截短侧耳素产生菌的鉴定及发酵培养基初筛

２００８年６月　第４５卷第３期　四川大学学报（自然科学版）　

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）　Ｊｕｎ．２００８　

ＶＯ１．４５　Ｎｏ．３　

文章编号：０４９０—６７５６（２００８）０３—０６９９—０４　截短侧耳素产生菌的鉴定及发酵培养基初筛　

黄宇琪，张　怡，胡昌华　（西南大学药学院现代生物医药研究所，重庆４００７１５）　

摘要：对产截短侧耳素（ｐｌｅｕｒｏｍｕｔｉｌｉｎ）的真茵Ｐ４—０４进行形态学观察和ＩＴＳ保守序列鉴定，　初步鉴定Ｐ４—０４可能属于担子茵纲斜盖菇属新种．采用单因子实验对发酵培养基条件筛选．　优化结果显示，最佳碳源为果糖，浓度为５％，最佳氮源为２％的黄豆饼粉，Ｆｅ￣）４添加浓度为　０．０４％．在此条件下获得的产量比原始条件提高７３．１％．　关键词：截短侧耳素产生茵；鉴定；单因子实验；发酵　中图分类号：Ｑ９３—３３１　文献标识码：Ａ　

Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｐｌｅｕｒｏｍｕｔｉｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｆｕｎｇｕｓ　ａｎｄ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　

ＨＵＡＮＧ　Ｙｕ—Ｑｉ，ＺＨＡＮＧ　Ｙｉ，ＨＵ　Ｃｈａｎｇ－Ｈｕａ　（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　４００７１５，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｆｕｎｇｉｌ　Ｐ４—０４　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｐｌｅｕｒｏｍｕｔｉｌｉｎ　ｉｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＩＴＳ　ｃｏｎ—　ｓｅｒｖｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ＢＬＡＳＴ．Ｐｒｉｍａｒｙ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｈｏｗｓ　ｔｈａｔ　Ｐ４—０４　ｍａｙ　ｂｅｌｏｎｇ　ｔｏ　Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ．Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ　ｓｐ．Ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ　ｔｅｓｔ　ｉｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｕｇｇｅｓｔ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅ　ｉＳ　５％ｆｌｕｃｏｓｅ；ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｓｏｕｒｃｅ　ｉＳ　２％Ｓｏｙｂｅａｎ　ｃａｋｅ　ｐｏｗｄｅｒ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＦｅＳＯ４　ｉｓ　０．０４％．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｆｉｎａｌ　ｍｅｄｉｕｍ　ｉｎｃｒｅａｓｅｓ　７３．１％ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｌｅｕｒｏｍｕｔｉｌｉｎ—ｐｒｏｄｕｃｅｒ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｓｉｎｇｌｅ—ｆａｃｔｏｒ　ｔｅｓｔ，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　

１　引　言　截短侧耳素（ｐｌｅｕｒｏｍｕｔｉｌｉｎ）是由Ｋａｖａｎａｇｈｔ１Ｊ　等在１９５１年首次分离鉴定的一种广谱的二萜烯类　抗生素．１９７６年，Ｆ．Ｋｎａｕｓｅｄｅｒ　］等对截短侧耳素　产生菌Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ　ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ的发酵条件、截短　侧耳素的化学结构和生物合成途径进行了初步研　究．后来经过对其衍生物的研究发现Ｇ１４侧链对　于截短侧耳素类物质的抑菌活性有很大的影　响Ｌ３．４　Ｊ．它们通过作用于细菌５０Ｓ核糖体亚基抑止　蛋白质合成，导致菌体死亡，主要用于治疗革兰氏　阳性菌、支原体以及钩端螺旋体引起的感染　５．目　前已有通过截短侧耳素衍生合成的兽用抗生素泰　妙菌素和沃林霉素上市，而衍生合成的人用抗生素　Ｒｅｔａｐａｍｕｌｉｎ已于２００６年提交ＦＤＡ新药审批．　前期从土壤中筛选具有抗菌活性的微生物时，　筛选到一株能够抑制大多革兰氏阳性菌及部分革　兰氏阴性菌的真菌Ｐ４—０４，尤其对革兰氏阳性球菌　的抑制作用非常明显．经ＨＰＬＣ分析，代谢产物与　截短侧耳素保留时间相同．本文对Ｐ４—０４从形态　学和分子生物学上进行鉴定，并对发酵培养基的碳　源、氮源及Ｆ　浓度进行初步筛选．　

２材料与方法　２．１材料　２．１．１菌株Ｐ４—０４菌种由本实验室筛选．　

收稿日期：２００７－０３—２２；修回日期：２００７—０５—１６　基金项目：重庆市科技攻关项目（２００３．８１１０）　作者简介：黄宇琪（１９８１一），女，重庆市璧山县，在读硕士研究生．研究方向为微生物药学．Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｋｙｗｏｎ４ｇ＠ｇｒｒｍｉｌ．ｃｏｍ　通讯作者：胡昌华．Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｈｈｕ￣ｓｗｕ．ｅｄｕ．ｃｆｌ　

维普资讯 http://www.cqvip.com ７００　四川大学学报（自然科学版）　第４５卷　２．１．２培养基ＰＤＡ培养基（ｇ／Ｌ）：土豆２００，葡　萄糖２０，琼脂２０，ｐＨ　６．５．　种子和发酵基本培养基参照Ｆ．Ｋｎａｕｓｅｄｅｄｒ等　的研究　Ｊ配方略有修改．种子培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄　糖５０，酵母提取物１５，ＭｇＳＯ４　０．５，Ｃａ（ＮＯ３）２　０．０５，ＫＨ２ＰＯ４　１，ｐＨ　６．５．　发酵基本培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖５０，玉米浆粉　２０，ＭｇＳＯ４　０．４，Ｃａｃｏ３　１，豆油４，ｐＨ　６．５．　２．２方法　２．２．１菌种鉴定观察Ｐ４—０４在ＰＤＡ平板上的　生长情况及菌丝的显微结构等．　真菌基因组参照液氮研磨饱和酚提取法进行　提取ｌ　６１．利用通用引物ＩＴＳ１，ＩＴＳ４，对ＩＴＳ１一ＩＴＳ４　区进行ＰＣＲ扩增．ＰＣＲ产物由上海英俊生物公司　测序，测序结果在Ｇｅｎｂａｎｋ中进行比对．　２．２．２　发酵培养与产物的检测　培养条件，将　Ｐ４—０４接种于ＰＤＡ斜面活化，２５℃培养７　ｄ．将活　化的Ｐ４—０４接种到种子培养基中２５℃２００　ｒ／ｍｉｎ　振摇培养７　ｄ，以１０％接种量转入二级种子液，相　同条件培养３　ｄ，按１０％接种量转入发酵培养基　中，２５℃２００　ｒ／ｍｉｎ振摇培养９　ｄ，取发酵菌液１０　ｍＬ，加入１０　ｍＬ甲醇混匀，２５℃振荡提取２４　ｈ，　４℃离心，上清液供　Ｉ　检测．　ＨＰＬＣ检测条件，检测仪器：岛津ＬＣ－２０ＡＴ高　效液相色谱仪．固定相ＯＤＳ　Ｃ１８反相柱（５　ｋｔｍ，　４．６　ｌｎｒｎＸ２５０　ｌｎｒｎ），流动相为磷酸：甲醇＝４５：５５，　检测波长２０５　ｎｍ，流速：１　ｍＬ／ｍｉｎ，进样量２０　Ｌ　（发酵产物在此条件下保留时间：１７．３１４）．根据截　短侧耳素标准曲线（Ｙ＝４．３１０８５６ｅ一００７Ｘ，Ｒ　＝　０．９９９４）计算发酵液中产物含量．　２．２．３不同因素对产物发酵的影响　将不同的碳源、氮源、以及铁离子实验组按照　１０％接种量接人发酵培养瓶中，２５℃２００　ｒ／ｍｉｎ　振摇培养９　ｄ，发酵液加入等体积甲醇，ＨＰＬＣ检　测．根据３次实验平均值进行产物分析．　供试碳源有：葡萄糖，果糖，蔗糖，麦芽糖，可溶　性淀粉，甘露醇，含量为５％．以２％玉米浆粉作为　氮源对照．　供试氮源包括有机氮和无机氮两种．有机氮：　蛋白胨，玉米浆粉，黄豆饼粉，鱼粉，酵母提取物；无　机氮：ＮＨ４Ｃ１，ＮａＮＯ３浓度为２％．以５％葡萄糖　作为碳源对照．　在摇瓶基本培养基中加入终浓度为０．０２％，　０．０４％，０．０８％的ＦｅＳＯ４．　

选择优化后培养基进行发酵验证，与基本培养　基比较产物的提高比率．　

３　结　果　３．１菌种鉴定　３．１．１形态观察菌丝在ＰＤＡ中以菌种为圆心　向四周呈放射状延伸，菌丝呈白色，生长浓密．菌丝　纤细，宽度均在２．５－－３　ｍ，有横隔，未发现锁状联　合．菌丝培养至１个月未观察到孢子的形成．最长　观察至３个月，观察不到子实体的形成．　３．１．２分子鉴定以ＩＴＳ１和ＩＴＳ４为引物，ＰＣＲ　扩增获得大小约６５０　ｂｐ的ＤＮＡ片段（图１）．　

２　ｂｐ　２０００　１０００　７５０　５００　

２５０　１００　

图１　Ｐ（、Ｒ扩增的ＩＴＳ１／１Ｔｓ４之间的　保守序列　Ｆｉｇ．１　Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＩＴＳ１　ａｎｄ　ＩＴｓ４　ｂｙ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　１：ＰＣＲ产物；２：ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００　

ＰＣＲ产物测序结果在Ｇｅｎｂａｎｋ数据库中进行　ＢＬＡＳＴ，发现该菌与担子菌纲斜盖菇属斜盖菇　Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ　ｐｒｕｎｕｌｕｓ的ＩＴＳ序列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｒｎ—　ｂｅｒ：ＡＹ２２８３４８．１）具有９１％的同源性．对Ｐ４—０４　的ＩＴＳ序列和ＧｅｎＢａｎｋ中相似性较高的菌株用　Ｖｅｃｔｏｒ　ＮＴＩ　ｓｕｉｔｅ　９．０的ＡｌｉｇｎＸ作进化树分析，同　样发现亲缘关系最近的是Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ　ｐｒｕｎｕｌｕｓ（图　２），推测该菌可能是斜盖菇属的一个新种，深入的　鉴定工作正在进行．　３．２不同营养因子对发酵产物的影响　３．２．１　不同碳源的影响　结果显示以果糖为碳　源，截短侧耳素含量最高（图３），产量比基本发酵　培养基提高了１０％．在发酵过程中，菌体生长都较　粘稠，到发酵后期菌体开始出现轻微自溶．葡萄糖　和可溶性淀粉的产量相差不大．在发酵过程中，观　察到二者的菌体粘度都比较相似，发酵前期Ｐ４—０４　利用葡萄糖的能力比可溶性淀粉强，菌体浓度稍　

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