转基因植物对土壤微生物群落的影响及风险评价

论坛ＦｏＲＵＭ　转基因植物对土壤微生物群落的　影响及风险评价　

◎关正君　鲁顺保　魏伟　转基因植物的大面积商品化，给人类健康和生态环境带来潜在风险，其生态安　全性问题日益成为争论焦点。由于存在多种生物与非生物因素的干扰，有关转基因　植物对土壤生态系统的影响至今尚无定论。　

转基因植物从１９９６年商业化以来，无论在发达国　家还是在发展中国家，均呈现逐年增长的趋势。到　２０１３年．全球转基因植物种植面积累计已达１６亿公　顷。与此相伴随，转基因植物对整个生态系统的影响及　其潜在生态风险，也已受到社会各界高度重视。转基因　植物对土壤生态系统．尤其对土壤微生物群落的影响，　是对转基因植物投放市场之风险性评估的重要内容之　一。就转基因植物而言，由外源基因表达引起植物生理　代谢上的改变，以及外源基因的表达产物通过根系分　泌等途径进入土壤生态系统，均会对根际土壤微生物　群落发生潜在影响。开展转基因植物对土壤微生物影　响的研究．对于科学评价转基因植物潜在的生态风险　有重要意义。　可能的影响机制　转基因植物残留在土壤中的方式主要有外源基因　和外源基因表达产物两种，与此相应，转基因植物影响　土壤微生物群落的可能途径也主要有两种。　一种途径是，转基因植物的外源基因表达产物对　关正君：副教授，运城学院．运城０４４０００；博士后：中国科学院植物　研究所，北京１０００９３。ｚｈｅｎｇｊｕｎｇｕａｎ＠１２６．ｃｏｒｎ　鲁顺保：副教授，江西师范大学，南昌３３００２２；博士后：中国科学院　植物研究所，北京１０００９３。　魏伟：副研究员，中国科学院植物研究所，北京１０００９３。　Ｇｕａｎ　Ｚｈｅｎｇｊｕｎ：Ａｓｓｏｃｉａｔｅ　Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ，Ｙｕｎｃｈｅｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｕｎｃｈｅｎｇ　０４４ｏｏ０；Ｐｏｓｔｄｏｃｔｏｒ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｏｔａｎｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｂｅｉｉｉｎｇ　ｌＯｏｏ９３．　Ｌｕ　Ｓｈｕｎｂａｏ：Ａｓｓｏｃｉａｔｅ　Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ，Ｊｉａｎｇｘｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。Ｎａｎ—　ｃｈａｎｇ　３３００２２；Ｐｏｓｔｄｏｅｔｏｒ，　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｏｔａｎｙ，　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ。Ｂｅｉｉｉｎｇ　１Ｏ０ｏ９３．　Ｗｅｉ　Ｗｅｉ：Ａｓｓｏｃｉａｔｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｏｔａｎｙ．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００９３．　土壤微生物及其群落的多样性产生一定影响，这科　达产物的主要成分为转基因植物残体所含的或根系　接分泌进土壤的外源蛋白质。研究表明，在转基因　的根际土壤微生物群落中，某些特征性脂肪酸含虽　著提高，表明其微生物群落组成发生了变化。也有砌　发现．转Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｇｉｅｒｓｓｉｓ，苏云金杆菌毒蛋ｆ　基因植物对根际土壤的菌根真菌产生明显影响。然　又有些研究发现．转基因植物对土壤微生物区系　著影响。例如，大田种植的转成基因棉花与非转　对照植株相比，其根系分泌物对土壤根际微生物　显著影响。　另一种途径是．转基因植物的外源基因通过　基因转移（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ），就是通过将遗　质传递给非子代的其他细胞的方式，整合到土壤　物的基因组中，从而可能使土壤微生物的遗传特性　功能发生一定变化。例如，李（Ｂ．Ｌｅｅ）等人２０１０年　

ＶＶｋ，ＶＷ．ｋｅｘｕｅｍａｇ．ｃｏｒｎ　转　ｆ基因油菜根际土壤取样　论坛ＦＯＲＵＭ　田间转基因西瓜进行风险评估时，发现其中的３５Ｓ启　动子基因存在向土壤微生物转移的可能。转基因抗虫　棉中的ｎｐｔＩＩ基因可能向叶围细菌漂移。目前已在一种　能与植株共生的黑曲霉微生物中发现原来存在于转基　因油菜、黑芥菜、蒺藜和甜豌豆中的抗生素抗性基因。　但是也有文献报道，转基因植物发生水平基因转移的　频率低于自然转化的频率，因而转基因植物通过水平　基因转移给人类和环境带来的风险可以忽略不计Ｉ】１。　目前尚不明确，大量种植转基因植物对于土壤微　生物产生何种影响，以及影响的机制如何。这方面的研　究还不够系统，有待于运用新的技术和取得新的突破。　常用的研究方法　在评价转基因植物对土壤微生物的影响方面。目　前国内外最常用的研究方法大致有四种，即传统培养　法、微平板技术、现代生物标记技术和现代分子标记技术。　传统培养法传统的微生物培养方法是根据目标　微生物选择相应的专性固体培养基，对可培养的微生　物进行分离培养，然后根据各种微生物的生理生化特　征、外观形态及菌落形成单位来计测微生物的数量与　种类。该法虽然简单且易于操作，但由于培养基和培养　条件的限制，目前通过实验室人工培养方法分离、描述　的微生物种类和数量，仅占估计数量的１％～５％，而其　余９５％～９９％微生物种群仍未被分离。因此，传统培养　方法只能作为一种辅助手段，并只有与其他先进技术　相结合，才能较为客观而全面地反映土壤微生物群落　结构的真实信息。　微平板技术美国Ｂｉｏｌｏｇ公司开发的微平板技术　是测定土壤微生物对９５种不同碳源的利用能力，以　及这些微生物的代谢差异，用以表征土壤微生物代谢　功能多样性或结构多样性的方法。该方法由于操作简　便，效率高，培养周期短，结果可重现，而成为研究土壤　微生物多样性的主流方法之一。但由予培养环境如湿　度、渗透压、ｐＨ等方面的改变都可能引起微生物对碳　底物实际利用能力的改变，因此会造成一定误差闭。要　想获得与大量微生物之群落代谢和功能多样性相关的　信息，必须结合相关的分子生物学技术。　现代生物标记技术使用生物标志物（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ．　指在某种效应过程中可测定的特异性生物分子）来描　述土壤微生物的群落结构组成，是目前最常用的方法　之一。磷脂脂肪酸（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ，ＰＬＦＡ）是微　生物细胞膜的重要组成成分，不同种类微生物体内的　ＰＬＦＡ组成及含量显示出极大的差异，所以ＰＬＦＡ可作　为生物标志物，其种类及组成可用以描述微生物的群　落结构。ＰＬＦＡ的谱图分析方法常用于研究复杂群落　中微生物的多样性，表征在数量上占优势的土壤微生　物群落，包括不可培养微生物【３Ｊ。用该分析方法能直接　提取原位土壤中微生物群落的脂肪酸，不需要对土壤　微生物进行培养，因而可直接反映土壤微生物群落的　原貌。其缺点在于只适合活的微生物，不同的微生物群　落可能会产生重叠图谱。　现代分子生物学技术用于评价转基因植物对土　壤微生物影响的现代分子生物学技术有许多种，这里　列举若干。　一是基于核酸分子杂交技术的方法。核酸分子杂　交技术是１９７０年代发展起来的一种新的分子生物学　技术。在该类方法中，荧光原位杂交技术（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＦＩＳＨ；即以荧光标记取代同位素　标记而形成的一种新的原位杂交方法）是研究不可培　养土壤微生物群落之多样性最为常用和有效的手段。　ＦＩＳＨ技术使直接显现土壤栖息地微生物成为可能，可　用于对土壤样品中的微生物进行原位检测。　二是基于ＰＣＲ技术的方法。该类方法中代表性的　技术是变形梯度凝胶电泳（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ）和限制性片段长度多态性技术　（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）。　变形梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）是根据ＰＣＲ扩增的基　因或基因片段核苷酸序列的不同，进行片段的分离。根　据电泳条带的多寡和条带的位置。可以初步辨别出样　品中微生物种类的多少。以分析土壤样品中微生物的　多样性。由于ＤＧＧＥ具有可靠性强、重现性高、方便快　捷等优点。在近十年内已成为微生物群落遗传多样性　和动态分析的强有力工具。　限制性片段长度多态性技术（ＲＦＬＰ）是利用限制　性内切酶特性及电泳技术，对特定ＤＮＡ片段的限制　性内切酶产物进行分析，根据片段的大小及标记片段　种类和数量的不同，评价微生物的群落结构和多样性。　ＲＦＬＰ反映了ＤＮＡ水平上的变异。该技术可以对大量土　样进行分析，是研究微生物多样性的有效工具。末端限　制性片段长度多态性技术（ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｅｒｐｈｉｓｍ．Ｔ—ＲＦＬＰ）是在ＲＦＬＰ基础上发展　起来的新技术，相对于其他分子生物学技术具有分辨　率高、易于实现自动化等特点，是分析复杂环境微生物　群落的强有力工具之一。　三是宏基因组学（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ）技术。宏基因组　学也称为群落基因组学（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｇｅｎｏｍｉｅｓ），是指利　用现代基因组技术直接研究自然状态环境中的微生物　有机体群落。而不需要经过分离、培养单一种类的微生　物　。在土壤微生物多样性研究中，通过直接提取土壤　样品的总ＤＮＡ并进行限制性内切酶的酶切，获得大片　

２０１５：￣５月科学（６７卷３期　论坛ＦｏＲＵＭ　段的ＤＮＡ后直接与特定的载体连接，以构建克隆文　库．然后对文库进行筛选或者直接进行高通量测序分　析。如４５４测序技术，即根据焦磷酸测序法通过生物发　光对ＤＮＡ序列进行检测的技术；或Ｍｉｓｅｑ测序技术，　即以“边合成边”测序技术为基础。对数百万个ＤＮＡ片　段同时进行大规模平行测序的技术。　目前。基因测序技术及宏基因组分析技术是土壤　微生物多样性研究的前沿。通过对基因组文库中的基　因序列进行系统化研究．使土壤微生物的多样性分析　趋于完整客观。应用免培养的新方法和新技术，可绕过　微生物菌种分离培养这一技术难关，直接在基因水平　上研究、开发和利用无法培养的微生物资源。有利于揭　示不可培养微生物的基因多样性，为研究土壤微生物　的复杂群落结构提供了重要工具。　综合应用上述涉及土壤微生物的研究技术，可深　入研究诸多转基因植物对土壤微生物群落的影响，较　全面地考察土壤微生物群落的组成信息，更有效地监　测土壤微生物群落的时空变化，从而为转基因植物的　土壤生物生态安全研究提供强有力支持。当然。由于转　基因植物对土壤微生态系统影响的复杂性．目前的认　识仍然极为有限，还存在诸多不一致甚至相互矛盾的　研究结果。要想深入剖析转基因植物对土壤生态系统　特别是对土壤微生物群落之结构与功能的影响，必须　发展更先进的技术支撑系统．并需要在多种植物上进　行大量的田间试验和长期的跟踪研究等。　研究的进展　众多研究报道　示．关于转基因植物对土壤微生　物的安全性，存在毫浚大争议。多数研究认为，转基因　植物仅Ｘ，－ｔ土壤微生物有轻微影响或者没有影响嗍。只　有少数研究发现．转基因植物会使土壤微生物群落的　结构多样性发生显著变化。随着转基因作物种植时间　的加长以及可能的生物富集作用的不断扩大，这种潜　在的影响或风险有着不容忽视的高度不可预见性。下面　５Ｏ　姻４ｏ　蓑３０　誉２０　的１０　Ｏ　－显著影响－微小影响　无影响　黼　曩　曩　一　■　一　＿．　＿．■　抗虫　抗除草剂　抗病　品质优良　其他特性　转基因植物　关于各类型转基因植物对土壤微生物影响的ＳＣ，收　录论文数统计　列举有关几类转基因植物对土壤微生物影响的评价。　抗虫转基因植物对土壤微生物的影响　抗虫转基因植物所用的基因主要是苏云金杆菌毒　蛋白基因、蛋白酶抑制剂（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ｐ／）基　因、外源凝集素（１ｅｃｔｉｎ）基因、淀粉酶抑制剂（　一　ａｍｙｌａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ａＡＩ）基因、几丁质酶（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）基　因、核糖体失活蛋白（ｒｉｂｏｓｏｍｅ—ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ—ｐｒｏｔｅｉｎｓ，　Ｒ，尸）基因等。　目前国内外评估转基因植物对土壤微生物影响的　研究，多以转Ｂ￡植物为材料嘲。萨克西纳（Ｄ．Ｓａｘｅｎａ）等　人２００２年在温室试验中发现．转ＣｒｙｌＡｂ基因玉米　（Ⅳｊ＿（４６４　）和非转基因玉米根际土壤中或添加玉米　组织的土壤中可培养的细菌、放线菌和真菌数量无显　著差异。２００８年，巴拉昌达（Ｄ．Ｂａｌａｃｈａｎｄａｒ）等利用　ＤＮＡ指纹识别技术对转Ｂｔ棉花进行研究发现，转Ｂｔ　和非转Ｂｔ棉花根际有益变形细菌多样性之间没有显　著差异。２０１２年，宋亚娜等人利用ＰＣＲ—ＤＧＧＥ和荧光　定量ＰＣＲ技术研究发现，一定时期内种植转ｃｒｙｌＡｃ／　ｃｐｔｉ双价抗虫基因水稻不会影响土壤氨氧化细菌的群　落组成和丰度。然而在２００９年，朱荷琴等人的研究认　为，转豇豆胰蛋白酶抑制剂（　”）基因棉花对根际土　壤中细菌、放线菌和真菌的数量有显著影响。２０１１年，　甄志先等人研究了４年生转双抗虫基因７４１杨树试验　林在生长季节中土壤微生物种群数量的变化。结果表　明．转基因植株和非转基因植株之间在不同时期的根　际和根表土壤细菌、放线菌和真菌数量存在一定差异，　但未达到统计学显著的水平。　抗除草剂转基因植物对土壤微生物的影响　抗除草剂转基因植物所用的基因主要有抗草甘膦　的剧　Ｓ　基因，抗草丁膦的Ｐ　乙酰转移酶（曰　）基　因、抗溴苯腈的腈水解酶基因等。　根据加拿大贸易与可持续发展国际中心（ＩＣＴＳＤ）　的一份有关遗传修饰作物（ＧＭＣ）的调查报告显示，美　国科学家已发现。在施用抗草甘膦除草剂系列的作物　田中，由于大量使用草甘膦。有可能引起土壤微生物群　落和植物健康状况的改变［７１。邓菲尔德（Ｋ．Ｅ．Ｄｕｎｆｉｅｌｄ）　和格米达（Ｊ．Ｊ．Ｇｅｒｍｉｄａ）２００１年对抗草甘膦油菜进行　研究，发现转基因和非转基因油菜根际微生物群落存　在显著差异。徐广惠等人２００９年的研究发现，抗草甘　膦转基因大豆降低了根际土壤细菌的数量和细菌群落　的多样性，并对根际土壤中硝化螺旋菌属（Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ）　细菌（一类革兰氏阴性细菌）有一定的抑制作用。施马　伦贝格尔（Ａ．Ｓｃｈｍａｌｅｎｂｅｒｇｅｒ）等人研究发现，转ｐａｔ基　因玉米（Ｚｅａ　ｍａｙｓ）和甜菜（Ｂｅｔａｖｕｌｇａｒｉｓ）与非转基因植　株的根际细菌多样性之间无显著性差异。上述研究结