t-DNA鉴定1

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• DNA经溴乙锭（EB）染色，溴乙锭可以插入 DNA经溴乙锭（EB）染色， 经溴乙锭 DNA双螺旋结构两个碱基之间 双螺旋结构两个碱基之间， DNA双螺旋结构两个碱基之间，与核酸形成 络合物，在紫外（300nm,360nm）激发下， 络合物，在紫外（300nm,360nm）激发下， 产生桔黄色荧光（ nm可见光 可见光）。 产生桔黄色荧光（590 nm可见光）。
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• 利用三个引物做PCR鉴定纯合突变体 利用三个引物做PCR鉴定纯合突变体 PCR
• LP和RP是植物基因组上T-DNA插入位点两测的引物 LP和RP是植物基因组上 DNA插入位点两测的引物 是植物基因组上T • BP是T-DNA区段上的引物 BP是 DNA区段上的引物
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PCR由变性 退火 延伸三个基本反应步骤构成： 由变性--退火 延伸三个基本反应步骤构成： 由变性 退火--延伸三个基本反应步骤构成
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步骤
• 1.用液氮将100 mg 幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5 ml 离 1.用液氮将100 幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5 用液氮将 心管中加入预热至65℃ 65℃的 CTAB提取液 提取液， 心管中加入预热至65℃的600 μl 的2×CTAB提取液，轻 摇混匀。 摇混匀。 • 2.65℃水浴30 min，其间轻摇混匀。 2.65℃水浴 水浴30 min，其间轻摇混匀。 • 3.向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下 3.向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24： ），室温下 向上清液加入等体积的氯仿 轻轻混匀10 min， rpm离心 离心15 min， 轻轻混匀10 min，12000 rpm离心15 min，再转移上清入 新管。 新管。 • 4.向上清液中2倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀， 4.向上清液中 倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀， 向上清液中2 rpm离心 离心15 min，弃上清。 -20 ℃ 下30 min ，12000 rpm离心15 min，弃上清。 • 5.用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。 5.用70%乙醇洗涤沉淀一次 乙醇洗涤沉淀一次， rpm稍离心 弃上清。 稍离心， • 6.将沉淀晾干，加20-50 μl TE (pH 8.0)， 65℃水浴30 6.将沉淀晾干 将沉淀晾干， 208.0)， 65℃水浴 水浴30 min溶解DNA。 溶解DNA min溶解DNA。 • 7. 琼脂糖凝胶电泳检测或用紫外分光光度计检测 琼脂糖凝胶电泳检测或用紫外分光光度计检测DNA的浓 度和质量。
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PCR原理和方法 原理和方法
• 聚合酶链反应(Polymerase Chain 聚合酶链反应(Polymerase ,PCR)是体外核酸扩增技术 是体外核酸扩增技术。 Reaction ,PCR)是体外核酸扩增技术。
• 它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复 它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、 性好、易自动化等突出优点； 性好、易自动化等突出优点； • 能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍 片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍, DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉 眼能直接观察和判断； 眼能直接观察和判断；
遗传学实验
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 模式植物拟南芥T DNA插入突变体的鉴定

二、实验目的
•提取植物基因组DNA的方法 提取植物基因组DNA的方法 提取植物基因组DNA •PCR操作方法 PCR操作方法 PCR •琼脂糖凝胶分离核酸方法 琼脂糖凝胶分离核酸方法
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三、实验原理
1. Ti质粒和T-DNA：
•
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反应体系
20ul体系 20ul体系 H2O 10xTaq buffer （MgCl2free) MgCl2 (25mM) 引物LP 引物LP (10 uM) 引物RP 引物RP (10 uM) 引物BP 引物BP (10 uM) (各 dNTP (各2.5mM) 模板DNA(30 DNA(30模板DNA(30-50ng/μl) Taq酶 Taq酶(5U/μl ) 11.8ul 2ul 2ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul 2ul 0.2ul
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• 3. 用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体 PCR方法鉴定 DNA插入纯合突变体 方法鉴定T • 农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的 农杆菌Ti质粒转化植物细胞后， Ti质粒转化植物细胞后 后代分离群体中， DNA插入的 插入的纯合突变 后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变 杂合突变体， 野生型。 体，杂合突变体，和野生型。 • 在突变体研究中，需要的材料是纯合突变 在突变体研究中，需要的材料是纯合突变 体，所以必须从分离群体中将纯合突变体 鉴定出来。 鉴定出来。
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反应程序
• PCR由变性 退火 延伸三个基本反应步骤 由变性--退火 由变性 退火--延伸三个基本反应步骤
• 变性 变性— • 退火 退火— • 延伸— 延伸
预变性94℃ 预变性 ℃ 94℃ ℃ 53℃ ℃ 72℃ ℃ 循环35次 循环 次 72℃ ℃
5min 40sec 50sec 80sec
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琼脂糖凝胶电泳技术
• DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer中带负 电, 在电场中向正极移动。自由电泳时， 由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相 同，各核酸分子难以分开；
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• 选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物， 选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物， 使之具备一定的孔径， 使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效 应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较 大差异，达到分离的目的； 大差异，达到分离的目的；同样条件对 Maker电泳 电泳； Maker电泳；
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• 反应体系
H2O 10xTaq buffer （MgCl2free) MgCl2 (25mM) 引物LP 引物LP (10 uM) 引物RP 引物RP (10 uM) 引物BP 引物BP (10 uM) (各 dNTP (各2.5mM) 模板DNA(30 DNA(30模板DNA(30-50ng/μl) Taq酶 Taq酶(5U/μl )
Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段， Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段， 质粒是土壤农杆菌的天然质粒 DNA区段 当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞， 当农杆菌侵染植物细胞时， DNA区段能自发转移进植物细胞， 区段能自发转移进植物细胞 并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。 并插入植物染色体DNA中 所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T DNA。 DNA Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做
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• 2*CTAB提取液(PH8.0) 2*CTAB提取液(PH8.0) 提取液 • 2% CTAB • 1.4M Nacl • 20Mm EDTA(PH8.0) • Tris100Mm Tris-cl(PH8.0) • 0.2%巯基乙醇 0.2%巯基乙醇
• CTAB提取液（1000 ml）组成： CTAB提取液 提取液（ ml）组成： • 20 g CTAB • Tris100 ml 1 M Tris-HCl pH 8.0 • 40 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 • 81.8 g NaCl • 0.2%(V/V)β-巯基乙醇） 0.2%(V/V)β-巯基乙醇）
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•将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中， 将Ti质粒进行改造 将感兴趣的基因放进T DNA区段中 质粒进行改造， 区段中， 通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。 通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。
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• 2. T-DNA插入基因内部导致基因突变 T-DNA插入基因内部导致基因突变 • T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是 DNA插入到植物染色体上的什么位置， 插入到植物染色体上的什么位置 随机的。如果T DNA插入进某个功能基因的 随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的 内部，特别是插入到外显子区， 内部，特别是插入到外显子区，将造成基 因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti Ti质粒转 因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转 化植物细胞， 化植物细胞，是获得植物突变体的一种重 要方法。 要方法。
10min
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• 反应程序 • 预变性 • 94℃ • 94℃ • 53℃ • 72℃ • 循环30 30次 循环30次 • • 72℃
5min 40sec 50sec 90sec
10min
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• • • • • •
LP TCATCCACCATGGAAGAAAAG RP TTGGATACGATGCGAGTAACC 中间引物BP TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 用 LP+RP产生大带：1107bp • 用LBa1+RP产生小带：560-860bp
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扩增结果
•经过 经过PCR，在野生型植株，LP和RP这对引物扩增出分子量较大的产物（大带）； 这对引物扩增出分子量较大的产物（ 经过 ，在野生型植株， 和 这对引物扩增出分子量较大的产物 大带）； •在杂和突变体，LP和RP能扩增出分子量较大的产物（大带）， 在杂和突变体， 和 能扩增出分子量较大的产物 大带）， 能扩增出分子量较大的产物（ 在杂和突变体 •另外 和RP还能扩增出分子量较小的产物（小带）； 另外BP和 还能扩增出分子量较小的产物 小带）； 还能扩增出分子量较小的产物（ 另外 •在纯合突变体，只有 和RP能扩增出分子量较小的产物（小带）。 在纯合突变体， 能扩增出分子量较小的产物（ 在纯合突变体 只有BP和 能扩增出分子量较小的产物 小带）。