大肠杆菌高密度培养基组分
大肠杆菌高密度发酵
课程设计说明书课程名称：发酵工程设计题目：大肠杆菌的高密度发酵院系：生物与食品工程学院学生姓名：******学号：************专业班级：10生物工程（2）班指导教师：*****课程设计任务书大肠杆菌的高密度摘要：在工业生产过程中，由于技术或是生产条件的限制，在大肠杆菌高密度发酵培养中很难实现其高密度发酵。
针对这一问题，我组专门为此设计一实验来探索发酵过程中的限制性因素。
我们从开始的发酵培养基的组分及其配比，到后来的灭菌方式，投料程序以及在发酵过程中温度的设定控制，PH值的设定控制及溶氧的设定控制都进行了严格的监测，再到最后的OD值，氨基氮以及还原糖的测定都进行严谨的完成。
关键词：大肠杆菌高密度发酵OD值目录1.设计背景 (1)1.1大肠杆菌高密度发酵产品及其质量安全现状 (1)1.2高密度发酵定义 (1)1.3 规定标准 (1)2.设计方案 (2)3.方案实施 (3)3.1 大肠杆菌简介 (3)3.2 菌种选材 (3)3.3 种子扩大培养 (3)3.4 发酵培养基配比 (3)3.5 发酵过程 (4)4.结果与结论 (7)5.收获与致谢 (9)6.参考文献 (10)1.设计背景1.1大肠杆菌高密度发酵产品及其质量安全现状目前，在发酵产业进入工业化，自动化的今天，产品的高密度发酵越来越受到国内外的重视。
人们在根据实验与生产阶段总结的经验中，逐步掌握发酵生产所需要的最佳控制条件。
在此过程中所得的产品密度更大，纯度更高，质量安全也得到了保障。
1.2高密度发酵定义高密度发酵（high cell density cultivation，HCDC)是指在一定条件和培养体系下，获得最多的细胞量，由此更多地或更高效地获得目的产物。
即利用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著提高，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)。
通常认为菌体密度超过50 g(DCW)／L即为高密度发酵。
大肠杆菌工程菌高密度发酵的初步研究
霉素 ４０１ｘＬ。摇匀 ，倒人平板 ，冷却后放 ３７℃培养箱 加适量的无菌水 ，使培养基浓度与灭 菌之前大致相
中保 存 。
同，按 １０％接种量接种 ，３７￣Ｃ，罐压 ０．０５ ＭＰａ进行
１．２．２ ２０％玉米浆储液的制备 ｉ取 ２００ｇ干燥 的玉 发酵，每隔 １ｈ取样 ，离心测定湿 菌体产量，同时测定
验结果 表明 ，当恒 ｐＨ值为 ６．５，补料类 型甘油速度为 ３５ｍＬ／ｈ。连续补料 ６ｈ，发酵 １２ｈ结束 ，可使湿菌体量达到 ５１．１ｇ／Ｌ，初步达到
了高密度 发酵 的要求 。
关 键词：高密度发 酵；补料类 型 ；大肠杆菌
中图分类号 ：ＴＱ９２０．６；Ｒ３７８．２ Ｉ
文 献标识码 ：Ａ
摸索不同 ｐＨ值对菌体产量 的影响 ，将 ｐＨ值分 别设定为 ５．５、６．５、７．５三个不 同值进行恒 ｐＨ值发 酵 ，以 ３５ｍＬ／ｈ流速进行甘油补料 ，每隔 ｌｈ取样 ，离
心测定湿菌体产量 ，同时测定 ＯＤ值 ，在加入等在诱 导结束 以后 ，测量菌体生物转化能力 。 １．６．２ 不同补料类 型对菌体产量的影响
米浆干 粉 ，加 自来水 ｌＬ，加 热溶 解 ，冷 却 ，用 饱 和 ＯＤ值 、ｐＨ值 ，在加入等 在诱 导结束 以后 ，测量菌体
ＮａＯＨ调 ｐＨ值 至 ７．０，过 滤 除 沉 淀 ，１２１ｏｃ，灭 菌 生物转化能力 。
大肠杆菌培养基
大肠杆菌培养基大肠杆菌（Escherichia coli）是一种革兰氏阴性杆菌，是一种常见的肠道细菌，也是一种重要的实验室模式生物。
大肠杆菌培养基是一种用于培养和繁殖大肠杆菌的营养培养基，它提供了大肠杆菌所需的营养物质和生长条件，使其能够在实验室中进行研究和应用。
大肠杆菌培养基的组成。
大肠杆菌培养基的组成通常包括以下成分：1. 碳源，大肠杆菌需要碳源来进行能量代谢和生长。
常见的碳源包括葡萄糖、蔗糖、乳糖等。
2. 氮源，氮源是大肠杆菌合成蛋白质和核酸的重要原料。
常见的氮源包括氨基酸、氨基酸盐、蛋白胨等。
3. 矿物盐，矿物盐是细胞生长和代谢所必需的微量元素，如钙、镁、钾、磷等。
4. 生长因子，大肠杆菌培养基中通常还添加了一些生长因子，如维生素、核酸、辅酶等，以促进大肠杆菌的生长和繁殖。
5. pH调节剂，培养基的pH值对大肠杆菌的生长有重要影响，通常需要添加pH调节剂来保持培养基的适宜pH范围。
根据不同的研究目的和实验条件，大肠杆菌培养基的配方会有所不同，可以根据实际需要进行调整和优化。
大肠杆菌培养基的制备方法。
大肠杆菌培养基的制备方法相对简单，一般包括以下步骤：1. 称取适量的葡萄糖、蛋白胨、氯化钠等成分，加入适量的蒸馏水中，搅拌均匀。
2. 调节pH值至适宜范围，通常大肠杆菌培养基的pH范围为7.0-7.4。
3. 加热蒸馏水，使培养基成分充分溶解。
4. 经过高温高压灭菌，使培养基无菌。
5. 分装培养基到适量的培养皿或试管中，待凝固后即可使用。
根据实验需求，可以添加抗生素、染色剂等成分，以实现对大肠杆菌的选择性培养。
大肠杆菌培养基的应用。
大肠杆菌培养基在科研和实验室应用中具有广泛的用途，主要包括以下几个方面：1. 细菌学研究，大肠杆菌培养基常用于大肠杆菌的分离、鉴定和培养，用于研究其生长特性、代谢途径、致病机制等。
2. 分子生物学实验，大肠杆菌是常用的重组DNA宿主细胞，大肠杆菌培养基可用于大肠杆菌的转化、表达、筛选等实验。
(完整版)大肠杆菌培养基配制及培养方法
大肠杆菌培养一、菌种冻存液的制备含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。
二、培养基制备LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4）液体培养基胰化蛋白胨 10.0g酵母粉 5.0g氯化钠 10.0g水 1000mlpH 7.4固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂三、平板的制备1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。
2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。
如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。
3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。
所有锥形瓶如上述操作。
用记号笔注明培养基名称、配制日期。
4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。
5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。
液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。
将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。
6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。
四、接种大肠杆菌1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。
2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。
大肠杆菌实验结果与分析
2、实验结果与分析2.1、细菌总数检测结果2.1.2、细菌总数的计算与报告根据菌落总数的计算方法：1、若只有一个稀释度平板上的菌落术在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。
2、若有两个连续稀释度的平均菌落数载适宜计数范围内时，按下式计算：N=∑c/[(n1+0.1n2)d]式中：N—样品中菌落数；∑C—平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1—第一个适宜稀释度平板上的菌落数；n2—第二个适宜稀释度平板上的菌落数；d—稀释因子（第一稀释度）为1.75x107；在浓度10—6(g/ml)的时候，大肠杆菌的细菌总数约为1.60x107；在浓度10—7(g/ml)的时候，大肠杆菌的细菌总数约为2.01x107。
分析数据可知，在浓度10—7(g/ml)的时候，细菌总数远大于其他两个梯度，这与常理不符。
那么有可能是实验过程中的错误导致，可能是稀释不够、密封不紧、没有进行无菌操作等因素有关。
2.2、大肠菌群检测结果2.1.1、初发酵各浓度梯度阳性管数统计附：检验原始记录检验原始记录检测记录与结果培养基配制：样品配制：1、 固体样品，无菌称取25g 样品加225ml 生理盐水，均质。
2、 液体样品，需稀释的，吸取25ml 于225生理盐水，混匀。
菌落总数：检验依据：GB/T4789.2-2008大肠杆菌：检验一句GB/T4789.3-2003大肠杆菌：检验一句GB/T4789.3-2003注：“P ”表示阳性结果，“N ”表示阴性结果检验起止时间：2011年09月25日至2011年09月27日检测人:复核人：。
培养基组分对hCG核酸疫苗质粒拷贝数的影响
培养基组分对hCG核酸疫苗质粒拷贝数的影响王剑;夏杰;陆兵;徐殿胜【摘要】研究了培养基组分对hCG核酸疫苗质粒拷贝数的影响.结果表明,复合培养基比合成培养基更利于hCG核酸疫苗质粒DNA的生产.通过均匀设计实验确定,当培养基中含有胰蛋白胨10 g·L-1、酵母浸出粉8 g·L-1、NaCl 10 g·L-1、甘油10 g·L-1、KH2PO40.37 g·L-1、K2HPO4 2.01 g·L-1时,单位菌体质粒含量可达6.68 mg·g-1;在此基础上添加乙酸2.0 g·L-1、谷氨酰胺1.2 g·L-1、甘氨酸1.0 g·L-1、天门冬氨酸0.4 g·L-1,可使质粒拷贝数进一步扩增,单位菌体质粒含量可达9.32 mg·g-1,为LB培养基的5.12倍.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2009(026)005【总页数】4页(P46-49)【关键词】DNA疫苗;质粒;拷贝数;培养基;均匀设计实验【作者】王剑;夏杰;陆兵;徐殿胜【作者单位】华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237【正文语种】中文【中图分类】R392目前，质粒DNA作为核酸疫苗和基因治疗剂的载体越来越受到研究者的重视。
质粒DNA作为基因载体比较安全、使用方便，但其在靶细胞中的基因表达效率低、持续时间短，所需剂量大，同时发酵产生的质粒DNA与细胞蛋白、多糖等物质一起以混合物的形式进入下游纯化过程，给分离和纯化工艺带来了很多困难[1,2]。
因此，对于DNA疫苗工程菌的大规模生产而言，一方面要获得较高的菌体密度，另一方面还需要菌体内含有较高的质粒拷贝数，以获得大量高纯度的质粒DNA，减轻后续纯化工艺负担[3]。
大肠杆菌鉴别培养基及菌落特点
大肠杆菌鉴别培养基及菌落特点大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道菌群中的细菌。
它是一种革兰氏阴性、非芽孢杆菌，可以通过合适的培养基进行鉴别和分离。
本文将介绍大肠杆菌的鉴别培养基及菌落特点，并对其进行详细解释。
一、鉴别培养基1. 麦康凯氏培养基（MacConkey agar）：麦康凯氏培养基是一种选择性和区分性培养基，通常用于分离和鉴别肠道革兰氏阴性菌。
它含有麦康凯氏紫（crystal violet）和牛胆盐（bile salts）等抑制革兰氏阳性菌生长的成分，同时含有乳糖和中性红等成分，能够区分能够利用乳糖的细菌和不能利用乳糖的细菌。
大肠杆菌在麦康凯氏培养基上生长良好，形成红色或粉红色的菌落，说明它可以利用乳糖产生酸性代谢产物。
2. EMB培养基（eosin methylene blue agar）：EMB培养基是一种选择性和区分性培养基，常用于分离和鉴定肠道革兰氏阴性菌。
它含有嗜酸染料亚甲蓝（methylene blue）和伊美司粉（eosin Y）等成分，能够抑制革兰氏阳性菌的生长。
大肠杆菌在EMB培养基上形成绿色或金属光泽的菌落，说明它可以产生酸性代谢产物。
3. XLD培养基（xylose lysine deoxycholate agar）：XLD培养基是一种选择性和区分性培养基，主要用于分离和鉴定肠道沙门氏菌属（Salmonella）和伤寒沙门氏菌（Shigella）。
大肠杆菌在XLD培养基上形成黄色的菌落，与其他肠道致病菌如沙门氏菌和伤寒沙门氏菌形成明显的区别。
二、菌落特点大肠杆菌在以上鉴别培养基上的菌落特点如下：1. 麦康凯氏培养基上的大肠杆菌菌落为红色或粉红色，直径约为2-3毫米，呈圆形或不规则形状。
2. EMB培养基上的大肠杆菌菌落为绿色或金属光泽的菌落，直径约为2-3毫米，边缘清晰。
3. XLD培养基上的大肠杆菌菌落为黄色的菌落，直径约为2-3毫米，表面平整。
大肠杆菌工程菌高密度发酵生产L-抗坏血酸-2-葡糖苷酶
大肠杆菌工程菌高密度发酵生产L-抗坏血酸-2-葡糖苷酶余玉奎;桂馨;李平;李敏【摘要】为提高大肠杆菌基因工程菌E.coli-pET21a高密度培养生产L-抗坏血酸-2-葡糖苷酶产量,采用摇瓶培养的方法,通过考察培养液菌体量和酶产量,筛选适用于E.coli-pET21a液体深层发酵的培养基.50 L发酵罐采用适用于工业化大生产的搅拌、供氧、pH控制和过程补料方式,进行液体深层发酵放大培养,大幅度提高酶产量.通过优化发酵过程控制pH和诱导温度,发酵液酶活提高至88 U/mL,达到摇瓶培养的10.1倍.研究结果对大肠杆菌基因工程菌高密度培养,高效表达生物酶有重要的参考价值.【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2018(048)002【总页数】6页(P29-34)【关键词】L-抗坏血酸-2-葡糖苷;维生素C;大肠杆菌;液体深层发酵;诱导剂【作者】余玉奎;桂馨;李平;李敏【作者单位】同济大学生命科学与技术学院,上海200092;同济大学生命科学与技术学院,上海200092;同济大学生命科学与技术学院,上海200092;同济大学生命科学与技术学院,上海200092【正文语种】中文维生素C(英语：Vitamin C，又称L-抗坏血酸)作为酸性药剂、还原剂、抗氧化剂、漂白剂以及化学反应物、食品和饮料中的稳定剂[1]，广泛应用于化妆、保健、医药、食品行业。
在医疗卫生方面，维生素C参与许多新陈代谢过程，具有提高人体免疫力、抗衰老、预防心血管、增加对感冒抵抗力、促进胶原蛋白的合成[2]、抑制癌细胞增殖[3],防治坏血病和传染病、促进创伤愈合等作用，是辅助治疗的保健药品[4]。
在化妆品中，维生素C可作为还原剂、紫外线吸收剂和黑色素形成抑制剂来使用[2]。
具有美白皮肤、预防色斑、抗氧化功效。
由于人体内缺乏古洛糖酸内酯氧化酶，不能自身合成维生素C，必须靠体外摄取[5]。
因此，维生素C被列为人体的必需营养元素，在保护人类健康和生长过程中起到不可替代的重要作用[1]。
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FeCl36H2O 6，ZnSO47H2O 0.58，CaCl 0.2，CuCl22H2O 0.2，MnSO4H2O 0.3，EDTA 0.5
胆固醇氧化酶
胰蛋白胨10，酵母提取物5，KH2PO42，K2HPO44，Na2HPO4·12H2O 7，(NH4)2SO41.2，NH4Cl 0.2，MgSO4·7H2O 1，甘油10，微量元素
100 ml甘油,胰蛋白胨75、酵母粉75
KGF
葡萄糖25，KH2PO413.3，(NH4)2HPO44，MgSO4·7H2O1.2，柠檬酸1.7 g，微量元
素浓缩液10 mL，维生素B14.5 mg
葡萄糖770，MgSO4·7H2O19.7
柠檬酸铁6，MnCl2·4H2O 1.5，Zn(CH3COO)2·2H2O 0.8，H3BO30.3 g，Na2MoO4·2H2O 0.25，CoCl2·6H2O 0.25，CuCl2·2H2O 0.15，EDTA 0.84
普鲁兰酶
环糊精葡糖基转移酶
甘油10，KH2PO410.5，(NH4)2HPO46，柠檬酸1.7，MgSO41.68，微量元素l0 ml，pH7
甘油500，MgSO430
FeSO4·7H2O 10，ZnSO4·7H2O 5.25，CuSO4·5H2O 3，MnSO4·4H2O 0.5，Na2B4O7·10H2O 0.23，CaCl22，(NH4)6Mo7O240.1
水解酶
玉米浆粉30，酵母浸膏20，NaC15，K2HPO44，甘油3
甘油500
L-tryptSO4·7H2O 5，KH2PO42，FeSO4·7H2O 0.1
葡萄糖800
HV-1
葡萄糖40，(NH4)2HPO410，K2SO42，NaCl 0.3，MgSO4·7H2O 2，微量元素10 mL
葡萄糖
FeSO4·7H2O 30，ZnSO4·7H2O 6.8，CuSO4·5H2O 3，MnSO4·4-5H2O 1.52，CaCl2·2H2O 6，Na2B4O7·10H2O 0.68，(NH4)6Mo7O240.3，维生素B12
DAAO
葡萄糖10，酵母粉5，KH2PO47.5，Na2HPO4·12H2O 7.5，MgSO4·7H2O 3，
葡萄糖10，酵母提取物11.5，蛋白胨19.5，(NH4)2SO44，K2HPO4·3H2O 18，KH2PO43，MgSO41.2，微量元素液1 mL
1）葡萄糖600，MgSO4·7H2O 10
2）酵母膏115，蛋白胨195
FeSO4·7H2O 2.8，MnCl2·4H2O 2，CoSO4·7H2O 2.8，CaCl2·2H2O1.5，CuCl2·2H2O 0.2，ZnSO4·7H2O 0.3，溶于1 mol/L HCl
蛋白名称
发酵培养基(g/L)
补料培养基
微量元素
CR1
20%葡萄糖20ml，Na2HPO46，KH2PO43，NaCl0.5，NH4Cl1，酸水解酪蛋白2，酵母粉6，2mMMgCl22ml，微量元素200μl，pH7.5
120 ml甘油，80 g蛋白胨，40 g酵母提取物
M9
GLP-1
胰蛋白胨10，酵母粉10，NaCl 10，甘油2.5，MgSO4·7H2O 0.5，Na2HPO4·12H2O 7，KH2PO42，K2HPO4·3H2O 4，(NH4)2SO41.2，NH4Cl 0.02，微量元素溶液100 mL
微量元素5 mL
葡萄糖500，MgSO4·7H2O 5，微量元素10 mL
FeSO4·7H2O 2，CaCl2·2H2O 13.5，MnSO4·5H2O 0.75，CoCl2·6H2O 0.13，ZnSO4·7H2O 0.75，CuCl2·2H2O 0.13，Na2MoO4·2H2O 0.13
反式_4_羟脯氨酸
葡萄糖10，甘油5，胰蛋白胨8，硫酸铵5，磷酸氢二钾1，氯化钠2，硫酸镁0.2，硫酸亚铁3 mM，氯化钙0.015，L-脯氨酸400 mM
摇瓶
GST-GB2
葡萄糖25，硫酸铵4，十二水磷酸氢二钠16.7，磷酸二氢钾2.7，MgSO40.6，微量元素10 mL
葡萄糖500，MgSO46，硫酸铵24，Amp0.2
hEGF
葡萄糖15，KH2PO413.3，(NH4)2HPO44，MgSO40.6，柠檬酸1.7 g，微量元
素浓缩液10 mL
葡萄糖500，MgSO410，微量元素浓缩液5 mL
EDTA 0.84，MnSO4·H2O 1.28，CuCl2·2H2O 0.15，H3BO30.3 g，Na2MoO4·2H2O 0.25，ZnCl20.8，FeCl36.63，柠檬酸8.57
EDTA0.84，六水氯化钴0.15，一水氯化铜0.15，硼酸0.3，二水钼酸钠0.25，二水乙酸锌1.3，柠檬酸铁10，维生素B10.45
碱性果胶酶
酵母粉24，蛋白胨11，甘油10，K2HPO472 mM，KH2PO417 mM
甘油500，酵母粉50，蛋白胨50
甲醛脱氢酶
葡萄糖8，NH4Cl3.5，Na2HPO47H2O13，KH2PO43，NaCl 0.5，MgSO40.2，微量元素溶液2ml
胰蛋白胨50，酵母提取物50，MgSO4·7H
2O 6，甘油200
High cell density cultivation of
recombinant Escherichia coli for hirudin variant 1 production
环糊精葡糖基转移酶
蛋白胨12，酵母膏24，葡萄糖8，乳糖0.5，K2HPO4·3H2O 16.5，KH2PO42.3，CaCl22.5 mM
高温基因
葡萄糖20，KH2PO46.75，(NH4)2HPO42，柠檬酸0.85，MgSO4·7H2O 0.7，微量元素5 ml
葡萄糖800，MgSO4·7H2O 20
FeSO4·7H2O 10，ZnSO4·7H2O 2.25，CuSO4·5H2O 1，MnSO4·5H2O 0.5，Na2B4O7·10H2O0.23，CaCl2·2H2O2，(NH4)6Mo7O240.1，溶于1.25 mol/L HCl