土壤学中的土壤微生物群落分析方法
土壤微生物宏基因组
土壤微生物宏基因组土壤微生物宏基因组是研究土壤微生物群落组成和功能的重要手段之一。
宏基因组学的兴起为我们揭示土壤微生物世界的奥秘提供了有力的工具和方法。
本文将从土壤微生物宏基因组的概念、研究方法、应用领域以及未来发展方向等方面进行介绍和探讨。
一、概念土壤微生物宏基因组是指通过高通量测序技术对土壤微生物群落中的全部基因进行测序和分析，以获取该群落的基因组信息。
与传统的微生物学研究方法相比，宏基因组学不仅可以研究单个微生物的基因组，还可以同时研究整个微生物群落的基因组，从而揭示微生物群落的结构和功能。
二、研究方法土壤微生物宏基因组的研究主要包括样品采集、DNA提取、高通量测序、数据分析和功能注释等步骤。
首先，需要在不同的土壤样品中采集微生物样品，并将其保存在适当的条件下，以保证样品的完整性和稳定性。
然后，通过DNA提取技术提取土壤微生物的基因组DNA，这是进行宏基因组测序的前提。
接下来，利用高通量测序技术对提取的DNA进行测序，获得大量的DNA序列数据。
最后，通过数据分析和功能注释等方法，对测序数据进行处理和解读，以获取土壤微生物群落的结构和功能信息。
三、应用领域土壤微生物宏基因组的研究在农业、环境和生态学等领域具有广泛的应用价值。
首先，它可以帮助我们了解土壤微生物的多样性和功能特点，揭示微生物对土壤生态系统的影响和作用机制。
其次，它可以用于评估土壤质量和健康状况，为土壤管理和农业生产提供科学依据。
此外，它还可以用于研究土壤中的微生物致病性和抗性机制，为疾病预防和治理提供理论支持。
此外，宏基因组学还可以应用于环境污染的监测和修复，为环境保护和可持续发展提供技术支持。
四、未来发展方向土壤微生物宏基因组研究在过去几年取得了长足的进展，但仍面临一些挑战和机遇。
未来的研究方向主要包括：1）进一步提高测序技术的准确性和通量，以获取更多的微生物基因组数据；2）开发新的数据分析方法和工具，以提高数据的解读效率和准确性；3）深入研究土壤微生物群落的功能特征和相互作用机制，揭示其对土壤生态系统的影响和调控机制；4）加强与其他学科的交叉和合作，如土壤学、植物学和生物信息学等，以提高土壤微生物宏基因组研究的综合应用能力。
土壤微生物多样性研究方法1
1 土壤微生物多样性研究进展土壤微生物多样性又称微生物群落结构，是指生命体在遗传、种类和生态系统层次的变化。
它代表着微生物群落的稳定性，也反映土壤生态机制和土壤胁迫对群落的影响。
生物多样性还可以定义为生命的丰富度( richness of life)，通常以土壤生物区系的变化和生物化学过程间的相互贡献来反映。
由于它能较早地预测土壤养分及环境质量的变化过程，被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一。
生物多样性作为指标在监测土壤变化和对胁迫的反映方面是重要的，同时对进一步了解土壤微生物群落状态也十分有用。
随着人们对环境资源保护意识的逐步加强和因人类影响而造成的多样性损失的客观存在，目前学术界对多样性问题倍加关注。
在微生物群落研究中，微生物的均衡性、丰富性和多样性是常用的指标。
2.1 土壤微生物多样性的测试方法研究进展2.1.1 常规微生物多样性研究方法(1) 传统的微生物培养法微生物平板培养方法是一种传统的实验方法。
这种方法主要使用不同营养成分的固体培养基对土壤中可培养的微生物进行分离培养，然后根据微生物的菌落形态及其菌落数来计测微生物的数量及其类型。
平板计数法被认为是监测特殊微生物群变化的非常有效的方法；由于这种方法人为限定了一些培养条件，常常造成某些微生物的富集生长，而另一些微生物缺失。
(2) PLFA 谱图分析法磷脂脂肪酸（Phospholipid FattyAcid ，PLFA)谱图分析方法、脂肪酸（FattyAcid)和脂肪酸甲醋（Fatty Acid Methyl Ester, FAME）谱图分析方法等早己应用于对感染致病微生物以及人类和动物体内微生物卫生的研究方面。
近些年来，磷脂脂肪酸分析方法也逐渐被应用于土壤微生物多样性的研究中来，并作为土壤微生物种群变化的监测指标。
颜慧等对中国科学院红壤生态实验站长期定位试验中不同施肥处理红壤水稻土的磷脂脂肪酸( PLFA)特性及酶活性进行了分析。
结果表明：不同施肥处理的土壤酶活性、养分、微生物生物量及微生物群落多样性差异较大；施肥处理增加了PLFA 的种类和微生物量；施肥土壤的真菌 PLFA 量大于不施肥土壤，细菌 PLFA 量小于不施肥土壤，说明真菌较细菌更能适应养分贫瘠的条件。
土壤微生物生物量及多样性测定方法评述
基 金 项 目 ：国家重 点基 础研 究发 展计 划 项 目 （ ０ ７ Ｂ ０２ ０５ ；国家 “ ２ ０Ｃ ４ ７０ — ） 十一 五’ 技 支撑 计划 资 助项 目 （ ０ ６ Ａ ０ Ａ １ 科 ２０Ｂ Ｃ １０ ） 作者 简介 ：胡 婵娟 （ ９ １ 生 ） １８ 年 ，女 ，博士 ，主 要进 行景 观生 态学 和 士壤 生态 学 的研究 。Ｅｍａｌｈｃ ａｊａ１８ ＠１６ｔｏｍ － ｉ ｕｈｎｕｎ９ １ ２ ：
２ 土壤 微 生物 多样性 的研 究方法 ． ２
土壤微生物多样性测试的传统方法为分离法 ， 该方法获得 的数据在一定程度上决定 于提取 的方 法和培养基类型。并且绝大部分土壤微生物无法用 现有 的分离 方法 进行 培养 。因此 ，该 方法 有很 大 的 局 限性 。在过 去 十几年 的时 间里 ，随着测 试技术 的 进步 ，土壤微 生物群 落结 构 的测 定方 法也 得到 了迅 速地 发展 ，新 的测定 方法 的 出现 如生 物标 志物法 、 磷酯脂肪酸分析法 、 核酸分析法及碳素利用法使人 们能够更好的评价土壤微生物群落结构和多样性 。 如图 １ 示。 所 ２２１ 基 于培 养 的微 生物群 落的测 定方 法 ． ． １ 微 生物平 板 培养法 ） 微生物平板培养方法是一种传统的实验方法。 这种方法主要使用不 同营养成分 的固体培养基对 土壤中可培养的微生物进行分离培养 ， 然后根据微 生物 的菌落形态及其 菌落数来计测微生物的数量 及其类型。平板培养法是进行土壤微生物分离培养 的常用方法 ，一般分为稀释 、 接种、培养和计数等 几个步骤，该方法简便易行 ， 一直以来 ， 被广泛应 用。这种方法在土壤健康的研究中应用较多 ， 许多 研 究 表 明利 用 该 方 法 得 到 的 土壤 微 生 物 的多 样 性 与土壤 的病害控制、有机质的分解等方面存在一定 的关系【 ｏ 但是有关研究表明与其他非培养方式 ３。 ］
土壤微生物群落结构研究方法
科技与创新┃Science and Technology&Innovation ·36·2020年第12期文章编号：2095－6835（2020）12－0036－02土壤微生物群落结构研究方法＊黄潇1，赵智勇1，蔡颖慧2（1.山西省分析科学研究院，山西太原030006；2.山西省生物研究院有限公司，山西太原030006）摘要：对土壤微生物群落结构研究方法进行了综述，主要有生物化学研究方法和分析生物学研究方法两大类。
生化法研究土壤微生物群落结构的方法主要包括微生物平板记数法、底物利用分析法、生物标记法。
土壤微生物在基因水平上的群落结构研究可以用核酸杂交技术、DNA成分多态性图谱分析、DNA长度多态性图谱分析、土壤宏基因组学、高通量测序技术等进行研究。
目前，分子生物学、基因技术已在微生物群落结构研究中获得了很大关注，高通量测序技术和基因组学技术也得到了更广泛的应用。
综上所述，每个方法都有各自的有优缺点，在实际选取时需要结合实际情况。
关键词：土壤；微生物群落结构；研究方法；分子生物学中图分类号：S154.3文献标识码：A DOI：10.15913/ki.kjycx.2020.12.0141前言土壤微生物维持着土壤物质循环和生态平衡，在植物养分转换中起着重要的作用，是土壤生态系统的重要组分。
土壤微生物的群落结构对土壤生态系统有很大影响，在调节土壤生态系统、环境治理和资源可持续利用方面具有重要意义。
研究土壤微生物多样性的方法有生物化学成分分析法和现代分子水平分析法两大类。
对土壤微生物群落结构的研究涉及多学科领域，如土壤学、微生物学及生态学等。
该项研究对应对全球气候变化、各类环境污染治理及维持生态功能等方面有重要意义。
2土壤微生物群落结构的生化研究方法生物化学法以生化角度为依据，主要包括平板记数法、底物利用分析法、生物标记法3种。
2.1平板技术——培养鉴定法此法用平板对细胞进行分离培养，后依据微生物菌落的数量和菌落的形态特征来判定微生物的数量及类型。
土壤微生物群落结构
研究土壤微生物的群落结构？
A ?
框架结构:
A 对土壤微生物群落结构的研究
采集土样，土壤的处理
A土壤理化性质分析
土壤微生物群落结构分析
A土样在理化性质情况下对土壤微 生物群落结构的影响
文献
培养条件下二氯喹啉酸对土壤微 生物群落结构的影响
（2015）
岷江干旱河谷造林对土壤微生物 群落结构的影响
166.6 μg/kg
格木林 马尾松林 上面二者混交林
旱季（1月）
雨季（7月）
4℃/风干样品 质的分析 -20℃ : PLFA
：理化性
退耕地 2003 2006 2011
立地条件不同 造林时间不同
2005 2002
A土壤理化性质分析
对土壤理化性质的分析，分别从土壤 温度、土壤PH、含水量、全氮、全碳、
A土样在理化性质情况下对土壤微生物群落结构的影响
将提取出的磷脂脂肪酸进行主成分分析，分
析土壤理化性质中生物量与总的PLFA之间的
相关性。
框架结构:
A 对土壤微生物群落结构的研究
采集土样，土壤的处理
A土壤理化性质分析
土壤微生物群落结构分析
A土样在理化性质情况下对土壤微 生物群OC、SON、 MBC、MBN…？ 对于A的切入点要考虑的仔细。
（2014）
南亚热带 3 种人工林土壤微生物生 物量和微生物群落结构特征（2013） 南亚热带乡土树种人工纯林及混
交林土壤微生物群落结构
（2014）
A
1 2 除草剂 干旱河谷造林
A的切入点
淹水和不淹水的水田土 不同浓度 不同造林时间 不同造林条件 旱季和雨季
方法
PLFA PLFA PLFA
土壤微生物分析方法
土壤微生物分析方法周丽霞1. 土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸提取法）Jenkinson and Powlson（1976）比较了γ-射线、高压灭菌、干热灭菌、氯仿熏蒸灭菌的效果，发现氯仿熏蒸灭菌处理可杀死99％以上的土壤微生物，并且未改变土壤的理化性质，且容易从土壤中除去。
因此，现在多利用氯仿熏蒸法进行土壤微生物生物量的测定。
（1）原理：土壤经氯仿熏蒸处理后土壤中的微生物被杀死，造成细胞破裂，使细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中可提取的碳增加。
用盐溶液提取出由死后的微生物体内渗透出来的有机碳，通过测定浸提液中的碳含量，可以计算土壤微生物量碳。
（2）操作步骤：①预处理：一般不需要。
如果担心土壤状况可能会影响分析结果（如土壤太干，土壤中微生物生长不好等），可以将采集到的土壤调节其含水量达到最大持水量的60％，在25℃预培养1周。
②氯仿熏蒸处理（在通风橱内进行）：在低温下保存的土壤要先从冰箱中取出，待放置到室温时再进行分析。
称取20 g过2mm筛的新鲜土样置于50 ml 小烧杯中，放入真空干燥器内，并在真空干燥器内放置一装有去乙醇氯仿的小烧杯，烧杯内可放置几片防爆沸的干净小瓷片。
同时放入一小烧杯稀氢氧化钠溶液以吸收熏蒸期间释放出来的CO2，还应放一装水的小烧杯（或在干燥器底部放一层湿滤纸）以保持湿度。
用少量凡士林密封干燥器，在真空泵与干燥器之间可以加一缓冲瓶以防止氯仿爆沸或由于抽真空使干燥器内外压力变化而造成干燥器破裂等现象发生，然后用真空泵抽气至干燥器内氯仿沸腾。
关闭真空干燥器阀门，在25℃下暗处放置24小时。
熏蒸完成后，打开干燥器阀门（此时应听到空气进入的声音，否则可能熏蒸不彻底，要重新熏蒸），取出装水的小烧杯（或湿润的滤纸）、装有碱液和氯仿的烧杯（氯仿可倒回瓶中重复使用），用真空泵反复抽真空，并打开干燥器以除去土壤中残存的氯仿（止闻不到土壤中的氯仿气味）。
另称取等量土壤样品放入另一干燥器中，但不熏蒸，作为对照土壤。
土壤微生物研究方法
第二节 土壤微生物的计数与分析
• 一、培养计数法
•
根据培养基上所生长微生物的数量来 估算土壤中微生物的数量的方法
（一）一般微生物的分离与计数
• 稀释平板法
• 最大或然数法（MPN稀释法） • 土粒法
• 稀释平板法：
•
用已知质量的土壤在适量的溶液中搅拌的时候，微生 物和土壤分离，这些分开的微生物细胞在营养琼脂平板上 生长成为分散的菌落，根据菌落数换算得单位重量土壤中 微生物的数量。土壤中微生物的数量很多，因此必须取少 量样品制成土壤悬液，然后稀释，使发育在培养皿中的菌 落可以很好地分散开
测定是微生物在与野外环境完全不同的溶液 中的代谢活性，因此，也不能确定它的结果能 否反映土壤区系的实际代谢情况；
二、土壤微生物结构多样性分析
• 磷脂脂肪酸法也称为PLEA法 • （phospholipid fatty acid 法）； • 磷酸脂肪酸是所有微生物细胞膜磷脂的组分，具有结构多 样性和较高的生物学特异性，用磷酸脂肪酸作为标记物来 研究鉴别土壤微生物群落结构多样性变化。
?土壤微生物细胞利用31种碳源进行代谢以代谢过程产生的酶与四唑类显色物质如种碳源进行代谢以代谢过程产生的酶与四唑类显色物质如ttctv发生颜色反应的浊度差异为基础运用独有的显性排列技术分析土壤微生物的代谢特征指纹图谱反映不同环境条件引起的土壤微生物群落变化发生颜色反应的浊度差异为基础运用独有的显性排列技术分析土壤微生物的代谢特征指纹图谱反映不同环境条件引起的土壤微生物群落变化?biolog测试板含有96个小孔除对照外其余孔内分别含有不同的有机碳源和一种指示剂通过接种菌悬液根据微生物对碳源利用时指示剂颜色变化差异来鉴定微生物群落功能多样性个小孔除对照外其余孔内分别含有不同的有机碳源和一种指示剂通过接种菌悬液根据微生物对碳源利用时指示剂颜色变化差异来鉴定微生物群落功能多样性该法优点?灵敏度高分辨力强?无需分离培养纯种微生物可以最大限度地保留微生物群落原有的代谢特征无需分离培养纯种微生物可以最大限度地保留微生物群落原有的代谢特征?测定简便数据读取与记录可以由计算机辅助完成测定简便数据读取与记录可以由计算机辅助完成?可以连续监测微生物的变化可批量分析该法缺点?特别依赖于群体生理活性不能监测休眠体也不能检测那些不能利用特别依赖于群体生理活性不能监测休眠体也不能检测那些不能利用biolog碳源底物的群体
土壤微生物分析方法
土壤微生物分析方法
一、引言
土壤是地球上肥沃的生活空间，也是物质循环的重要环节。
微生物在土壤中起着重要作用，它们参与着养分、水、氮的循环，帮助植物吸收养分和水，并发挥抗病虫、降解污染物等作用，是土壤生态系统中的重要组成部分。
随着科学技术的发展，目前的研究已经逐渐从单一微生物研究转变成研究其复杂而多样的群落，并且研究微生物群落的多样性和功能。
因此，准确研究土壤微生物以及其群落结构及功能，对于土壤环境的分析和调控有重要意义。
1、液体培养法
液体培养法是一种用于分析土壤微生物群落的常用方法，它的工作原理是在恒温的培养箱中，用有机物质和无机物质组成的培养基培养土壤中的微生物，并监测它们的生长。
培养基的组成成分可以根据需要变化，以考察特定微生物的生长情况及功能。
液体培养法可以清楚的显示不同类型的微生物群落的数量和组成，为分析其功能及其影响环境的作用提供重要的参考依据。
2、分子生物学技术
分子生物学技术包括核酸提取、PCR扩增、PCR测序等技术，主要用于检测土壤中的微生物群落结构，研究其适应性、多样性、抗药性等方面的知识。
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土壤学中的土壤微生物群落分析方法土壤生态系统是一种充满生机的生物体系，其中土壤微生物群落是其中最丰富和重要的组成部分之一。
土壤微生物在土壤生态系统中起着重要的作用，包括有机质分解、氮循环、生物固氮以及供给植物生长所需的营养元素等。
因此，对土壤微生物群落进行准确分析有助于了解土壤生态系统的健康和状况，为环境保护和农业生产提供有价值的参考依据。
本文将介绍土壤学中常用的土壤微生物群落分析方法。
一、DNA测序技术
近年来，随着高通量测序技术的不断发展和成熟，DNA测序技术已成为研究土壤微生物群落多样性的主要手段。
目前常用的DNA测序技术包括Sanger测序、454测序、Illumina测序和PacBio测序等。
这些技术的主要区别在于读长、测序准确度、数据处理复杂度和成本等方面。
其中，Illumina测序技术是应用最广泛的测序技术之一。
该技术具有高通量、高准确度和低成本等优势，能够产生数百万到数十亿个序列，适用于研究微生物群落组成、特定功能基因的分布和微生物群落的分子进化等。
但该技术也存在一些限制，如读长
短、测序偏差和寡核苷酸错误等，需要进行数据过滤和样本对比
等后续分析。
二、FISH技术
FISH（Fluorescence In Situ Hybridzation）是一种在原位的方法，能够直接观测微生物群落中细菌的存在和数量。
该技术使用DNA
探针标记靶细胞的核酸序列，配合荧光探针进行检测和成像，可
以定量测量目标细菌在样品中的丰度和空间分布。
FISH技术的优
势在于高分辨率的成像和定量准确性，能够提示具体的微生物存
在形态，如球形、杆状等。
三、PCR-DGGE技术
PCR-DGGE（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）技术依赖PCR扩增样品中的16S rRNA基因，然
后将PCR产物在含有变性剂的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，通过电泳
道中的变性梯度来分离不同的微生物群落。
通过切割目标区域进
行提取，洗脱，重新测序得到相应的DNA序列。
该技术具有毛弱
单细胞提供了微生物群落结构和定量的信息，其优点在于无需知
道组成物质的成分，快速，简单，成本低，但是可控性差，存在
某些微生物有误解的可能性。
四、功能基因芯片
功能基因芯片技术是一种高通量感知多样性和功能基因的方法，通过内置多个微生物基因和探针，可大规模快速评估微生物群落
的组成和功能。
该技术不需要进行PCR扩增，可以通过多重探针
直接检测样品中的基因，检测结果还可以用于构建微生物群落功
能图谱，揭示微生物在有机物分解、氮循环、硫循环、酸碱调节
等方面的作用。
综上所述，土壤微生物群落的分析方法主要包括DNA测序技术、FISH技术、PCR-DGGE技术和功能基因芯片技术等。
这些方
法各有优缺点，且需要根据研究问题和实验条件等因素综合选用。
期望这些方法能为更好的了解土壤微生物群落提供一定的帮助。