸取佐剂，一滴约 30ul） 3、通过腿部肌肉注射免疫小鼠，每只小鼠注射 100μl。 4、第 12 天按同样方式加强免疫一针。备注：每次佐剂和抗原现配现用。 5、间隔 10 天按同样方式免疫，一周后即可采微量尾血进行ELISA 测定，根据 抗体滴度是否在1:10000~1:10000000 范围内，随后进行融合或者按同样方式 继续免疫。
中药免疫佐剂研究进展
中药免疫佐剂研究进展摘要：免疫佐剂能够增强机体对抗原的免疫应答反应，对提升疫苗的作用效果具有重要意义。
传统疫苗和新型疫苗在研究和实践中暴露的问题推动了免疫佐剂的研究 ,中草药及其提取物具有免疫佐剂的活性,并且以其毒副作用小、价格相对低廉有望成为未来临床应用的较佳选择，应用前景广阔。
本文综述了中药提取物、单味中药、复方中药作为免疫佐剂的研究进展, 以期增加对中药免疫佐剂及其作用机制的认识，以期加强对中药免疫佐剂作用机制的研究，提高疫苗的安全性和有效性。
关键词：中药；佐剂；免疫机理某些物质若先于抗原或与抗原一起注入人体，能非特异地增强抗原的免疫原性和机体对该抗原的特异性免疫应答，或改变免疫应答类型，此类物质称为佐剂[1]。
佐剂被用来增强疫苗的免疫反应已有近百年的历史，它具有延长抗原的作用时间、增加抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬、刺激吞噬细胞对抗原的处理、增强辅助T细胞的作用、刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体、提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴变等作用，特别对老年及儿童等免疫力低下人群意义重大。
中药是我国的宝贵资源，与合成药物相比，具有多效、双向调节性、不良反应少、毒副作用小和无依赖性的特点[2]。
随着中药免疫药理学研究，发现了许多免疫活性成分,包括多糖类、皂甙类、黄酮类、有机酸类、多酚类和萜类等,这些免疫活性成分具有免疫调节、抗菌抗炎、抗感染、降血糖等多种生物作用。
1佐剂种类、作用机制佐剂自应用以来，在来源、组成与类别上不断增加，对多种传染病的预防接种起到了至关重要的作用。
目前应用较为广泛的佐剂有铝盐佐剂、油乳佐剂、弗氏佐剂、细胞因子类佐剂、表面活性佐剂等，但这些佐剂具有安全、廉价、免疫性强等优点的同时又存在着一定的局限性，如细胞因子是目前研究最热门最有应用前景的核酸疫苗佐剂，具有多效性、多源性、高效性、快速反应性等特点，但目前应用于临床的细胞因子类佐剂较少，表面活性类佐剂无毒性、无免疫原性，可在体内降解，不引起组织损伤，但稳定性较差，作为表面活性类佐剂中的一种，脂质体在制备过程中要求有一定的技术性，并且费用比其它免疫佐剂高。
项目四 灭活剂、保护剂与免疫佐剂
三、影响灭活作用的因素
⒈灭活剂特异性：石炭酸对真菌和病毒效果差，甲醛 最常用。 ⒉微生物的种类和特性：一般含氮量越高，甲醛等灭 活剂的消耗量就越大，灭活脱毒速度越慢。 ⒊灭活剂浓度（一定要合适） ⒋灭活温度（具体不同病原体和或毒素，其灭活时间 和温度不一致）。 ⒌灭活时间：随灭活剂浓度及温度升高，灭活时间则 缩短。 ⒍PH：微酸时灭活速度慢，抗原性保持较好。 ⒎有机物的存在：被灭活的病毒或细菌液中，如果含 有血清或其它有机物质，会影响灭活剂的灭活能力。
当以水为分散相，以加有乳化剂的油为连续相时，制
成的乳剂为油包水型乳剂（水／油或W／O），是生物 制品采用的主要剂型。
白油佐剂
一种好的乳剂苗，应该是W／O或O／W型，粘度较低， 颗粒大小均匀，稳定性良好，呈乳白色。
（四） 蜂胶佐剂 （五）ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ生物佐剂
三、新型免疫佐剂
1、细胞因子类 2、免疫刺激复合物
二、常用灭活剂的应用
⒈甲醛溶液：最常用 2.苯酚（石炭酸）：用于防腐，很少用于疫苗研制。 3.结晶紫：蛋白质变性。（溶于有机溶剂）用于诊断抗原 的制备：鸡白痢抗原 4.β-丙内酯 狂犬病灭活苗制备所用 5 烷化剂 乙酰基乙烯亚胺 二乙烯亚胺 缩水甘油醛 6 硫柳汞 用于生物制品的防腐和消毒。 7 缩水甘油醛 注意：灭活剂对人有害，有时对皮肤黏膜有强烈刺激性。
④干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖。
二、冻干保护剂的组成
⒈低分子物质（营养液）：
营养液：脱脂乳、蛋白胨、氨基酸、和糖类 等 ⒉赋形剂(高分子物质）骨架
赋形剂：蔗糖、山梨醇、乳糖、PVP、葡聚 糖等 ⒊抗氧化剂 抗氧化剂：Vit.C、Vit.E和硫代硫酸钠等
新型佐剂的主要种类
新型佐剂的主要种类
新型佐剂是指用于增强疫苗免疫效果的辅助物质。
目前主要的新型佐剂种类包括以下几种：
1. 脂质体佐剂：脂质体是一种由脂质构成的微小颗粒，可以帮助将疫苗有效成分包裹在内，并提高疫苗在体内的稳定性和抗原递呈性，进而增强免疫反应。
2. 病毒样颗粒佐剂：通过将无活性病毒颗粒添加到疫苗中作为佐剂，可以模拟真实病毒感染的情况，进一步激活免疫系统，提高疫苗的免疫效果。
3. 蛋白质亚单位佐剂：将疫苗中的抗原蛋白分离出来，作为佐剂单独使用，可通过激活特定的免疫反应途径来增强疫苗的免疫效果。
4. 结合佐剂：将多种佐剂组合使用，可以通过不同途径和机制增强疫苗的免疫效果，例如脂质体与病毒样颗粒的结合。
这些新型佐剂的研究和应用，旨在提高疫苗的免疫效力和稳定性，进一步加强人类对疾病的防控能力。
但需要指出的是，具体使用哪种佐剂取决于疫苗类型、目标免疫群体和疾病特征等因素，并需要经过严格的临床试验和监管审批。
灭活剂、保护剂和免疫佐剂
第二节 保护剂（稳定剂）
保护剂：又称稳定剂（stabilizer） ，是指一类能防止生 物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（指对疫 苗生产、血清制备等） 保护剂用途（不同用途加不同保护剂, 主要针对活的微生 物或细胞）
胞对抗原或表位进行加工的机制。通过这种机制，可以改变特异性免疫应答 的本质或强度。T细胞有Th1和Th2两个亚类。同一抗原和不同佐剂一起使用 能够引起不同的免疫反应。因此，通过筛选特定的佐剂，可以达到诱导正确
的免疫应答的目的。
佐剂的分类
1. 按佐剂物理性质 • 颗粒型佐剂 • 非颗粒型佐剂 2. 按佐剂的生物学性质（即Ballanti分类法） • 微生物及其组分 • 非微生物物质 3. 按佐剂在体内存留的时间 • 贮存型佐剂（depot type adjuvant） • 非贮存型（non-depot type adjuvant）
２、保护剂浓度：严格按照配方执行。 ３、保护剂配制方法：糖类不能用121℃高压灭菌处理。 ４、保护剂酸碱度（PH值）：主要对M的影响。
三、常用的冻干保护剂（稳定剂） 明确不同种类微生物需要添加不同保护剂
（一）细菌的保护剂 ① 需氧或兼氧厌氧菌：５％蔗糖脱脂乳或５％蔗糖、 1.5％明胶； ② 厌氧性细菌：含1.5％谷氨酸钠的１％乳糖或10％脱 脂乳或7.5％葡糖血清。 注：脱脂乳：20％脱脂奶粉溶于水配制而成。
不损害其蛋白衣壳，保留其保护性抗原。
1、乙酰基乙烯亚胺（N-acetyl ethylenimine，AEI） •淡黄色澄明液体，有轻微氨臭味，能与水或醇任意混合。 •0～4℃可保存1年，在-20℃可保存2年 •AEI功能基团是乙烯亚胺基，可用于口蹄疫灭活苗。 •口蹄疫病毒液: 终浓度0.05％，30℃8h, 加2％硫代硫酸钠阻断
佐剂
佐剂概念佐剂（Adjuvant）是指能够增强免疫应答或改变免疫应答类型的物质，应用时可与抗原同时或预先注射与机体。
佐剂本身可以有免疫原性，也可以没有免疫原性。
良好佐剂的条件1)增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性。
2)佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，减低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体。
3)佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能。
4)良好的佐剂应具有无毒性或副作用低的特点。
佐剂的种类佐剂一般包括以下几类：1)无机佐剂：如氢氧化铝、明矾等2)生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等3)人工合成佐剂：如双链多聚肌甘酸：胞苷酸（Poly I:C）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（PolyA:U）4)油机：如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等5)纳米佐剂佐剂的两大类一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。
目前应用最多的是弗氏佐剂（Freund Adjuvant）弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂，分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。
不完全弗氏佐剂是液体石蜡和羊毛脂混合而成，组分比为1~5:1，可根据需要而定，通常为2:1将加卡介苗或死的结核分枝杆菌加入不完全佐剂中（最终浓度为2~20mg/ml），即为完全弗氏佐剂。
弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂的成分成分完全佐剂不完全佐剂石蜡油6份+ +无水羊毛脂+ +杀死的分枝杆菌3-5mg + -磷酸缓冲溶液10份+ +操作演示在免疫动物前，先将弗氏佐剂与抗原按一定比例混合，制备成“油包水”乳状液。
佐剂和抗原体积比为1:1。
佐剂与抗原乳化方法1)研磨法2)注射器混合法（操作）佐剂的免疫生物学作用1)增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物质变成持久或强的免疫原，延缓抗原的释放，保护抗原不被水解，佐剂可延长抗原在体内滞留时间，避免频繁注射，有利于高亲和力抗体的产生。
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免疫佐剂的生物作用：
(1)抗原物质混合佐剂注入机体后，改变了抗原的物理性状，可使抗原物质缓慢地释放，延长了抗原的作用时间；
(2)佐剂吸附了抗原后，增加了抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬；
(3)佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理；
(4)佐剂可促进淋巴细胞之间的接触，增强辅助T细胞的作用；
(5)可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体，故免疫佐剂的作用可使无免疫原性物质变成有效的免疫原；
(6)可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴度；
(7)改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应，并使其增强。
免疫佐剂广义上是指免疫系统的调节剂，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，增强该抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，而本身并无抗原性的物质。
随着研究的不断深入，越来越多的物质被发现有佐剂功能，大致可以分为以下几类。
1.矿物质类佐剂
矿物质佐剂是传统佐剂中的一类，包括氢氧化铝胶和磷酸铝等，一直广泛用于人用和兽用疫苗的制备。
主要诱导体液免疫应答，抗体以IgG1类为主，刺激产生Th2型反应。
铝佐剂可刺激机体迅速产生
持久的高抗体水平，也比较安全，对于胞外繁殖的细菌及寄生虫抗原是良好的疫苗佐剂。
但仍存在缺点，皮下注射时常有肿胀或结块，抗原免疫原性弱时，不足以提高其免疫原性，特别是保护性免疫机制要求T细胞活性介导的免疫参加时，应使用其他佐剂。
2.油类佐剂
主要有佛氏佐剂和可降解的油类佐剂。
佛氏佐剂(freund,s adjuvant，FA)是免疫学上广泛应用的油类佐剂，并应用于很多兽医疫苗中，分为佛氏完全佐剂(FCA)和佛氏不完全佐剂(FIA)两种，佛氏不完全佐剂是由低引力和低粘度的矿物油及乳化剂组成的一种贮藏性佐剂。
佛氏完全佐剂是在不完全佐剂的基础上加一定量的分枝杆菌而成。
虽然FCA尚有一定的副作用，但其高度佐剂活性是其它物质难于相比的。
进一步的研究是用分枝杆菌片段，如胞壁酰二肽(MDP)、胞壁酰三肽(MTP)、蜡质D等代替分枝杆菌，以减少副作用，更有效地应用于兽医临床。
FA可使在正常状态下没有免疫原性的物质成为免疫原。
先作用于Th1细胞，后是Th2细胞，并能启动细胞免疫而发挥作用。
佐剂MF59由可降解的鲨烯油和两种表面活性剂及山梨聚糖酐单油酸酯、山梨聚糖酐二油酸酯构成水包油型佐剂，它可以刺激动物及人产生对亚单位抗原的体液和细胞免疫应答。
乳化复合油佐剂的效力高于FA，而且出现抗体与弱毒苗一样早。
3.微生物佐剂
微生物佐剂主要有脂多糖、分枝杆菌等。
分枝杆菌在兽医中广泛地应用于疫苗，如牛分枝杆菌卡介苗是早期应用成功的一种。
分枝杆菌经化学和物理方法处理，可获得具有佐剂活性的片段，包括MDP、MTP、蜡质D等，其中对MDP、MTP研究的较多。
MDP是从分枝杆菌细胞壁上提取的一种免疫活性件，适合胚胎干细胞的生长发育。
总之应用微囊化技术可以大规模扩增拟胚体，为种子细胞的生产奠定基础。